LUẤN ÁN TIẾN SĨ NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH ERYTHROMYCIN TRONG TÔM, CÁ BẰNG KỸ THUẬT SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM VÀ KHẢ NĂNG ĐÀO THẢI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN PHƯỚC MINH NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH ERYTHROMYCIN TRONG TÔM, CÁ BẰNG KỸ THUẬT SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM VÀ KHẢ NĂNG ĐÀO THẢI LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT Tp. Hồ Chí Minh năm 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN PHƯỚC MINH NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH ERYTHROMYCIN TRONG TÔM, CÁ BẰNG KỸ THUẬT SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM VÀ KHẢ NĂNG ĐÀO THẢI Chuyên ngành: Chế Biến Thực Phẩm và Đồ Uống Mã số chuyên ngành: 62.54.02.01 Phản biện độc lập 1: Phản biện độc lập 2: Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. TS. Trần Bích Lam 2. TS. Nguyễn Trọng Giao Tp. Hồ Chí Minh năm 2012 i LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả. Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài liệu (nếu có) đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu. Tác giả luận án Nguyễn Phước Minh ii TÓM TẮT LUẬN ÁN  Đề tài đã xây dựng được phương pháp sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm trong việc phân tích dư lượng kháng sinh erythromycin trong tôm, cá đạt được giới hạn phát hiện (LoD = 0,52 ppb), đáp ứng yêu cầu giới hạn dư lượng cho phép theo tiêu chuẩn quốc tế (Codex, FAO/WHO, EU, Mỹ, Canada, Úc), rút ngắn thời gian phân tích, đơn giản hóa kỹ thuật, tiết kiệm chi phí.  Giải thích được cơ chế xuất hiện sóng của erythromycin, từ đó khái quát hoá và đưa ra được giả thuyết dự đoán khả năng nhận danh và định lượng từng họ kháng sinh như phenicol, nitrofuran, fluoroquinolon (thường gặp trong nuôi trồng thuỷ sản) bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm.  Kết quả đề tài đã cho thấy rằng các dẫn xuất erythromycin không chỉ được chuyển hoá từ Sacchropolyspora erythrea bằng con đường lên men, mà còn erythromycin A khi vào cơ thể tôm cá, dưới tác dụng của các enzyme oxy hóa khử và enzyme chuyển methyl hóa, chuyển thành erythromycin C, E, F, sau đó bị đào thải. Đề tài cũng đưa ra được giả thuyết giải thích cơ chế chuyển hoá erythromycin trong tôm càng xanh, cá rô phi khi nuôi.  Đã đánh giá và rút ra được quy luật thời gian ngưng kháng sinh erythromycin trước thu hoạch trên đối tượng tôm càng xanh và cá rô phi. iii ABSTRACT  A new sensitive analytical approach for determination of erythromycin A in giant freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii), tilapia (Oreochromis niloticus) by a fast scanning stripping square wave voltammetry using the dropping mercury electrode (PSA- F) was developed and validated to meet requirements of detection limit, low cost and simple technique .  Clarify the mechanism of peak appearance of erythromycin on basic of square wave voltammetry. From that point, a general hypothesis about the identified and quantified ability for antibiotic groups such as phenicols, nitrofurans, fluoroquinolones (in aquaculture) by square wave voltammetry at dropping mercury electrode was clearly introduced.  Overcome the opinion that derivatives of erythromycins were only metabolized by Sacchropolyspora erythrea in fermentation. Specifically was an evidence of biotransformation of erythromycin A to erythromycin C, E, F during prawn and tilapia aquaculture. From this point, a hypothesis of bio-transformative mechanism in these species was also established.  