LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGHIÊN CỨU XÁC LẬP CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ CỐ ĐỊNH NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRONG GEL ALGINATE VÀ TRÊN CELLULOSE VI KHUẨN NHẰM ỨNG DỤNG LÊN MEN RƯỢU VANG NHO

Phần 2: So sánh khả năng lên men rượu vang của nấm men cố định trong gelalginate, nấm men cố định trên cellulose vi khuẩn và nấm men tự do thông qua khảnăng sinh trưởng, sử dụng cơ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

TÔN NỮ MINH NGUYỆT

NGHIÊN CỨU XÁC LẬP CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ

CỐ ĐỊNH NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE

TRONG GEL ALGINATE VÀ TRÊN CELLULOSE VI KHUẨN

NHẰM ỨNG DỤNG LÊN MEN RƯỢU VANG NHO

Chuyên ngành: Chế biến Thực phẩm và Đồ uống

Mã số chuyên ngành: 62540201

Phản biện độc lập 1: GS TS Hoàng Đình Hòa

Phản biện độc lập 2: PGS TS Lý Nguyễn Bình

Phản biện 1: GS TSKH Lưu Duẩn

Phản biện 2: PGS TS Phạm Thu Thủy

Phản biện 3: PGS TS Nguyễn Thúy Hương

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả Các kếtquả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từbất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu

đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu

Tác giả luận án

Tôn Nữ Minh Nguyệt

TÓM TẮT LUẬN ÁN

Với mục đích so sánh khả năng lên men của nấm men cố định trong gel alginate vànấm men cố định trên cellulose vi khuẩn trong quá trình lên men chính sản xuất rượuvang nho, nội dung nghiên cứu của luận án gồm có bốn phần chính

Phần 1: Xác định các thông số thích hợp cho quá trình cố định nấm men trong hạtgel alginate và trên chất mang cellulose vi khuẩn bằng phương pháp quy hoạch thựcnghiệm trực giao hai yếu tố, hàm mục tiêu là hiệu suất cố định tế bào Nguyên liệu sửdụng để làm chất mang đều có nguồn gốc nội địa

Phần 2: So sánh khả năng lên men rượu vang của nấm men cố định trong gelalginate, nấm men cố định trên cellulose vi khuẩn và nấm men tự do thông qua khảnăng sinh trưởng, sử dụng cơ chất và sinh tổng hợp sản phẩm

Phần 3: Nghiên cứu quá trình tái sử dụng của các loại nấm men cố định để lên menrượu vang Việc tái sử dụng nấm men cố định được tiến hành liên tục trong 10 chu kỳlên men Động học quá trình lên men ở một số chu kỳ đã được trình bày chi tiết.Chúng tôi so sánh khả năng tái sử dụng của hai loại nấm men cố định trong gelalginate và trên cellulose vi khuẩn dựa trên thời gian lên men, tốc độ sử dụng đường,tốc độ sinh tổng hợp ethanol, tỷ lệ tế bào thoát khỏi chất mang, độ bền của chất mangqua các chu kỳ tái sử dụng

Phần 4: Thiết lập các phương trình cân bằng vật chất của quá trình lên men chínhtrong sản xuất rượu vang nho với nấm men cố định trên cellulose vi khuẩn, nấm men

cố định trong hạt gel alginate và nấm men tự do

Kết quả nghiên cứu đã khẳng định ưu thế của nấm men cố định so với nấm men tự

do và sự nổi trội của nấm men cố định trên cellulose vi khuẩn trong quá trình lên menvang Cả hai loại nấm men cố định đều có thể tái sử dụng ít nhất 10 chu kỳ và hoạttính lên men của chúng luôn luôn cao hơn so với hoạt tính lên men của nấm men tự do

The objective of this research was to compare the fermentation performance of theimmobilized yeast in alginate gel and the immobilized yeast on bacterial cellulose during theprimary fermentation in wine-making The experimentation consisted of four sections

Section 1 – Determination of technological parameters for yeast immobilization inalginate gel and for yeast immobilization on bacterial cellulose by Face Centered CentralComposite Design with two factors The dependent variable was yield of cell immobilization.The supports like sodium alginate and bacterial cellulose used in this study were originatedfrom our country

Section 2 – Comparison of fermentation ability in wine-making of the immobilized yeast

in alginate gel, the immobilized yeast on bacterial cellulose and the free yeast: Yeast growth,substrate uptake and metabolite production were evaluated and compared

Section 3 – Investigation of the reuse of immobilized yeast in wine fermentation: Thefixed yeast in alginate gel and the fixed yeast on bacterial cellulose were reused for 10 cycles

in the repeated batch fermentation The fermentation kinetics of several cycles were presented

in detail The fermentation performance of the two immobilized yeasts was evaluated andcompared by the fermentation time, sugar uptake rate, ethanol formation rate, level of number

of cells escaped from the support, stability of the support during the reuse

Section 4 – Establishment of stoichiometric equations of the primary fermentation in wine– making for the immobilized yeast in alginate gel, the immobilized yeast on bacterialcellulose and the free yeast

The experimental results showed that the fixed yeast always exhibited higher fermentationperformance than the free yeast in wine-making; the fermentation activities of theimmobilized yeast on bacterial cellulose were better than those of the immobilized yeast inalginate gel Both the two fixed yeasts could be reused at least for 10 cycles in the repeatedbatch fermentation and the fermentation activities of them were always higher than those ofthe free yeast

LỜI CÁM ƠN

Thực hiện và hoàn thành luận án trong một khoảng thời gian khá dài với nhữngkhó khăn chung và riêng, tôi nghĩ rằng mình sẽ không bao giờ làm được nếu như bêncạnh tôi không có những quan tâm và giúp đỡ của thầy cô, gia đình và bạn bè Khôngthể nào kể ra được hết những gì mà tôi đã nhận được khi thực hiện luận án Tôi rấtcảm kích và biết ơn vì tất cả những điều ấy…

Lời cảm ơn trân trọng nhất xin gửi đến PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn, thầy hướng dẫnluận án và cũng là chủ nhiệm bộ môn Công nghệ Thực phẩm Từ những công sức màthầy đã dành cho, tôi cảm nhận sâu sắc câu “không thầy đố mầy làm nên”

Xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thúy Hương đã cho giống vi sinh vật cùng với cáchchuẩn bị chất mang cellulose vi khuẩn để cố định nấm men Những ý kiến đóng gópchân tình của cô đã giúp tôi rất nhiều trong quá trình nghiên cứu

Xin cảm ơn PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa đã cung cấp chất mang alginate sử dụngtrong luận án

Xin cảm ơn các thầy cô, các bạn đồng nghiệp tại bộ môn Công nghệ Thực phẩm đãluôn động viên, góp ý kiến, hỗ trợ và gánh bớt công việc để tôi hoàn thành luận án.Xin cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô Khoa Kỹ thuật Hóa học, phòng Đào tạo SauĐại học, các đơn vị hỗ trợ phân tích: Trung tâm Hóa Dầu, Trung tâm sắc ký Hải Đăng,phòng thí nghiệm Công nghệ cao, Viện Công nghệ Hóa học

Xin cảm ơn sự giúp đỡ của các em sinh viên, học viên trong việc thực hiện cácthực nghiệm, xử lý số liệu kết quả thí nghiệm, công bố các bài báo…

Cuối cùng, xin cảm ơn mẹ và gia đình đã ủng hộ tinh thần và cũng là động lực chotôi cố gắng Hoàn tất luận án, trở thành một TS., không chỉ là mong muốn của cá nhân

mà cũng là sự mong đợi và niềm tự hào của mẹ tôi

Tôi sẽ cất giữ sự biết ơn này trong lòng mãi mãi !

Nghiên cứu sinh

Tôn Nữ Minh Nguyệt

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Nấm men vang 3

1.1.1 Phân loại nấm men vang 3

1.1.2 Quá trình lên men rượu vang 3

1.2 Các phương pháp cố định tế bào nấm men vang 4

1.2.1 Chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào 4

1.2.2 Các phương pháp cố định tế bào nấm men vang 6

1.2.3 Nấm men vang cố định 7

1.3 Cố định nấm men vang trong gel aglinate 8

1.3.1 Alginate 8

1.3.2 Các phương pháp cố định vi sinh vật trong gel alginate 9

1.3.3 Ưu nhược điểm của phương pháp cố định nấm men trong gel alginate 11

1.4 Cố định nấm men vang trên cellulose vi khuẩn 12

1.4.1 Cellulose vi khuẩn 12

1.4.2 Các phương pháp cố định vi sinh vật trên chất mang cellulose vi khuẩn 13 1.4.3 Ưu nhược điểm của phương pháp cố định nấm men trên cellulose vi khuẩn 14

1.5 Ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến quá trình lên men rượu vang 14

1.5.1 Ảnh hưởng của hàm lượng đường 15

1.5.2 Ảnh hưởng của pH 16

1.5.3 Ảnh hưởng của hàm lượng SO2 16

1.5.4 Ảnh hưởng của hàm lượng tannin 17

1.6 Ứng dụng nấm men cố định trong quá trình lên men vang tĩnh nhiều chu kỳ 18 1.7 Những ứng dụng khác của vi sinh vật cố định trong sản xuất rượu vang 20

1.8 Tổng hợp tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng đề tài 21

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Nguyên liệu 24

2.1.1 Nấm men 24

2.1.2 Alginate 24

2.1.3 Cellulose vi khuẩn 25

2.1.4 Nho 25

2.1.5 Các loại hóa chất khác 25

2.2 Nội dung nghiên cứu 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 26

2.3.1 Phương pháp cổ điển 26

2.3.2 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao hai yếu tố 26

2.4 Sơ đồ thí nghiệm 27

2.5 Bố trí thí nghiệm 28

2.5.1 Xác định các điều kiện thích hợp để cố định nấm men vang trong gel alginate 28

2.5.2 Xác định điều kiện thích hợp để cố định nấm men trên cellulose vi khuẩn 30

2.5.3 Khảo sát và so sánh hoạt động của nấm men tự do, nấm men cố định trong gel alginate và trên cellulose vi khuẩn trong quá trình lên men rượu vang 33 2.5.4 Khảo sát và so sánh khả năng tái sử dụng nấm men cố định trong gel alginate và trên cellulose vi khuẩn để lên men rượu vang theo phương pháp tĩnh, nhiều chu kỳ 34

2.5.5 Thiết lập phương trình cân bằng vật chất của quá trình lên men vang sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do 36

2.6 Phương pháp phân tích 37

2.6.1 Phương pháp phân tích vi sinh 37

2.6.2 Phương pháp phân tích hóa lý 38

2.7 Phương pháp xử lý số liệu 39

2.8 Các công thức tính toán 39

2.8.1 Hiệu suất cố định nấm men, H 39

2.8.2 Thời gian lên men,  39

2.8.3 Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại, µmax 40

2.8.4 Tốc độ sử dụng đường trung bình, Ks 40

2.8.5 Tốc độ sinh tổng hợp ethanol trung bình, Kp 40

2.8.6 Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol,  40

2.8.7 Tỷ lệ thành phần nguyên tố của nấm men, cơ chất, sản phẩm lên men 40

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41

3.1 Xác định các điều kiện thích hợp để cố định nấm men trong gel alginate 41

3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố trong quá trình cố định nấm men trong gel alginate bằng quy hoạch cổ điển 41

3.1.2 Xác định các điều kiện thích hợp để cố định nấm men trong gel alginate bằng quy hoạch thực nghiệm 48 3.2 Xác định các điều kiện thích hợp để cố định nấm men trên cellulose vi khuẩn

51

3.2.1 Cố định nấm men trên cellulose vi khuẩn theo phương pháp hấp phụ 51

3.2.2 Cố định nấm men trên cellulose vi khuẩn bằng phương pháp hấp phụ–ủ

58

3.2.3 So sánh hoạt tính lên men của nấm men cố định trên cellulose vi khuẩn sử dụng hai phương pháp cố định: hấp phụ và hấp phụ – ủ 60