Investigate the elimination and bio-transformation of erythromycin A in giant freshwater prawn and tilapia so that appropriated withdrawal time periods were outlined to each specie. iv LỜI CÁM ƠN Nhìn lại những gì đã qua, trước tiên em xin bày tỏ tình thương mến và lòng biết ơn sâu sắc đến Ba Mẹ đã nuôi dưỡng và lo lắng cho em đến ngày hôm nay, không chỉ là giá trị vật chất mà còn là những giá trị tinh thần hết sức quý báu không gì so sánh được. Em xin trân trọng gửi lời cám ơn đến thầy Nguyễn Trọng Giao và cô Trần Bích Lam những người thầy cô hướng dẫn rất đáng kính, người đã tận tình chỉ dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện luận án. Sự biết ơn này cũng xin được chân thành gửi đến quý thầy cô: thầy Lê Văn Việt Mẫn, thầy Nguyễn Hoàng Dũng, cô Đống Thị Anh Đào, cô Phan Ngọc Hoà tại Bộ Môn Công Nghệ Thực Phẩm, Khoa Kỹ Thuật Hoá Học, ĐH Bách Khoa Tp. HCM; thầy Nguyễn Phước Thành - Trường ĐH Tôn Đức Thắng; thầy Nguyễn Bá Hoài Anh - Trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp. HCM; thầy Nguyễn Như Trí - ĐH Nông Lâm Tp. HCM cùng bạn bè gần xa đã có những định hướng và góp ý hết sức quý báo cho em trong suốt thời gian qua. Sau cùng, em rất tự hào và vinh dự khi được học tập dưới mái trường ĐH Bách Khoa Tp. HCM, một trong những trường ĐH hàng đầu ở Việt Nam với những điều kiện học tập thuận lợi nhất. v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i TÓM TẮT LUẬN ÁN ii ABSTRACT iii LỜI CÁM ƠN iv MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC HÌNH viii DANH MỤC CÁC BẢNG x DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 4 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 6 1.1. Tồn dư kháng sinh đối với an toàn thực phẩm 6 1.1.1 Thực trạng về tình hình sử dụng kháng sinh trong thú y và chăn nuôi 6 1.1.2 Ảnh hưởng của chất kháng sinh tồn dư đến chất lượng thực phẩm 6 1.1.3 Những qui định về sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi – thú y 7 1.2 Erythromycin và biến đổi của erythromycin trên cơ thể thủy sản 7 1.2.1 Erythromycin 7 1.2.2 Chuyển hóa sinh học của erythromycin bởi Saccharopolyspora erythraea 9 1.2.3 Chuyển hóa và đào thải erythromycin trên cơ thể thủy sản 11 1.2.4 Vì sao chọn đối tượng thủy sản trong nghiên cứu này là tôm càng xanh và cá rô phi 14 1.3 Các kỹ thuật dùng để phân tích erythromycin 15 1.3.1 Phương pháp ELISA 15 1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ 16 1.3.3 Phương pháp Von-ampe 22 1.4 Những vấn đề tồn tại cần giải quyết 28 CHƯƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 vi 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị dụng cụ, hóa chất 29 2.1.1 Nguyên vật liệu 29 2.1.2 Thiết bị dụng cụ 29 2.1.3 Hoá chất 29 2.2 Phương pháp nghiên cứu 30 2.2.1 Sơ đồ tiến trình nghiên cứu 30 2.2.2 Phương pháp thực nghiệm 32 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 39 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40 3.1 Các điều kiện phù hợp cho quá trình định lượng erythromycin bằng phương pháp sóng vuông quét nhanh và stripping sóng vuông quét nhanh 40 3.1.1 Nghiên cứu thăm dò định hướng và chọn vùng quét thế 40 3.1.2 Nghiên cứu tìm dung dịch nền và pH thích hợp 41 3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nền 49 3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi hoà tan erythromycin 51 3.1.5 Nghiên cứu các điều kiện chạy máy thích hợp 53 3.1.