3.3 Khảo sát và so sánh hoạt động của nấm men tự do, nấm men cố định trong gel alginate và trên cellulose vi khuẩn trong quá trình lên men rượu vang 62

3.3.1 Khảo sát quá trình sinh trưởng của nấm men tự do và nấm men cố định.62 3.3.2 Khảo sát quá trình chuyển hóa cơ chất của nấm men tự do và nấm men cố định 65

3.3.3 Khảo sát quá trình sinh tổng hợp sản phẩm của nấm men tự do và nấm men cố định 70

3.4 Khảo sát và so sánh khả năng tái sử dụng nấm men cố định trong gel alginate và trên cellulose vi khuẩn để lên men vang theo phương pháp tĩnh, nhiều chu kỳ 77

3.4.1 Khảo sát hiệu quả của giải pháp ngâm hạt gel alginate chứa nấm men cố định trong dung dịch CaCl2 trong quá trình tái sử dụng 77

3.4.2 So sánh khả năng tái sử dụng của nấm men cố định trong gel alginate và trên cellulose vi khuẩn trong quá trình lên men vang theo phương pháp tĩnh, nhiều chu kỳ 84

3.5 Thiết lập phương trình cân bằng vật chất cho quá trình lên men vang sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do 94

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 98

4.1 Kết luận 98

4.2 Kiến nghị 99

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 100

TÀI LIỆU THAM KHẢO 102

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Ứng dụng của nấm men cố định trong sản phẩm thức uống chứa ethanol 5Bảng 1.2 Một số chất mang sử dụng để cố định nấm men trong sản xuất rượu vang 6Bảng 1.3 Các ứng dụng của vi sinh vật cố định trong sản xuất rượu vang 21Bảng 2.1 Thành phần của các dịch nho sau khi ép 26Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng các yếu tố đến hiệu quả cố địnhnấm men trong gel Ca alginate 29

Bảng 2.3 Các chất bổ sung vào dịch nho Red Cardinal để thực hiện quá trình lên men

sử dụng của nấm men cố định trong gel Ca alginate 30Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng các yếu tố đến hiệu quả cố địnhnấm men trên cellulose vi khuẩn 32Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm so sánh khả năng lên men của nấm men tự do và cố địnhtrong quá trình lên men rượu vang 35Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ alginate tới độ cứng của hạt gel alginate chứa nấmmen cố định 43Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ alginate tới tốc độ sinh tổng hợp ethanol (g/L.h) củanấm men cố định trong 5 chu kỳ lên men 43Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ alginate tới tỷ lệ thoát bào (% so với số tế bào banđầu trong hạt gel) trong 5 chu kỳ lên men 43Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ alginate tới tỷ lệ hạt gel alginate bị vỡ (% so với sốhạt ban đầu) trong 5 chu kỳ lên men 44Bảng 3.5 Ảnh hưởng của mật độ tế bào trong huyền phù giống tới độ cứng của hạt gelalginate chứa nấm men cố định 46Bảng 3.6 Ảnh hưởng của mật độ tế bào trong huyền phù giống tới tốc độ sinh tổnghợp ethanol (g/L.h) của nấm men cố định trong 5 chu kỳ lên men 46Bảng 3.7 Ảnh hưởng của mật độ tế bào trong huyền phù giống tới tỷ lệ thoát bào (%

so với số tế bào ban đầu trong hạt gel) trong 5 chu kỳ lên men 46Bảng 3.8 Ảnh hưởng của mật độ tế bào trong huyền phù giống tới tỷ lệ hạt gelalginate bị vỡ (% so với số hạt ban đầu) trong 5 chu kỳ lên men 47Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch CaCl2 tới độ cứng của hạt gel alginatechứa nấm men cố định 48Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch CaCl2 tới tốc độ sinh tổng hợp ethanol(g/L.h) của nấm men cố định trong 5 chu kỳ lên men 48Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch CaCl2 tới tỷ lệ thoát bào (% so với số tếbào ban đầu trong hạt gel) trong 5 chu kỳ lên men 49Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch CaCl2 tới tỷ lệ hạt gel alginate bị vỡ (%

so với số hạt ban đầu) trong 5 chu kỳ lên men 49Bảng 3.13 Ma trận quy hoạch cấu trúc có tâm cấp hai và kết quả thực nghiệm 50Bảng 3.14 Các hệ số của phương trình hồi quy Y1 50Bảng 3.15 Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu trong huyền phù giống đến mật độ tếbào và hiệu suất cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn 52Bảng 3.16 Ảnh hưởng của kích thước chất mang đến mật độ tế bào và hiệu suất cốđịnh trên chất mang cellulose vi khuẩn 53

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của khối lượng chất mang đến mật độ tế bào và hiệu suất cố

định trên chất mang cellulose vi khuẩn 54

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của pH huyền phù giống đến mật độ tế bào và hiệu suất cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn 55

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đảo đến mật độ tế bào và hiệu suất cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn 56

Bảng 3.20 Ảnh hưởng của thời gian hấp phụ nấm men đến mật độ tế bào và hiệu suất cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn 56

Bảng 3.21 Ma trận quy hoạch cấu trúc có tâm cấp hai và kết quả thực nghiệm 58

Bảng 3.22 Các hệ số của phương trình hồi quy Y 58

Bảng 3.23 Biến đổi của mật độ tế bào nấm men cố định theo thời gian ủ 59

Bảng 3.24 Ảnh hưởng của mật độ tế bào cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn đến quá trình lên men vang 62

Bảng 3.25 Sự thay đổi tốc độ sinh trưởng riêng cực đại của nấm men cố định và tự do trong quá trình lên men vang khi hàm lượng đường ban đầu trong dịch nho thay đổi 64 Bảng 3.26 Ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến thời gian lên men vang sử dụng nấm men cố định và nấm men 67

Bảng 3.27 Ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sử dụng đường trung bình của nấm men cố định và tự do trong quá trình lên men vang 68

Bảng 3.28 Ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hàm lượng ethanol trong vang non sử dụng nấm men cố định và tự do 72

Bảng 3.29 Ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp ethanol trung bình trong quá trình lên men vang sử dụng nấm men cố định và tự do 73

Bảng 3.30 Ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hiệu suất sinh tổng hợp ethanol trong quá trình lên men vang sử dụng nấm men cố định và tự do 74

Bảng 3.31 Ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến sự tạo thành các hợp chất hương chính của rượu vang non sau quá trình lên men vang sử dụng nấm men cố định và tự do 77

Bảng 3.32 Thời gian lên men (h) của nấm men cố định trong gel alginate trong quá trình tái sử dụng 79

Bảng 3.33 Hàm lượng ethanol trong vang non (%v/v) sau mỗi chu kì lên men của nấm men cố định trong gel alginate 83

Bảng 3.34 Hàm lượng các hợp chất hương trong vang non ở các chu kỳ 1,3,5,7,10 .94 Bảng 3.35 Tỷ lệ cơ chất đã được nấm men sử dụng và hàm lượng sản phẩm do nấm men sinh ra trong vang non khi lên men vang sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do 96

Bảng 3.36 Công thức phân tử của các thành phần trong dịch lên men và vang non khi lên men vang sử dụng nấm men cố định trên cellulose vi khuẩn, trong gel alginate và nấm men tự do 96

Bảng 3.37 Số mol cơ chất hoặc sản phẩm tính theo 1mol đường lên men trong quá trình lên men vang sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do 97

Bảng 3.38 Hiệu suất tổng hợp sinh khối và sản phẩm (% tính theo đường lên men) trong quá trình lên men vang sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do 98

MỤC LỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của alginate 10

Hình 1.2 Sự hình thành gel của alginate với ion Ca2+ .10

Hình 1.3 Cơ chế tạo gel của alginate từ bên ngoài (trái) từ bên trong (phải) 11

Hình 1.4 Cấu trúc cellulose vi khuẩn (trái) và cellulose thực vật (phải) 13

Hình 1.5 Cấu trúc cellulose vi khuẩn I (trái) và cấu trúc cellulose vi khuẩn II (phải) 13 Hình 3.1 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ dung dịch alginate tới hiệu suất cố định nấm men trong gel alginate 42

Hình 3.2 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men trong huyền phù giống tới hiệu suất cố định nấm men trong gel alginate 45

Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ dung dịch CaCl2 tới hiệu suất cố định nấm men trong gel alginate 48

Hình 3.4 Ảnh hưởng của mật độ tế bào trong huyền phù giống và nồng độ dung dịch alginate đến hiệu suất cố định nấm men trong gel alginate 51

Hình 3.5 Hình chụp SEM hạt gel alginate sau khi cố định tế bào nấm men 51

Hình 3.6 Ảnh hưởng của mật độ tế bào trong huyền phù giống và thời gian hấp phụ đến hiệu suất cố định nấm men trên cellulose vi khuẩn 59

Hình 3.7 Hình chụp SEM chất mang cellulose vi khuẩn sau khi cố định bằng phương pháp hấp phụ 60

Hình 3.8 Hình chụp SEM chất mang cellulose vi khuẩn sau khi cố định bằng phương pháp hấp phụ-ủ, thời gian ủ 2 ngày 60

Hình 3.9 Hình chụp SEM chất mang cellulose vi khuẩn cố định bằng phương pháp hấp phụ-ủ sau quá trình lên men vang (thời gian ủ là 2 ngày) 62

Hình 3.10 Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men cố định và tự do trong quá trình lên men vang khi hàm lượng đường ban đầu trong dịch nho thay đổi 63

Hình 3.11 Sự thay đổi tốc độ sinh trưởng riêng của nấm men cố định và tự do trong quá trình lên men vang khi hàm lượng đường ban đầu trong dịch nho thay đổi 64

Hình 3.12 Sự thay đổi hàm lượng đường trong quá trình lên men vang sử dụng nấm men cố định và tự do khi hàm lượng đường ban đầu trong dịch nho thay đổi 66

Hình 3.13 Sự thay đổi hàm lượng nitơ amin tự do trong quá trình lên men vang sử dụng nấm men cố định và tự do khi hàm lượng đường ban đầu trong dịch nho thay đổi 69

Hình 3.14 Sự thay đổi hàm lượng nitơ ammonium trong quá trình lên men vang sử dụng nấm men cố định và tự do khi hàm lượng đường ban đầu trong dịch nho thay đổi 71

Hình 3.15 Sự thay đổi hàm lượng ethanol trong quá trình lên men vang sử dụng nấm men cố định và tự do khi hàm lượng đường ban đầu trong dịch nho thay đổi 72

Hình 3.16 Sự thay đổi hàm lượng acid tổng trong quá trình lên men vang sử dụng nấm men cố định và tự do khi hàm lượng đường ban đầu trong dịch nho thay đổi 75

Hình 3.17 Sự thay đổi hàm lượng acid dễ bay hơi trong quá trình lên men vang sử dụng nấm men cố định và tự do khi hàm lượng đường ban đầu trong dịch nho thay đổi 76

Hình 3.18 Tỷ lệ nấm men thoát ra khỏi hạt gel alginate so với tổng số nấm men trong dịch lên men qua các chu kỳ tái sử dụng 81

Hình 3.19 Hình chụp SEM hạt gel alginate chứa nấm men cố định trước khi lên menchu kỳ 1 81Hình 3.20 Hình chụp SEM hạt gel alginate chứa nấm men cố định trong trường hợpkhông ngâm hạt trong dung dịch CaCl2 trước khi lên men chu kỳ 7 82Hình 3.21 Hình chụp SEM hạt gel alginate chứa nấm men cố định trong trường hợp

có ngâm trong dung dịch CaCl2 trước khi lên men chu kỳ 7 82Hình 3.22 Tốc độ sinh tổng hợp ethanol trung bình của nấm men cố định trong gelalginate qua các chu kỳ tái sử dụng 83Hình 3.23 Sự biến đổi pH của vang non khi tái sử dụng nấm men cố định trong gelalginate 84Hình 3.24 Sự thay đổi mật độ tế bào trong canh trường sử dụng nấm men cố định ởcác chu kỳ tái sử dụng thứ 1, 3, 5, 7, 10 85Hình 3.25 Tỷ lệ tế bào nấm men thoát khỏi chất mang so với tổng số nấm men trongdịch lên men qua các chu kỳ tái sử dụng 86Hình 3.26 Tốc độ sinh trưởng trung bình của nấm men cố định ở các chu kỳ tái sửdụng thứ 1, 3, 5, 7, 10 87Hình 3.27 Hình chụp SEM bề mặt hạt gel alginate (trái) và miếng cellulose vi khuẩn(phải) trước khi lên men chu kỳ 1 88Hình 3.28 Hình chụp SEM bề mặt hạt gel alginate (trái) và miếng cellulose vi khuẩn(phải) trước khi lên men chu kỳ 7 88Hình 3.29 Hình chụp SEM mặt cắt hạt gel alginate (trái) và mặt cắt miếng cellulose vikhuẩn (phải) trước khi lên men chu kỳ 7 88Hình 3.30 Sự thay đổi hàm lượng đường trong quá trình lên men vang của nấm men

cố định ở các chu kỳ tái sử dụng thứ 1,3,5,7,10 89Hình 3.31 Thời gian lên men của nấm men cố định ở các chu kỳ tái sử dụng 90Hình 3.32 Tốc độ sử dụng đường trung bình của nấm men cố định qua các chu kỳ táisử dụng 91Hình 3.33 Sự thay đổi hàm lượng ethanol trong quá trình lên men vang của nấm men

cố định trong quá trình lên men vang ở các chu kỳ tái sử dụng thứ 1,3,5,7,10 92Hình 3.34 Hàm lượng ethanol trong vang non sau quá trình lên men chính sử dụngnấm men cố định qua các chu kỳ tái sử dụng 92Hình 3.35 Tốc độ sinh tổng hợp ethanol trung bình của nấm men cố định trong quátrình lên men vang qua các chu kỳ tái sử dụng 93Hình 3.36 Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol trung bình của nấm men cố định trong quátrình lên men vang qua các chu kỳ tái sử dụng 94

DANH MỤC MỘT SỐ THUẬT NGỮ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DEAE-cellulose : Diethylaminoethyl-cellulose

dịch CaCl2 sau mỗi chu kỳ tái sử dụng

CaCl2 sau mỗi chu kỳ tái sử dụng

-xiii-MỞ ĐẦU

Rượu vang là một thức uống lên men từ dịch nho sử dụng nấm men

Saccharomyces cerevisiae [ CITATION Rib06 \l 1033 ]1,[ CITATION Rib061 \l 1033

]2 Rượu vang được nhiều người ưa thích do hương vị hết sức đặc trưng và những tác

dụng có lợi cho sức khỏe [CITATION Lum98 \l 1033 ]3,[CITATION Jac08 \l 1033 ]4.Yếu tố quyết định chất lượng của một sản phẩm rượu vang, bên cạnh nguyên liệunho, là giống nấm men Giống nấm men được xem là mấu chốt công nghệ để tạo ranhững loại rượu vang có chất lượng khác nhau Những chủng nấm men vang thuộc

loài Saccharomyces cerevisiae đã được phân lập từ nho trong quá trình lên men rượu

vang tự nhiên và được cấy chuyền lưu giữ để phục vụ cho ngành công nghiệp rượuvang Hiện nay, hầu hết các nhà máy sản xuất rượu vang, bao gồm những nhà máy ở

Việt Nam, vẫn sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae dạng tự do để lên men

rượu vang Mặc dù chất lượng sản phẩm đã ổn định hơn so với rượu vang lên men tựnhiên, nhưng việc sử dụng nấm men tự do để lên men rượu vang vẫn còn khá nhiềunhược điểm Đặc biệt khi tiến hành lên men trong những điều kiện không thuận lợi thì

sự sinh trưởng cũng như khả năng sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi chất của nấm men

tự do bị ức chế rõ rệt [CITATION Ots80 \l 1033 ]5, [ CITATION Bou96 \l 1033 ]6,[CITATION Bou98 \l 1033 ]7

Một trong những giải pháp để khắc phục các nhược điểm trên là sử dụng nấm men

cố định Các nghiên cứu về sử dụng nấm men cố định trong sản xuất rượu vang đềucho thấy nấm men cố định có nhiều ưu điểm hơn hẳn so với nấm men tự do[ CITATION Ban82 \l 1033 ]8, [CITATION MGu06 \l 1033 ]9 Ngoài ra, khả năngtái sử dụng của nấm men cố định còn đem lại nhiều lợi ích về mặt kinh tế vì chi phísản xuất giảm

Để cố định nấm men lên men rượu vang, phương pháp keo tụ tế bào tỏ ra khôngthích hợp vì những tế bào nằm tại vùng tâm của khối keo tụ khó tiếp xúc với cơ chất[CITATION Kli83 \l 1033 ]10, [ CITATION Kur11 \l 1033 ]11; phương pháp nhốt tếbào bằng màng membrane hay vi bao cũng ít được sử dụng vì membrane dễ bị tắtnghẹt bởi các chất keo có trong dịch nho [ CITATION Leb98 \l 1033 ]12 Đối vớiphương pháp nhốt tế bào trong cấu trúc gel, nhiều loại chất mang đã được sử dụng như

-xiv-alginate [CITATION Mag89 \l 1033 ]13, [ CITATION Hil90 \l 1033 ]14, agar[ CITATION Nig98 \l 1033 ]15, gelatin [ CITATION Par92 \l 1033 ]16, -carrageenan [ CITATION Tan89 \l 1033 ]17, polyacrylamide [CITATION Fre84 \l

1033 ]18, polystyrene [CITATION Cla12 \l 1033 ]19 Alginate là vật liệu được sửdụng phổ biến nhất; hơn 80% các nghiên cứu về cố định tế bào trên thế giới đã sửdụng alginate Chế phẩm nấm men cố định trong gel alginate đã được thương mại hóa

và được ứng dụng trong quy trình sản xuất rượu vang ở quy mô lớn

Nấm men cố định bằng phương pháp hấp phụ trên bề mặt chất mang xốp nhưkissiris [CITATION Bak92 \l 1033 ]20, [CITATION Bak97 \l 1033 ]21, vải cotton[CITATION Pet11 \l 1033 ]22, mẫu thủy tinh xốp [CITATION Nav77 \l 1033 ]23,ceramic [CITATION Dem92 \l 1033 ]24, [ CITATION Rap11 \l 1033 ]25, hay trênchất mang giàu cellulose như bã mía [ CITATION YuJ10 \l 1033 ]26, miếng trái cây[ CITATION YKo01 \l 1033 ]27… cũng được ứng dụng để lên men rượu vang Trongvài năm gần đây, có hai công bố khoa học về việc sử dụng cellulose vi khuẩn làm chấtmang cố định nấm men để ứng dụng trong quá trình lên men sản xuất rượu vang vàethanol [ CITATION Ngu08 \l 1033 ]28, [ CITATION Yao11 \l 1033 ]29 Tuy nhiên,đến nay vẫn chưa có các nghiên cứu chuyên sâu về nấm men vang cố định trên chấtmang cellulose vi khuẩn Chất mang cellulose vi khuẩn và chế phẩm tế bào cố địnhtrên cellulose vi khuẩn vẫn chưa được thương mại hóa ở thị trường trong và ngoàinước

Với những phân tích như trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xác lập các

điều kiện thích hợp để cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trong gel

alginate và trên cellulose vi khuẩn nhằm ứng dụng lên men rượu vang nho ”.

Chúng tôi sẽ tiến hành nghiên cứu một cách hệ thống về khả năng sử dụng nấm mennhốt trong gel alginate và nấm men hấp phụ trên cellulose vi khuẩn trong quá trình lênmen chính rượu vang nho Mục đích của nghiên cứu là so sánh hiệu quả sử dụng haichế phẩm nấm men vang cố định, trong đó có một chất mang đã được sử dụng phổbiến (alginate) và một chất mang mới (cellulose vi khuẩn) Kế thừa kết quả đã công bốcủa một số nhà khoa học trong nước, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chấtmang alginate và cellulose vi khuẩn có nguồn gốc tại Việt nam

-xv-Trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi tìm điều kiện thích hợp để cố định nấmmen vang trên hai loại chất mang alginate và cellulose vi khuẩn, so sánh khả năng lênmen rượu vang của nấm men cố định trên hai loại chất mang cùng với nấm men tự do,

so sánh khả năng tái sử dụng của nấm men cố định và thiết lập phương trình cân bằngvật chất cho quá trình lên men chính rượu vang nho cho cả hai loại nấm men cố định

và nấm men tự do

-xvi-Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Nấm men vang

1.1.1 Phân loại nấm men vang

Nấm men vang có thể được chia thành hai nhóm là Saccharomyces và nấm men

bản địa

Saccharomyces cerevisiae là loài nấm men chủ lực thực hiện quá trình lên men

ethanol trong sản xuất rượu vang Chính vì thế, Saccharomyces cerevisiae còn được

gọi là “nấm men vang” [ CITATION Rib06 \l 1033 ]1, [ CITATION Rib061 \l

1033 ]2, [ CITATION Fug07 \l 1033 ]30

Nấm men bản địa bao gồm một số giống nấm men khác trong dịch nho lên men

như Kloeckera, Metschnikowia, Torulaspora, Hanseniaspora, Zygosaccharomyces,

Candida, Pichia, Cryptococcus Hầu hết các loài thuộc nấm men bản địa không có khả

năng tồn tại khi nồng độ ethanol cao hơn 6%v/v, ngoại trừ Brettanomyces bruxellensis

có thể phát triển trong môi trường có nồng độ ethanol lên đến 12% Trước đây, nấmmen bản địa được xem là các vi sinh vật gây hư hỏng rượu vang Tuy nhiên, nhữngnghiên cứu gần đây cho thấy rằng, một số loài nấm men bản địa có lợi cho chất lượngsản phẩm, làm đa dạng hóa hương vị của rượu vang [ CITATION Ots80 \l 1033 ]5,[ CITATION Egg06 \l 1033 ]31

1.1.2 Quá trình lên men rượu vang

Lên men rượu vang tự nhiên là quá trình lên men vang xảy ra tự nhiên mà không

cần cấy giống Thường thì các giống nấm men bản địa như Kloeckera, Hanseniaspora

và Candida chiếm tỷ lệ cao trong giai đoạn đầu của quá trình lên men Ở giai đoạn tiếp theo, Pichia và Metschnikowia chiếm ưu thế Ở giai đoạn lên men cuối cùng, chỉ còn lại Saccharomyces cerevisiae tồn tại nhờ khả năng chịu được nồng độ ethanol cao Các giống nấm men khác như Torulaspora, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces,

Zygosaccharomyces, Brettanomyces cũng có thể sống sót trong quá trình lên men và là

nguyên nhân gây nên những “khuyết tật” liên quan đến giá trị cảm quan của sản phẩm

-xvii-[ CITATION Lum98 \l 1033 ]3, -xvii-[ CITATION Bou98 \l 1033 ]7, -xvii-[CITATION Lin04 \l

1033 ]32

Lên men rượu vang nhân tạo bao gồm quá trình xử lý dịch nho bằng SO2, nhằmhạn chế sự phát triển không mong muốn của một số loài nấm men bản địa, và chủ

động cấy giống Saccharomyces cerevisiae để khởi đầu quá trình lên men Nhờ vậy,

quá trình lên men vang diễn ra nhanh hơn, an toàn hơn và có thể tạo ra rượu vang vớihương vị đặc trưng ổn định Tuy nhiên, một số ít phân xưởng sản xuất vang ở quy mônhỏ vẫn sử dụng phương pháp lên men tự nhiên vì quy trình đơn giản mặc dù chấtlượng sản phẩm kém ổn định [ CITATION Bou96 \l 1033 ]6, [ CITATION Fug07 \l

1033 ]30

1.2 Các phương pháp cố định tế bào nấm men vang

Kỹ thuật cố định tế bào nấm men được ứng dụng trong ngành công nghiệp thứcuống lên men như rượu vang nho, vang táo, bia và nước trái cây lên men có nồng độethanol thấp Mục đích chính của việc sử dụng nấm men cố định là để rút ngắn thờigian lên men, tái sử dụng nấm men và ổn định chất lượng sản phẩm Bảng 1.1 tóm tắtmột số ứng dụng của nấm men cố định trong sản xuất thức uống chứa ethanol

Bảng 1.1 Ứng dụng của nấm men cố định trong sản phẩm thức uống chứa ethanol

S cerevisiea

DEAE-cellulose Khoáng kissiris Lommi H et al., 1990[ CITATION Lom90 \l

Kou04 \l 1033 ]46 Bia nồng độ cao S cerevisiae Ca-alginate Tran Q H., et al., 2008

[ CITATION Tra08 \l

1033 ]47

1.2.1 Chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào

Chất mang vô cơ: chúng có độ bền cơ học và hóa học cao Tuy nhiên sản phẩm lên

men thu được thường bị lẫn các tạp chất có xuất xứ từ chất mang Chất mang vô cơthường gặp là hạt thủy tinh, ceramic dạng khối trụ hay dạng hạt, các kissiris khoáng,gamma-alumina…

Chất mang hữu cơ: chúng không làm cho sản phẩm lên men bị lẫn tạp chất, bền

nhiệt và tương đối ổn định về mặt hóa học trong điều kiện lên men Chất mang hữu cơ

cố định nấm men bao gồm các polymer tổng hợp như gel polyvinylalcohol,polyvinylchloride, màng polyethylene, các chất mang tự nhiên bản chất polysaccharide

-xix-như agar, alginate, chitosan, pectin, carrageenan, dẫn xuất diethylaminoethylen củacellulose (DEAE-cellulose), cellulose đã tách lignin (Delignified cellulose), cellulose

vi khuẩn (Bacterial cellulose), hạt lúa mì, lúa mạch, các miếng trái cây như miếng táo,

lê, mộc qua, quince, sung, nho… một số loại phế liệu như bã malt, bã mía, lõi bắp, vỏnho, bã nho ép, vỏ dưa hấu… và các chất mang tự nhiên bản chất protein như gelatin,viên gluten (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Một số chất mang sử dụng để cố định nấm men trong sản xuất rượu vang

Chất mang

vơ cơ

Montmorilonite, polygorskite Ageeva N.M et al., 1985 [ CITATION Age85 \l

1033 ]48

1033 ]20, [ CITATION Bak97 \l 1033 ]21;

Argiriou T et al.,1996[ CITATION Arg96 \l

1033 ]50;Loukatos P et al., 2003 [ CITATION Lou03 \l 1033 ]51

1033 ]21; Loukatos P et al., 2000[ CITATION Lou00 \l 1033 ]36;Galanakis M.C et al., 2012

[ CITATION Gal12 \l 1033 ]52 Hydroxyapatite ceramics Rapoport A., et al.,2011 [ CITATION Rap11 \l

1033 ]25 Chất mang

hữu cơ

1033 ]53;Gòdia F et al.,1991 [ CITATION Gò91 \l 1033 ]54

Acid pectic, agar Nakanishi K et al.,1987 [ CITATION Nak87 \l 1033

]53

M.D et al.,1987,1988,1989[ CITATION Fum89 \l

1033 ]56,[ CITATION Fum88 \l 1033 ]57,

[ CITATION Fum87 \l 1033 ]58;Rosini G et

al.,1993[ CITATION Ros93 \l 1033 ]59, Yokotsuka

K et al.,1993,1997,2003[ CITATION Yok93 \l 1033]60,[ CITATION Yok97 \l 1033 ]61,

[ CITATION Yok03 \l 1033 ]62;Busova K et

al.,1994[ CITATION Bus94 \l 1033 ]34; Suzzi G et

al.,1996[ CITATION Suz96 \l 1033 ]63; Bakoyianis

V et al.,1997 [ CITATION Bak97 \l 1033 ]21;

Ferraro L et al.,2000[ CITATION 65F00 \l

1033 ]35; Silva S et al., 2002,2003[ CITATION Sil02 \l 1033 ]64,[ CITATION Sil03 \l 1033 ]65; Kassim H.C., 2012 [ CITATION Kas12 \l 1033 ]39 Cellulose vi khuẩn Nguyen T.H et al., 2008 [ CITATION Ngu08 \l

-xx-1033 ]28; Yao W et al., 2011 [ CITATION Yao11 \l

1033 ]29 Cellulose đã tách lignin Bardi E.P et al.,1996[ CITATION EPB96 \l

1033 ]66; Balli D et al., 2003[ CITATION Bal03 \l

1033 ]67; Loukatos P et al., 2003[ CITATION Lou03 \l 1033 ]51; Mallouchos A et al., 2003

Iconomopoulou M et al., 2002[ CITATION MIc02 \l

1033 ]70; Plessas S et al., 2005 [ CITATION SPl05 \

l 1033 ]71 Polyvinyl alcohol Martynenko N.N et al., 2004 [ CITATION NNM04 \l

1033 ]72

1033 ]19

Miếng mộc qua Kourkoutas Y et al., 2002,2003,2005 [ CITATION

YKo02 \l 1033 ]74,[ CITATION YKo03 \l 1033]75, [ CITATION YKo05 \l 1033 ]76

YKo01 \l 1033 ]27,[ CITATION YKo021 \l

1033 ]37, [ CITATION Kan12 \l 1033 ]82

Củ cải đường Vucurovic M.V et al., 2012 [ CITATION Ves12 \l

1033 ]83

AMa02 \l 1033 ]84, [ CITATION ATH03 \l

1033 ]85

1033 ]86

]87 Thân, gốc cây bắp Vucurovic M.V et al., 2008[ CITATION VES08 \l

1033 ]88; Razmovski R et al., 2012 [ CITATION Raz12 \l 1033 ]89

-xxi-Nội nhũ hạt Kopsahelis N et al., 2007 [ CITATION Nik07 \l

1033 ]90 Chất mang

kết hợp

Đĩa thủy tinh phủ alginate Ogbonna J.C et al.,1989 [ CITATION Ogb89 \l 1033

]91

1.2.2 Các phương pháp cố định tế bào nấm men vang

Cố định tế bào bằng cách gắn trên bề mặt chất mang rắn: Tế bào nấm men có thể kết

dính trên bề mặt chất mang rắn nhờ những tương tác vật lý như lực mao quản, liên kếttĩnh điện, liên kết ion, liên kết kỵ nước, hoặc liên kết cộng hóa trị Phương pháp nàyyêu cầu bề mặt chất mang phải có cấu trúc xốp hoặc có chứa nhiều nhóm chức hóa họckhác nhau như hạt thủy tinh xốp, thanh ceramic, DEAE-cellulose, bã mía, hạt gluten,miếng trái cây [ CITATION Nav77 \l 1033 ]23, [ CITATION Rap11 \l 1033 ]25,[ CITATION YuJ10 \l 1033 ]26, [ CITATION Lom90 \l 1033 ]33,[ CITATION MIc02

\l 1033 ]70, [ CITATION LVA06 \l 1033 ]81

Cố định tế bào bằng cách nhốt trong khung mạng xốp: Các tế bào được đưa vào bên

trong một khung mạng xốp để ngăn cản tế bào khuếch tán ra môi trường xung quanhnhưng vẫn cho phép tế bào hấp thu các chất dinh dưỡng và trao đổi chất Chất mangthường là các loại polysaccharide (alginate, -carrageenan, agar, chitosan, pectin),protein (gelatin, collagen), polymer tổng hợp (polyacrylamide, polyvinylalcohol,polyurethane, polyvinylchloride, polystyrene) Chất mang thường có cấu trúc khungmạng gel (ion gel, covalent gel, non-covalent gel, cryogel) [ CITATION Kas12 \l 1033]39, [ CITATION Kou04 \l 1033 ]46, [ CITATION NNM04 \l 1033 ]72, [ CITATIONTak11 \l 1033 ]92, [ CITATION SFD86 \l 1033 ]93, [ CITATION Placeholder3 \l

1033 ]94

Cố định tế bào bằng cách keo tụ: Các tế bào nấm men S cerevisiae có khả năng tự

bám chặt với nhau và hình thành nên khối bao gồm hàng ngàn tế bào nhờ các tươngtác vật lý hay hóa học Có 2 kiểu keo tụ tế bào: keo tụ tự nhiên (không sử dụng hóachất) và keo tụ nhân tạo (sử dụng hóa chất để tạo liên kết giữa các tế bào) Phươngpháp cố định này ít sử dụng cho nấm men vang vì các tế bào ở bên trong khối nấmmen khó tiếp xúc với các chất dinh dưỡng có trong canh trường[ CITATION Kou04 \l

1033 ]46

Cố định tế bào bằng cách nhốt bên trong một màng chắn: Sự khuếch tán của tế bào ra

môi trường bên ngoài được ngăn chặn bằng cách bao bọc chúng vào trong các

-xxii-membrane nhưng vẫn đảm bảo quá trình trao đổi chất giữa chúng với môi trường.Chất mang là sợi thủy tinh, nylon và một số màng bán thấm khác như polyvinylchloride, cellulose acetate, polyamide Phương pháp này ít được sử dụng cho nấm menvang vì các membrane dễ bị nghẹt bởi các hợp chất keo trong dịch nho khi thực hiệnquá trình lên men vang [ CITATION Yao11 \l 1033 ]29, [46], [ CITATION Soo93 \l

1033 ]95, [ CITATION Tak02 \l 1033 ]96, [ CITATION SEK04 \l 1033 ]97,[ CITATION Raf05 \l 1033 ]98, [ CITATION Raf06 \l 1033 ]99

1.2.3 Nấm men vang cố định

1.2.3.1 Những thay đổi về đặc điểm sinh học của nấm men cố định

Việc cố định tế bào sẽ làm thay đổi hình thái, sinh lý và các hoạt động trao đổi chấtcủa nấm men[ CITATION Kou04 \l 1033 ] 46, [ CITATION Jor \l 1033 ] 100.

Khả năng sinh trưởng: Nấm men cố định thường có khả năng sinh trưởng kém

hơn so với nấm men tự do vì khả năng hấp thu oxygiảm Tế bào nấm men cố định cóhình dạng và kích thước không đồng đều Nhiều nghiên cứu cho thấy nấm men cố địnhsinh trưởng đến một giới hạn nhất định và giữ nguyên lượng sinh khối cho đến khi kếtthúc quá trình lên men [ CITATION Dor86 \l 1033 ] 101, [ CITATION Mit80 \l

1033 ] 102, [ CITATION Kar94 \l 1033 ] 103.

Hoạt động trao đổi chất: Nấm men cố định có tốc độ sử dụng glucose, tốc độ sinh

tổng hợp ethanol và glycerol cao hơn nhiều so với nấm men tự do vì nấm men khiđược cố định trên chất mang sẽ có những thay đổi về đặc tính sinh lý, hoạt tính

1033 ] 21, [ CITATION Jor \l 1033 ] 100, [ CITATION Gal90 \l 1033 ] 104, [ CITATION Mar032 \l 1033 ] 105.

Khả năng lên men trước những biến đổi bất lợi trong quá trình lên men: Nấm

men cố định có khả năng chịu được sự ức chế của cơ chất và sản phẩm trao đổi chấtcao hơn nấm men tự do [ CITATION Mar81 \l 1033 ] 106, [ CITATION AMV89 \l

1033 ] 107, [ CITATION Sza97 \l 1033 ] 108, [ CITATION Des02 \l 1033 ] 109 Ở những

điều kiện lên men cực đoan thì nấm men cố định cũng thể hiện ưu thế do chất mang đãbảo vệ tế bào trước các tác động bất lợi của dịch lên men [ CITATION Hoh03 \l

1033 ] 110, [ CITATION Cau01 \l 1033 ] 111, [ CITATION Gas00 \l 1033 ] 112,

-xxiii-[ CITATION Ser10 \l 1033 ] 113, [ CITATION Cho92 \l 1033 ] 114, [ CITATION Bre94 \

l 1033 ] 115, [ CITATION Mar99 \l 1033 ] 116, [ CITATION Ale01 \l 1033 ] 117, [ CITATION Oga00 \l 1033 ] 118, [ CITATION Kuh01 \l 1033 ] 119, [ CITATION Xia08 \l 1033 ] 120, [ CITATION Yal01 \l 1033 ] 121, [ CITATION Jar00 \l 1033 ] 122.

Sự tạo thành hợp chất hương: So với nấm men tự do, nhìn chung nấm men cố

định tạo thành nhiều ester hơn, tạo thành ít diacetyl, acetaldehyde, methanol, acid dễbay hơi và rượu bậc cao hơn Loại chất mang, phương pháp cố định cũng có ảnhhưởng đến khả năng tạo thành hợp chất hương và các sản phẩm phụ khác[ CITATION Kou04 \l 1033 ] 46, [ CITATION Ath03 \l 1033 ] 85, [ CITATION EDU03 \l 1033 ] 123, [ CITATION Gui04 \l 1033 ] 124, [ CITATION Mal03 \l 1033 ] 125, [ CITATION JJM01

\l 1033 ] 126, [ CITATION Inf02 \l 1033 ] 127

1.2.3.2 Ưu thế của nấm men cố định trong quá trình lên men vang

Việc sử dụng tế bào nấm men cố định để lên men vang có nhiều thuận lợi Chấtmang đóng vai trò tác nhân bảo vệ tế bào trước những tác động bất lợi từ môi trườnglên men như sự thay đổi về nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất ban đầu và sản phẩm cuối,

từ đó làm ổn định và kéo dài hoạt tính lên men Quá trình trao đổi chất của tế bào cốđịnh biến đổi theo chiều hướng tăng hiệu quả sử dụng cơ chất, sản phẩm được tạo ranhiều hơn Mật độ tế bào nấm men cố định trên một đơn vị thể tích canh trường caonên làm giảm thời gian lên men [ CITATION Kou04 \l 1033 ]46, [ CITATIONDes02 \l 1033 ]109, [ CITATION Gas00 \l 1033 ]112, [ CITATION Jar00 \l

1033 ]122

Khi sử dụng nấm men cố định để lên men vang, quá trình tách nấm men ra khỏidịch lên men được thực hiện nhanh và dễ dàng, từ đó làm giảm chi phí cho việc thuhồi sản phẩm [ CITATION LVA06 \l 1033 ]81, [ CITATION AMa02 \l 1033 ]84.Nấm men cố định có thể tái sử dụng được nhiều chu kỳ và có nhiều khả năng ứngdụng trong quy trình lên men liên tục ở quy mô công nghiệp, từ đó mang lại hiệu quảkinh tế cao [ CITATION Bak97 \l 1033 ]21,[ CITATION Mit80 \l 1033 ]102

Tuy vậy, sử dụng nấm men cố định cũng còn một số hạn chế khi hiện tượng tế bàothoát ra khỏi chất mang quá nhiều, cấu trúc chất mang bị phá hủy trong quá trình sửdụng, sự khuếch tán cơ chất đến tế bào ở trung tâm của khối chất mang bị hạn chế[ CITATION Kou04 \l 1033 ]46, [ CITATION Ban821 \l 1033 ]128

-xxiv-1.3 Cố định nấm men vang trong gel aglinate

1.3.1 Alginate

Alginate hay algin là tên gọi thường được sử dụng cho muối alginic acid Alginate

hiện diện trong thành tế bào của các loài rong nâu (Phaeophyceae), chiếm đến 40%

khối lượng chất khô và thường ở dạng muối alginate của calcium, magnesium vàsodium Mặc dù có một vài nguồn gốc khác nhau, tuy nhiên tất cả các alginate thươngmại hiện nay đều có nguồn gốc từ rong biển và dạng Ca alginate là thích hợp nhất đểtạo khung mạng gel cố định nấm men để lên men rượu vang [ CITATION DrK05 \l

1033 ] 129

1.3.1.1 Đặc điểm cấu tạo của alginate

Alginate là một copolymer không phân nhánh, bao gồm các monomer mannuronic acid (M) và -L-guluronic acid (G) liên kết với nhau thông qua liên kết1,4-glycoside Các monomer này phân bố trong mạch alginate theo các block

-D-Tỷ lệ của mannuronic acid và guluronic acid (M/G) của alginate từ rong biển daođộng trong một khoảng rộng tùy theo loài rong và mùa thu hoạch Tỷ lệ này ảnhhưởng đến độ bền gel Ca alginate [ CITATION DrK05 \l 1033 ] 129, [ CITATION Koz94 \l 1033 ] 130, [ CITATION Sim03 \l 1033 ] 131.

Hình 1.1 Cấu trúc của alginate [ CITATION DrK05 \l 1033 ]129

(a-các monomer của alginate; b-chuỗi alginate; c-sự phân bố các block)

1.3.1.2 Cơ chế tạo gel của alginate

Alginate có khả năng kết hợp với các cation kim loại hóa trị cao để tạo gel Ái lựccủa alginate đối với các ion hóa trị 2 giảm theo trình tự: Pb2+ - Cu2+ - Cd2+ - Ba2+ - Sr2+

- Ca2+ - Co2+ - Ni2+ - Zn2+ - Mn2+ Tùy thuộc vào loại ion liên kết và nguồn gốcalginate mà gel tạo thành có tính chất khác nhau Thông thường, người ta thường sử

-xxv-dụng Ca2+ để làm ion tạo gel [ CITATION Sim03 \l 1033 ] 131, [ CITATION Mor06 \l

1033 ] 132.

Hình 1.2 Sự hình thành gel của alginate với ion Ca2+ [ CITATION DrK05 \l

1033 ]129

1.3.2 Các phương pháp cố định vi sinh vật trong gel alginate

1.3.2.1 Các phương pháp tạo gel alginate

Có hai phương pháp tạo gel alginate: tạo gel từ ngoài và tạo gel từ trong

Phương pháp tạo gel từ ngoài phổ biến hơn vì tạo gel nhanh và thao tác đơn giản.Khi nhỏ giọt dung dịch alginate vào dung dịch có chứa cation, thường là Ca2+, bề mặtngoài của hạt alginate sẽ lập tức bị gel hóa Sau đó, các cation tiếp tục khuếch tán vàobên trong hạt làm cho các phân tử alginate bên trong tiếp tục bị gel hóa[ CITATION DrK05 \l 1033 ] 129, [ CITATION And861 \l 1033 ] 133

Phương pháp tạo gel từ trong mang lại tính đồng nhất và đa dạng về hình thức chocấu trúc gel Cho muối chứa Ca2+ dạng không tan như CaCO3, CaSO4, EDTA-Ca, Cacitrate… vào dung dịch alginate, sau đó thay đổi độ hòa tan của muối bằng cách chỉnh

pH dung dịch Ca2+ giải phóng dần và tạo gel với alginate[ CITATION And86 \l

1033 ] 134, [ CITATION Joh85 \l 1033 ] 135, [ CITATION Placeholder4 \l 1033 ] 136

Đa số các nghiên cứu về cố định tế bào nấm men trong gel alginate đều sử dụngphương pháp tạo gel từ ngoài Sinh khối nấm men sẽ được thêm vào dung dịchalginate rồi nhỏ giọt vào dung dịch CaCl2 Các hạt gel chứa tế bào nấm men vừa tạothành sẽ được tiếp tục ngâm trong dung dịch CaCl2 một thời gian để ổn định cấu trúctrước khi được sử dụng trong quá trình lên men [ CITATION Mag89 \l 1033 ]13,

[ CITATION Hil90 \l 1033 ]14, [ CITATION Tai94 \l 1033 ]137

-xxvi-Hạt gel Cacium Alginate

Alginate

CaCl 2

Na-Alginate

H 2 O

GDL H+

Ca Na-Alginate

Hình 1.3 Cơ chế tạo gel của alginate từ bên ngồi (trái) từ bên trong (phải)

[ CITATION DrK05 \l 1033 ]129

1.3.2.2 Ảnh hưởng của các điều kiện tạo gel đến độ bền gel và quá trình lên men

Khối lượng phân tử alginate: khối lượng phân tử alginate ảnh hưởng nhiều đến độ

bền gel Mạch alginate càng dài thì cấu trúc gel càng bền, nhưng ít ảnh hưởng đến khảnăng khuếch tán của glucose, tốc độ lên men và sự tạo thành ethanol của nấm men cốđịnh trong gel alginate [ CITATION And861 \l 1033 ]133, [ CITATION Kaz95 \l

1033 ]138

Tỷ lệ M/G: là phần mol của D-mannuronic acid (M) so với L-guluronic acid (G).

Alginate cĩ hàm lượng G nhỏ hơn 20-25% sẽ khơng tạo gel được Alginate cĩ hàmlượng G lớn sẽ tạo thành gel xốp, chắc, khơng biến dạng và giữ được độ cứng trongmột thời gian dài Alginate cĩ hàm lượng M cao tạo thành gel mềm, ít xốp và dễ bị rãhơn Gel alginate giàu G thích hợp để cố định nấm men hơn vì gel này ít gây cản trởđến khả năng khuếch tán của glucose và hạn chế sự sinh trưởng của tế bào nấm mensau khi cố định [ CITATION Koz94 \l 1033 ] 130, [ CITATION Mor06 \l 1033 ] 132, [ CITATION Sei97 \l 1033 ] 138, [CITATION Kaz92 \l 1033 ] 139.

Nồng độ alginate: nồng độ alginate khơng ảnh hưởng đến kích thước, hình dạng

hạt gel nhưng ảnh hưởng đến độ bền của hạt gel Khi tăng nồng độ dung dịch alginatesẽ tăng độ bền hạt gel, khả năng giữ nước của gel cũng tốt hơn nhưng tốc độ lên men

và sinh tởng hợp ethanol lại giảm đáng kể Nồng độ alginate thích hợp để cố định nấmmen thường là 2% [ CITATION And861 \l 1033 ] 133, [ CITATION Kaz92 \l 1033 ] 140, [ CITATION Gha04 \l 1033 ] 141.

pH tạo gel: Cấu trúc hạt gel alginate khơng bị ảnh hưởng bởi pH trong khoảng từ 4

– 10 Khi pH nhỏ hơn 4, thể tích của hạt sẽ giảm; khi pH cao hơn 10, thể tích của hạttăng; pH nhỏ hơn 2, các hạt gel rất nhỏ và khơng đàn hồi pH của dung dịch alginate

-xxvii-thích hợp cho quá trình tạo gel cố định tế bào nấm men nằm trong khoảng từ 6,0 đến8,0 Nằm ngoài khoảng này, khả năng khuếch tán của glucose và độ bền gel đều giảm.

điều kiện này, độ bền gel và khả năng khuếch tán của glucose gần như không bị ảnhhưởng Các tính chất này sẽ giảm nhanh khi nhiệt độ tạo gel cao hơn 27oC [ CITATIONKaz95 \l 1033 ]138, [ CITATION Ned04 \l 1033 ]142

Nồng độ cation tạo gel: khi tăng nồng độ cation tạo gel thì gel tạo thành sẽ bền

chắc hơn Bản chất của cation tạo gel cũng ảnh hưởng đến độ bền gel Độ bền gel tạothành từ các cation kim loại sẽ tăng dần theo thứ tự: Co2+ - Ca2+ - Sr2+ - Ba2+ - Cd2+ -

Cu2+ Ion Ca2+ thường được sử dụng để tạo gel cố định tế bào nấm men Nồng độCaCl2 thích hợp cho việc tạo gel alginate thường là 2% Nếu giá trị này lớn hơn 10%

thì tốc độ tăng trưởng của Saccharomyces cerevisae bị ức chế [ CITATION Mor06 \l

1033 ]132, [ CITATION Placeholder4 \l 1033 ]136

Kích thước hạt gel: kích thước hạt gel ảnh hưởng đến sự truyền khối trong quá

trình lên men Các hạt có đường kính nằm trong khoảng 0,5-0,6mm là thích hợp choquá trình phát triển của tế bào cũng như hiệu quả lên men [ CITATION And86 \l

1033 ]135

Mật độ tế bào trong hạt gel: khi tăng mật độ tế bào ban đầu trong hạt gel trong một

giới hạn xác định thì tốc độ lên men tăng lên nhưng hiệu suất sinh tổng hợp ethanol sẽgiảm đi [ CITATION Kou04 \l 1033 ]46

1.3.3 Ưu nhược điểm của phương pháp cố định nấm men trong gel alginate

Nấm men cố định trong gel alginate đã được nghiên cứu và sử dụng rộng rãitrong các quy trình sản xuất rượu vang chu kỳ hay liên tục do quá trình cố địnhdễ thực hiện, hiệu suất cố định và mật độ tế bào trong hạt gel cao, điều kiện cốđịnh ôn hòa, không phải xử lý nhiệt hay xử lý hóa chất nên các tế bào cố địnhkhông bị mất hoạt tính lên men Ngoài ra, alginate là chất mang trơ về mặt hóahọc, an toàn, độ xốp của mạng gel thuận lợi cho việc khuếch tán cơ chất và sản

phẩm, gel alginate khá bền khi lên men ở nhiệt độ cao [ CITATION Kou04 \l

1033 ] 46, [CITATION Gal90 \l 1033 ] 117.

Nhược điểm chính của phương pháp này là độ bền của hạt gel alginate chứanấm men cố định sẽ giảm dần theo thời gian lên men do sự sinh trưởng của các

-xxviii-tế bào và do sự giải phóng CO2 bên trong hạt gel làm phá vỡ cấu trúc của gel.Giá trị pH cao và sự có mặt của hợp chất phosphate, citrate và lactate trong môi

trường lên men cũng làm cho độ bền gel giảm dần [ CITATION Kou04 \l

1033 ] 46, [CITATION AJM011 \l 1033 ] 142, [ CITATION AJM011 \l 1033 ] 143.

Một số giải pháp đã được nghiên cứu để tăng độ bền gel hoặc tăng hoạt tínhlên men của nấm men cố định trong gel alginate như tạo lớp gel kép

[CITATION Kaz92 \l 1033 ] 139; đồng cố định nấm men trong alginate và pectin [ CITATION Kim \l 1033 ] 144

1.4 Cố định nấm men vang trên cellulose vi khuẩn

1.4.1 Cellulose vi khuẩn

Cellulose vi khuẩn là polymer do các gốc đường glucose liên kết với nhau bằngliên kết -1,4-glycoside Các chuỗi glucan liên kết với nhau bằng liên kết Van derWaals và liên kết hydro tạo nên cấu trúc tiền sợi, rồi kết tinh thành sợi, bó, dải.Cellulose vi khuẩn được phân biệt với cellulose thực vật nhờ vào chỉ số kết tinh cao(trên 60%) Độ trùng hợp của cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật lần lượt daođộng trong khoảng 2.000–6.000 và 13.000–14.000 Ngoài ra, đường kính của sợicellulose vi khuẩn chỉ vào khoảng 1/100 đường kính của sợi cellulose thực vật[ CITATION Ngu03 \l 1033 ]145, [ CITATION Hol04 \l 1033 ]146, [CITATIONIsh \l 1033 ]147

Hình 1.4 Cấu trúc cellulose vi khuẩn (trái) và cellulose thực vật (phải) [ CITATION

Phạ06 \l 1033 ]148

-xxix-Hình 1.5 Cấu trúc cellulose vi khuẩn I (trái) và cấu trúc cellulose vi khuẩn II (phải)

1033 ]148, [ CITATION Ngu06 \l 1033 ]149

Cellulose vi khuẩn là loại cellulose sinh học duy nhất không chứa lignin hayhemicellulose, do đó việc thu nhận cellulose vi khuẩn không phải qua những bước xửlý phức tạp, sợi cellulose bền hơn và vẫn giữ lại những đặc tính quan trọng Màngcellulose vi khuẩn có khả năng giữ nước rất lớn, nó có thể hút lượng nước gấp 60-700lần khối lượng của nó Độ xốp của cellulose vi khuẩn có thể điều chỉnh được nhờ khảnăng hút và giữ nước cao[ CITATION Mit80 \l 1033 ]102, [ CITATION Bro \l

1033 ]150, [ CITATION EPB94 \l 1033 ]151, [ CITATION Oik94 \l 1033 ]152

1.4.2 Các phương pháp cố định vi sinh vật trên chất mang cellulose vi khuẩn

1.4.2.1 Phương pháp hấp phụ

Sự hấp phụ tế bào lên bề mặt cellulose vi khuẩn xảy ra là do chất mang có cấu trúcxốp, nhiều mao quản Phương pháp này được thực hiện bằng cách ngâm chất mangtrong dung dịch huyền phù vi sinh vật Cellulose vi khuẩn sẽ trương nở dần và vi sinh

-xxx-vật sẽ tự động kết lắng và hấp phụ trên bề mặt chất mang [ CITATION Kli83 \l

1.4.2.2 Phương pháp hấp phụ- ủ

Vi sinh vật cố định trên cellulose vi khuẩn sau thời gian hấp phụ có thể sử dụngchất dinh dưỡng đã được khuếch tán vào trong cấu trúc của chất mang để tăng sinhkhối trong giai đoạn ủ Quá trình cố định gồm giai đoạn hấp phụ như đã nói ở trên, vàgiai đoạn ủ, tăng mật độ vi sinh vật trong cấu trúc cellulose vi khuẩn Phương pháphấp phụ-ủ không những đã làm tăng mật độ vi sinh vật trong chất mang lên nhiều lần,

mà còn ổn định mật độ vi sinh vật cố định trên chất mang trong một thời gian dài

[ CITATION Ngu06 \l 1033 ] 149.

1.4.3 Ưu nhược điểm của phương pháp cố định nấm men trên cellulose vi khuẩn

Nấm men cố định trên cellulose vi khuẩn tuy chỉ mới được nghiên cứu trongthời gian gần đây nhưng cũng chứng tỏ là có nhiều ưu điểm khi ứng dụng vàoquá trình lên men vang Quá trình cố định dễ thực hiện, điều kiện cố định ônhòa, không phải xử lý nhiệt hay xử lý hóa chất nên các tế bào cố định không bịmất hoạt tính lên men Phương pháp hấp phụ – ủ còn tạo điều kiện cho nấm men

cố định trên miếng chất mang cellulose vi khuẩn tăng sinh khối, thích nghi vớimôi trường lên men nhanh hơn Ngoài ra, do chất mang cellulose vi khuẩn cótính chất cơ lý bền và ổn định, độ trương nở tốt nên vi sinh vật cố định trêncellulose vi khuẩn có khả năng tái sử dụng nhiều chu kỳ[ CITATION Ngu08 \l

1033 ] 28, [ CITATION Yao11 \l 1033 ] 29, [ CITATION Ngu03 \l 1033 ] 145, [ CITATION Phạ06 \l 1033 ] 148, [ CITATION Ngu06 \l 1033 ] 149.

-xxxi-Nhược điểm chính của phương pháp này là hiệu suất cố định và mật độ tếbào cố định trên cellulose vi khuẩn không cao bằng phương pháp cố định bằngcách nhốt trong khung mạng xốp, đồng thời không thể cố định các vi sinh vật cóhoạt tính cellulase trên cellulose vi khuẩn vì cấu trúc chất mang sẽ bị phá hủy

[ CITATION Kou04 \l 1033 ] 46, [ CITATION Ngu06 \l 1033 ] 149.

1.5 Ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến quá trình lên men rượu vang

Lên men rượu vang là một quá trình khá phức tạp Nó bao gồm nhiều biến đổi sinhhọc, hóa sinh, hóa học, hóa lý và vật lý để chuyển hóa dịch nho thành rượu vang.Ngoài hai sản phẩm chính là ethanol và CO2, rượu vang còn chứa các sản phẩm phụ vàcác sản phẩm trung gian từ quá trình trao đổi chất của nấm men vang như glycerol,rượu bậc cao (propanol, butanol, iso amylic), acid hữu cơ (tartaric, malic, citric,acetic), hợp chất carbonyl (aldehyde, diacetyl, acetoin), ester (ethylacetate,isoamylacetate ) [ CITATION Jac08 \l 1033 ]4

Khả năng lên men rượu vang của nấm men Saccharomyces cerevisiae phụ thuộc

vào rất nhiều yếu tố: điều kiện lên men (nhiệt độ, mật độ giống cấy ban đầu…), thànhphần của dịch lên men (nồng độ đường, tannin, SO2, pH) Khi ở ngoài giới hạn thíchhợp thì các yếu tố này có thể ảnh hưởng bất lợi đến tiến trình lên men của nấm menvang[ CITATION Hoh03 \l 1033 ]110, [ CITATION PMa05 \l 1033 ]153

1.5.1 Ảnh hưởng của hàm lượng đường

Đường là cơ chất chính trong dịch nho được nấm men sử dụng để sinh tổng hợpnăng lượng cho tế bào đồng thời chuyển hóa thành ethanol, CO2 cũng như các sảnphẩm phụ khác Khi lên men trong môi trường lỏng, nấm men chịu tác động của áp lựcthẩm thấu tạo ra do các chất hòa tan, phần lớn là đường, lên màng tế bào Khi nồng độchất hòa tan trong môi trường quá cao, màng tế bào không thể duy trì sự cân bằng áplực thẩm thấu giữa bên trong và bên ngoài được nữa Tế bào chất có thể bị co lại làmhoạt tính trao đổi chất của nấm men bị giảm đi Để sản xuất rượu vang nồng độethanol cao (13 – 16%v/v), người ta sử dụng dịch nho cô đặc hay bổ sung đường vàomôi trường lên men Nấm men trong trường hợp này phát triển sinh khối chậm, kíchthước nhỏ, tốc độ lên men chậm, hàm lượng đường sót trong sản phẩm cao[ CITATION Rib06 \l 1033 ]1, [ CITATION Rib061 \l 1033 ]2

-xxxii-Quá trình cố định làm thay đổi hoạt tính trao đổi chất của nấm men và làm tăng khảnăng chống chịu của nấm men đối với áp suất thẩm thấu cao Chất mang còn giữ vaitrò bảo vệ tế bào, áp lực thẩm thấu từ môi trường lên men không tác động tức thời đến

tế bào, vì vậy, nấm men cố định vẫn có khả năng lên men ở hàm lượng đường cao vàhàm lượng đường sót khi quá trình lên men kết thúc luôn thấp hơn so với nấm men tự

do Holcberg (1981) đã nghiên cứu sự lên men của nấm men cố định trong gel agar,alginate và nấm men tự do trong canh trường chứa đến 50% đường glucose và thấyrằng ở nồng độ đường này, nấm men tự do hầu như không thể hoạt động và chuyểnhóa đường trong khi nấm men cố định vẫn có thể lên men và dịch lên men có hàmlượng ethanol là 5%[ CITATION Mar81 \l 1033 ]106 Iconomopoulou (2002) sử dụng

nấm men cố định trong viên gluten và nấm men tự do để lên men dịch nho Rhotidis

với hàm lượng đường là 306g/L; kết quả cho thấy thời gian lên men của nấm men cốđịnh và nấm men tự do lần lượt là 194 và 240h, tốc độ sinh tổng hợp ethanol lần lượt

là 0,44 và 0,39g/L.h [ CITATION MIc02 \l 1033 ]70

1.5.2 Ảnh hưởng của pH

Kiểm soát pH và độ acid trong rượu vang là điều rất quan trọng để duy trì chấtlượng rượu vang trong suốt quá trình bảo quản pH thấp sẽ làm tăng cường độ màu(màu đỏ), độ sáng, độ tươi và tăng hương vị trái cây pH cao làm giảm độ màu, giảm

độ bền sinh học và hóa học trong suốt quá trình bảo quản sản phẩm Ngoài ra, pH cònảnh hưởng đến hoạt động của nấm men Khi pH càng thấp, hàm lượng ion H+ trongdịch lên men càng cao; từ đó sẽ tạo ra sự chênh lệch lớn giữa nồng độ ion H+ ở bêntrong và bên ngoài tế bào, làm cho nấm men mất khả năng phát triển và làm vô hoạtenzyme nội bào [ CITATION YKo01 \l 1033 ]27 Nấm men cố định có khả năngchống chịu sự biến đổi của pH tốt hơn nấm men tự do [ CITATION Buz89 \l

1033 ]154, [ CITATION Wal02 \l 1033 ]155, [ CITATION Wil81 \l 1033 ]156,

[ CITATION Vic03 \l 1033 ]157, [ CITATION Arr09 \l 1033 ]158 Theo Serra (2005),

sự giảm pH làm tăng năng lượng hoạt hóa của tế bào, nên tế bào sẽ sinh trưởng chậm

và tốc độ sinh trưởng riêng cực đại thấp hơn [ CITATION Ser05 \l 1033 ]159 Ngoài

ra, theo Arena (2005), ở pH thấp, tế bào dùng năng lượng để duy trì sự sống hơn là đểsinh trưởng [ CITATION Are05 \l 1033 ]160

-xxxiii-Szajani (1996) đã nghiên cứu hệ thống lên men liên tục với nấm men cố định tronghạt cellulose được chế tạo từ cellulose xanthogenate do hãng Hungarian ViscoseFactory cung cấp Kết quả cho thấy là trong khi hoạt tính lên men của nấm men tự dochỉ ổn định ở pH 4 thì nấm men cố định có thể hoạt động trong khoảng pH từ 3,0 đến6,25[ CITATION BSz96 \l 1033 ]161 Jirku (1999) đã cố định nấm men trong mạngpolymer tạo thành từ nhựa epoxy và diaminopolyethylene oxide và ứng dụng để lênmen dung dịch glucose cũng đi đến kết luận là hiệu suất sinh tổng hợp ethanol củanấm men tự do đạt giá trị cao ở pH 4,5, còn hiệu suất sinh tổng hợp ethanol của nấmmen cố định có thể ổn định trong một khoảng pH rộng, 3,5-6,5 [ CITATION Jir99 \l

1033 ]162

Sulfur dioxide được sử dụng phổ biến trong rượu vang và ngành công nghiệp thựcphẩm như tác nhân chống oxy hóa và diệt khuẩn Hàm lượng SO2 cho phép trong rượuvang theo quy định của Hoa Kỳ là 350mg/L [ CITATION Fug07 \l 1033 ]29 SO2 còn

là chất phá vỡ cầu nối disulfide trong phân tử enzyme, làm ức chế quá trình hóa nâu doenzyme, đồng thời cũng là tác nhân chọn lọc các giống nấm men trong quá trình lênmen vang truyền thống [ CITATION Fug07 \l 1033 ]30,[ CITATION Rom93 \l

1033 ]163

SO2 tăng quá cao sẽ ức chế quá trình trao đổi chất và sinh tổng hợp ethanol của nấmmen [ CITATION Jac08 \l 1033 ]4, [ CITATION Fug07 \l 1033 ]30,[ CITATIONMor09 \l 1033 ]164,[ CITATION Mag98 \l 1033 ]165 Ngoài ra, SO2 còn làm tăng sựtích lũy một số hợp chất khác trong quá trình lên men như glycerol, aceltaldehyde,diacetyl, acetoin…[ CITATION Rom93 \l 1033 ]163, [ CITATION Cou04 \l

1033 ]166, [ CITATION Rad93 \l 1033 ]167

Phần lớn những nghiên cứu về ảnh hưởng của SO2 đến quá trình lên men rượuvang tập trung khảo sát khả năng ức chế các loài nấm men bản địa của SO2

[ CITATION Mag98 \l 1033 ]165, [ CITATION THe98 \l 1033 ]168; ảnh hưởng của

SO2 đến sự tạo thành các hợp chất hương và khả năng chuyển hóa các loại acidamin[ CITATION Sis03 \l 1033 ]169, [ CITATION Ter06 \l 1033 ]170 Egli (1998) đãkhảo sát ảnh hưởng của lượng SO2 ban đầu đến tiến trình lên men vang sử dụng tế bào

-xxxiv-tự do Khi hàm lượng SO2 cao hơn 112ppm thì tốc độ lên men chậm lại, tạo điều kiệncho một số vi khuẩn có nguồn gốc từ trái nho chuyển hóa đường sót thành acid acetic [CITATION CME98 \l 1033 ]171 Yajima (2001) đã nghiên cứu lên men dịch nhoKoshu, có bổ sung SO2với nồng độ lên đến 325mg/L, sử dụng nấm men tự do và nấmmen cố định trong gel Ca alginate Kết quả là nấm men tự do và cố định bị ức chếhoàn toàn ở hàm lượng SO2 195mg/L và 325mg/L dịch lên men Khi hàm lượng SO2

thấp hơn, tốc độ lên men của nấm men cố định luôn ổn định và cao hơn so với nấmmen tự do[ CITATION Yaj01 \l 1033 ]172

1.5.4 Ảnh hưởng của hàm lượng tannin

Tannin là loại polyphenol phổ biến trong dịch nho đỏ Sự có mặt của tannintrong rượu vang ảnh hưởng đến màu sắc và vị chát đặc trưng của sản phẩm.Tannin còn làm tăng độ bền hóa lý của rượu vang nhờ khả năng liên kết vớiprotein và lắng xuống trong quá trình lên men và tàng trữ Hàm lượng tannin caotrong dịch nho cũng ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và lên men của nấmmen vang vì tannin liên kết với protein trên thành tế bào nấm men, ngăn cản sựkhuếch tán chất dinh dưỡng và các sản phẩm trao đổi chất qua màng

[ CITATION Mor09 \l 1033 ] 164, [ CITATION Maz04 \l 1033 ] 173, [ CITATION OhH80 \l 1033 ] 174, [ CITATION Ver96 \l 1033 ] 175

Soto (1968) khi nghiên cứu về quá trình lên men rượu champagne đã nhậnthấy rằng mật độ tế bào nấm men giảm khoảng 3,6; 11,7; 22,5 và 29,7% khithêm tannin với lượng 0,5; 1,7; 2,9 và 4,1 g/L vào dịch lên men đã chứa 0,3g/Ltannin [ CITATION Sot68 \l 1033 ] 176 Haslam (1992) lại cho rằng tannin có khả

năng liên kết với thành phần protein và polysaccharide trong dịch lên men bằngliên kết hydro hay liên kết Van der Waals tạo thành kết tủa hay phức chất

[ CITATION Has89 \l 1033 ] 177 Khi sử dụng nấm men tự do và nấm men cố

định trên cellulose đã tách lignin để lên men bia, Bardi (1996) nhận thấy hàmlượng polyphenol trong bia được lên men bởi nấm men cố định thấp hơn nấmmen tự do Tác giả giải thích là do tannin cũng có khả năng liên kết vớipolysaccharide nên một số chất mang có bản chất cellulose hay gelpolysaccharide đã hấp phụ một phần tannin có trong môi trường [ CITATION EPB94 \l 1033 ] 151 Yajima (2001) khảo sát thành phần hóa học dịch nho Koshu

-xxxv-và nhận thấy rằng hàm lượng tổng các hợp chất phenolic trong dịch nho là477mg Gallic Acid Equivalent/L (GAE/L) Tác giả này đã bổ sung các hợp chấtphenolic có xuất xứ từ hạt nho vào dịch nho Koshu để nồng độ dao động trongkhoảng 477 – 2178mgGAE/L Kết quả cho thấy trong khoảng hàm lượng khảosát, cả nấm men cố định trong gel alginate và nấm men tự do đều vẫn lên mentốt, tuy nhiên, ở 2178mgGAE/L thì tốc độ sinh tổng hợp ethanol của nấm men

tự do thấp hơn và hàm lượng ethanol cuối cũng thấp hơn 1%v/v [ CITATION Yaj01 \l 1033 ] 172 Wauter (2001) còn cho rằng acid tannic có thể kết hợp với

sắt ở trung tâm Fe-S trong chuỗi hô hấp, dẫn đến hiện tượng thiếu hụt sắt, từ đólàm giảm tốc độ sinh trưởng của nấm men [ CITATION Wau01 \l 1033 ] 178, [ CITATION Wau011 \l 1033 ] 179.

1.6 Ứng dụng nấm men cố định trong quá trình lên men vang tĩnh nhiều chu kỳ

Đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng nấm men cố định trên những chất mang khácnhau để lên men sản xuất rượu vang Alginate là một chất mang được sử dụng phổbiến nhất [ CITATION Mag89 \l 1033 ] 13, [ CITATION Bak92 \l 1033 ] 20, [ CITATION Bak97 \l 1033 ] 21, [ CITATION Kas12 \l 1033 ] 39, [ CITATION Fum87 \l

1033 ] 58, [ CITATION Fum88 \l 1033 ] 57 Nấm men cố định trong gel alginate đã được

sản xuất dưới dạng chế phẩm thương mại để cung cấp cho các nhà máy sản xuất thứcuống lên men Hãng Proenol-Industria Biotechnologica, Ltd (Bồ Đào Nha) đã thươngmại hóa nấm men cố định để ứng dụng trong quá trình lên men ở quy mô công nghiệp,đặc biệt là để giải quyết sự cố khi quá trình lên men bị dừng lại dù hàm lượng đườngsót còn rất cao

Việc sử dụng nấm men cố định trong phương pháp lên men tĩnh nhiều chu kỳ làhướng nghiên cứu được quan tâm trong thời gian gần đây vì có nhiều ưu điểm Nhờtác động bảo vệ của chất mang, hoạt tính nấm men cố định sẽ được duy trì lâu hơn, do

đó có thể tái sử dụng nấm men cố định nhiều chu kỳ trong khi nấm men tự do chỉ đượcsử dụng để lên men một chu kỳ [ CITATION Bak97 \l 1033 ]21, [ CITATION Ath03 \

l 1033 ]68, [ CITATION YKo05 \l 1033 ]76 Trong quá trình tái sử dụng, thời gian lênmen của nấm men cố định được rút ngắn đáng kể so với nấm men tự do Với cùng mộtnhiệt độ lên men, thời gian lên men của nấm men cố định ở chu kỳ sau thường ngắnhơn chu kỳ trước [ CITATION YKo06 \l 1033 ]78, [ CITATION LVe08 \l 1033 ]86,

-xxxvi-[ CITATION CHA05 \l 1033 ]180 Do không có sự khác biệt lớn về hàm lượngethanol trong vang non nhưng thời gian lên men ngắn hơn, nên nấm men cố định cótốc độ sinh tổng hợp ethanol cao hơn hẳn nấm men tự do và tốc độ này tăng dần theo

số chu kỳ tái sử dụng Ngoài ra, so với nấm men tự do thì nấm men cố định qua cácchu kỳ tái sử dụng sẽ tạo ra rượu vang có hàm lượng acid dễ bay hơi thường thấp hơnhoặc tương đương, thành phần cấu tử hương cũng ít thay đổi, hoặc thay đổi theo chiềuhướng có lợi Vì vậy chất lượng sản phẩm không thay đổi hoặc tốt hơn so với rượuvang sản xuất theo phương pháp truyền thống [ CITATION Ath03 \l 1033 ]68,[ CITATION EBa97 \l 1033 ]69, [ CITATION YKo06 \l 1033 ]78, [ CITATIONATs04 \l 1033 ]79, [ CITATION LVA06 \l 1033 ]81, [ CITATION Yaj01 \l

Đối với cellulose vi khuẩn, Nguyễn Thúy Hương (2008) đã lên men dịch nho bằng

nấm men Saccharomyces cerevisiae N28 cố định trên chất mang này và tái sử dụng 8

chu kỳ Thời gian lên men là 6 ngày, hàm lượng đường sót là 4,8g/L và hàm lượngethanol trong vang non là 8,8%v/v Các thông số này không khác biệt nhiều so vớimẫu đối chứng sử dụng nấm men tự do [ CITATION Ngu08 \l 1033 ]28

Kourkoutas (2001, 2006) sử dụng các miếng trái cây làm chất mang cố định nấm

men Saccharomyces cerevisiae AXAZ-1 để lên men vang từ dịch nho đỏ Rhotidis Nấm

men cố định trên miếng táo được tái sử dụng 30 chu kỳ, cứ sau 5 chu kỳ lại hạ thấpnhiệt độ lên men từ 25oC ở các chu kỳ đầu tiên và xuống còn 1oC ở các chu kỳ cuối.Kết quả là trong suốt 30 chu kỳ, các thông số lên men đều ổn định, hàm lượng đườngsót dưới 30g/L, hàm lượng ethanol trong vang non là 12%v/v, hàm lượng acid dễ bayhơi là 0,3g acetic acid/L Thời gian lên men cũng ổn định và dưới 90h trong 24 chu kỳ

-xxxvii-đầu [ CITATION YKo01 \l 1033 ]27, [ CITATION YKo06 \l 1033 ]78 Tác giả trêncòn sử dụng miếng mộc qua để làm chất mang cố định nấm men vang trong nghiêncứu năm 2003, tái sử dụng 40 chu kỳ, thời gian lên men dưới 100h và ổn định trong 35chu kỳ đầu với nhiệt độ lên men 10oC [ CITATION YKo03 \l 1033 ]75.

Tsakiris (2004) sử dụng chất mang là miếng nho Sultanina đã sấy khô để cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae Uvaferme 299 để lên men vang trắng từ dịch nho

Saint Denis Nấm men cố định được tái sử dụng trong 12 chu kỳ Nho khô tỏ ra là một

loại chất mang tốt cho nấm men vang khi lên men ở nhiệt độ 15-25oC Thời gian lênmen ngắn (3-5 ngày), hiệu suất chuyển hóa đường là 100%, hàm lượng acid dễ bayhơi, methanol và acetaldehyde trong dịch lên men thấp [ CITATION ATs04 \l

1033 ]79

Ngoài ra, Mallios (2004) đã tái sử dụng nấm men cố định trên miếng lê 20 chukỳ[ CITATION PMa \l 1033 ]73; Reddy (2006, 2008) đã tái sử dụng nấm men cố địnhtrên miếng ổi và cùi dưa hấu 12 chu kỳ [ CITATION LVA06 \l 1033 ]81,[ CITATION LVe08 \l 1033 ]86; Kandylis (2008, 2010, 2012) đã tái sử dụng nấm men

cố định trên chất mang khoai tây 35 chu kỳ; nấm men cố định trên chất mang hạt lúa

mì và hạt lúa mạch cho 30 chu kỳ lên men vang [ CITATION Kan10 \l 1033 ]37,[ CITATION Kan12 \l 1033 ]82, [ CITATION KOU08 \l 1033 ]181

1.7 Những ứng dụng khác của vi sinh vật cố định trong sản xuất rượu vang

Nấm men cố định ngoài những ưu điểm về khả năng lên men còn có những ưu thếtrong việc tổ chức sản xuất như chi phí vận hành thấp, năng suất và chất lượng sảnphẩm cao Vì vậy, có khá nhiều các nghiên cứu ứng dụng phương pháp lên men liêntục sử dụng nấm men cố định trong sản xuất rượu vang Nấm men cố định cũng đượcsử dụng trong công nghệ sản xuất các loại rượu vang ngọt hay rượu vang có gas lênmen hai lần theo phương pháp Champenoise nhằm dừng quá trình lên men theo ýmuốn, tăng độ trong của sản phẩm và rút ngắn thời gian lên men

Các loại nấm men bản địa cố định cũng được sử dụng kết hợp với nấm men

Saccharomyces cerevisiae trong quá trình lên men vang để chuyển hóa acid malic,

ngăn chặn sự lên men kéo dài hoặc cải thiện hương vị cho sản phẩm rượu vang Ngoài

ra, vi khuẩn Oenococcus oeni cố định cũng được ứng dụng để tiến hành quá trình lên

-xxxviii-men malolactic trong các quy trình sản xuất rượu vang Bảng 1.3 trình bày một sốnghiên cứu ứng dụng đã nêu ra ở trên.

Bảng 1.3 Các ứng dụng của vi sinh vật cố định trong sản xuất rượu vang

Lên men liên tục Lên men dịch nho đỏ Rhotidis với chủng nấm men S cerevisiae

Visanto cố định trên kissiris, -alumina và Ca-alginate Lưu lượng

nhập liệu là 600mL/ngày Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol cao hơn 3-10 lần so với nấm men tự do và quá trình lên men trong suốt 80 ngày không hề bị nhiễm

Bakoyanis (1997)

[ CITATION Bak97 \l 1033 ]21

Lên men dịch nho đỏ Rhotidis bằng chủng nấm men S cerevisiae

AXAZ-1 cố định trên miếng mộc qua Lưu lượng nhập liệu giảm

dần từ 1500mL/ngày xuống 150mL/ngày, tương ứng với nhiệt độ giảm từ 30 o C xuống 5 o C Hệ thống vận hành trong 46 ngày mà hoạt tính lên men không thay đổi Khi sử dụng chất mang là miếng táo thì thời gian vận hành của hệ thống lên đến 93 ngày.

Kourkoutas (2002)

[ CITATION YKo02

\l 1033 ]74,

[ CITATION YKo021 \l 1033 ]77

Sử dụng nấm men S cerevisiae cố định trong gel alginate để sản

xuất rượu vang đỏ ở quy mô công nghiệp Dung tích hệ thống lên men là 120hL Thời gian thu sản phẩm rút ngắn còn 3 ngày, chất lượng rượu vang thu được là tương đương với trường hợp lên men tĩnh truyền thống.

Kassim (2012)

[ CITATION Kas12 \

l 1033 ]39

Rượu vang ngọt Sử dụng nấm men S cerevisiae W-3 cố định trong gel alginate để

dừng quá trình lên men theo ý muốn Rượu vang có độ trong cao

và rất dễ lọc.

Yokotsuka (2003)

[ CITATION Yok03 \l 1033 ]62 Rượu vang có gas Sử dụng nấm men S cerevisiae và bayanus cố định trong hạt gel

alginate để lên men lần hai với môi trường là rượu vang nền từ

giống nho Pinot Nấm men cố định hầu như không làm thay đổi

chất lượng của rượu vang có gas so với nấm men tự do, kể cả các thành phần hợp chất hương.

Fumi (1988)

[ CITATION Fum88 \l 1033 ]57 Ciani (1991)

[ CITATION Mau91 \l 1033 ]182 Chuyển hóa acid

malic thành

ethanol

Sử dụng Schizosaccharomyces pombe cố định trong gel alginate để

lên men dịch nho đỏ có hàm lượng acid malic 11g/L Sau 50h, lượng acid malic được chuyển hóa là 100%, trong khi đó, nấm men

tự do cần đến 60h

Magyar (1989)

[ CITATION Mag89 \l 1033 ]13 Yokotsuka (1993)

[ CITATION Yok93 \l 1033 ]60 Silva (2003)

[ CITATION Sil03 \l

1033 ]65 Ngăn chặn hiện

tượng thời gian

lên men bị kéo

dài

Sử dụng nấm men S cerevisiae cố định trong gel alginate để xử lý

hiện tượng kéo dài thời gian lên men trong sản xuất rượu vang ở

Pháp và Bồ Đào Nha Tốc độ chuyển hóa đường khử đạt tới 2,8g/L.ngày, không làm tăng hàm lượng acid dễ bay hơi.

Silva (2002)

[ CITATION Sil02 \l

1033 ]64 Cải thiện hương

vị rượu vang Kết hợp lên men dịch nho đỏ Pinot bằng Candida stellata và S. cerevisiae cố định trong gel alginate Phương pháp này đã làm cho

lượng đường sót trong rượu vang chỉ còn 0,3g/L so với 10,6g/L khi

chỉ lên men với S cerevisiae

Ciani (2006)

[ CITATION Mau061 \l 1033 ]183 Lên men

malolactic Sử dụng vi khuẩn thuộc loài Oenococcus oeni cố định trên chấtmang cellulose vi khuẩn bằng phương pháp hấp phụ- ủ để lên men

malolactic

Nguyễn Thúy Hương (2007) [ CITATION Ngu07 \l 1033 ]184

-xxxix-1.8 Tổng hợp tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng đề tài

Đối với những vấn đề liên quan đến luận án, sau khi thực hiện xong phần Tổngquan tài liệu, chúng tôi có một số nhận định như sau:

Về việc sử dụng nấm men cố định trong gel alginate để lên men rượu vang:

Tại Việt Nam đã có một số nghiên cứu về phương pháp cố định nấm men trong gelalginate Lê Thị Lan Chi (2000, 2001) đã xác định điều kiện kỹ thuật thích hợp nhưmật độ tế bào trong gel là 4,6.107 tb/mL; nồng độ alginate trong gel là 2,0% w/v vànồng độ dung dịch CaCl2 là 1%w/v để lên men dịch nha 12oPt sản suất bia[ CITATION LêT00 \l 1033 ]185, [ CITATION LêT01 \l 1033 ]186 Trần Quốc Hiền(2008) đã xác định lại các điều kiện kỹ thuật để cố định nấm men trong gel alginate vàứng dụng lên men dịch nha 24oPt để sản xuất bia nồng độ cao [ CITATION Tra08 \l

1033 ]47

Bên cạnh ứng dụng trong sản xuất bia, các nghiên cứu trong nước tập trung khảosát ứng dụng nấm men cố định trong gel alginate để lên men sản xuất ethanol NgôĐăng Nghĩa (1996, 1998) đã chiết xuất alginate từ nguồn rong mơ của Việt Nam vàthử nghiệm lên men ethanol trên môi trường dịch đường glucose [ CITATIONNgô96 \l 1033 ]187, [ CITATION Ngô98 \l 1033 ]188 Đến năm 2008, Bùi ThanhHuyền đã thay đổi nồng độ glucose 140-200g/L trong môi trường tổng hợp và nhậnthấy nấm men cố định luôn có tốc độ lên men cao hơn khoảng 1,3-2,5 lần và nồng độethanol trong dịch dấm chín cao hơn khoảng 1,7-2,2 lần so với nấm men tựdo[ CITATION Bui08 \l 1033 ]189 Phạm Trọng Khoa (2003) đã sử dụng nấm men cốđịnh trong gel alginate để lên men sản xuất ethanol theo phương pháp liên tục trongkhoảng thời gian 36-40 ngày với tốc độ pha loãng là 0,0125h-1 Sản phẩm tạo thành cóhàm lượng ethanol dao động trong khoảng 6,8-7,4 % (v/v) [ CITATION Phạ02 \l 1033]190

Đến nay, chúng tôi chưa tìm thấy công bố của các nhà khoa học trong nước về ứngdụng nấm men cố định trong gel alginate để lên men rượu vang nho

Ngoài nước, đã có khá nhiều công trình nghiên cứu về sử dụng nấm men cố địnhtrong gel alginate để lên men rượu vang, sử dụng phương pháp lên men tĩnh tái sửdụng nấm men nhiều chu kỳ và phương pháp lên men liên tục Đó là những nghiên