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của các ion gây nhiễu 63 3.1.7 Nghiên cứu xây dựng đường chuẩn 63 3.1.8 Nghiên cứu lựa chọn quy trình trích ly mẫu 66 3.2 Các thông số thẩm định phương pháp 67 3.2.1 Khoảng tuyến tính 67 3.2.2 Giới hạn phát hiện 67 3.2.3 Độ đúng, độ chính xác, hiệu suất thu hồi 67 3.2.4 Đánh giá khả năng nhận danh erythromycin A với các kháng sinh khác 68 3.2.5 So sánh đối chứng kết quả SWV với LC-MS/MS 76 3.2.6 So sánh hiệu quả kinh tế giữa SWV với các phương pháp khác 78 3.3 Ứng dụng phân tích erythromycin trên các mẫu thực tế tôm, cá tại các địa phương 78 3.3.1 Tôm càng xanh 79 3.3.2 Cá rô phi 79 vii 3.4 Xác định quy luật chuyển hóa sinh học và đào thải kháng sinh erythromycin trên cơ thể thủy sản khi nuôi 81 3.4.1 Đào thải erythromycin A trong cơ thịt thuỷ sản 81 3.4.2 Chuyển hoá sinh học của kháng sinh gốc 85 KẾT LUẬN 91 KIẾN NGHỊ 93 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 95 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Công thức cấu tạo của erythromycin 8 Hình 1.2: Chuyển hoá sinh học các dẫn xuất erythromycin 10 Hình 1.3: Nguyên lý khái quát của kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm. 25 Hình 1.4: Nguyên lý khái quát của kỹ thuật Stripping sóng vuông trên cực giọt chậm 27 Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu phân tích erythromycin 31 Hình 3.1: Các nhóm chức trong công thức cấu tạo của erythromycin 40 Hình 3.2: Phổ erythromycin ghi 5 lần trong nền đệm Amoni axetat 0,1 M; pH 8,0 41 Hình 3.3: Phổ erythromycin trên nền Natri axetat 0,1M 43 Hình 3.4: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Amoni axetat 0,1M 44 Hình 3.5: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Citrat – Phosphat 0,1M 45 Hình 3.6: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Borax 0,1M 46 Hình 3.7: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Tris 0,1M 46 Hình 3.8: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Amoni axetat pH 8,0 50 Hình 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nền Amoni axetat đến cường độ dòng của erythromycin A 50 Hình 3.10: Phổ erythromycin ghi 5 lần khi dùng dung môi hòa tan 52 Hình 3.11: Phổ erythromycin theo chiều quét 53 Hình 3.12: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở V start 54 Hình 3.13: Ảnh hưởng của V start đến cường độ dòng của erythromycin A 55 Hình 3.14: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở V step 56 Hình 3.15: Ảnh hưởng của V step đến cường độ dòng của erythromycin A 56 Hình 3.16: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở V pulse 57 Hình 3.17: Ảnh hưởng của V pulse đến cường độ dòng của erythromycin A 58 Hình 3.18: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở T drop = 1.000 ms 59 Hình 3.19: Ảnh hưởng của T drop đến cường độ dòng của erythromycin A 59 Hình 3.20: Phổ erythromycin ghi 5 lần với T electrolise 60 Hình 3.21: Ảnh hưởng của T electrolise đến cường độ dòng của erythromycin A 61 Hình 3.22: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở V electrolise 62 [...]... yêu cầu trên, chúng tôi đã chọn đề tài Nghiên cứu định lượng kháng sinh Erythromycin trong tôm, cá bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm và khả năng đào thải nhằm tìm 1 hướng đi mới trong kiểm soát dư lượng kháng sinh góp phần đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm 2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Một là, trên thiết bị ANALYZER SQF 505 do Việt Nam sản xuất xây dựng được phương pháp phân tích erythromycin. .. ở Việt nam và trên thế giới tiến hành nghiên cứu khả năng sử dụng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm để phân tích định tính và định lượng kháng sinh eythromycin trong các đối tượng mẫu thủy sản là cá rô phi và tôm càng xanh 2 Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng trong dung dịch đệm vùng kiềm nhẹ, erythromycin cho một sóng khử rõ và ổn định ở vùng thế khoảng -1,4 V Có thể dùng sóng này cho... Tùy cách đặt thế, cách đo dòng, quá trình tiến hành điện phân, hình thức cực được sử dụng trong thực tế là: dùng,…mà có những kỹ thuật Von-ampe khác nhau Các kỹ thuật Von-ampe thường  Cực phổ cổ điển  Cực phổ xung vi phân  Cực phổ sóng vuông  Cực phổ sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm  Ghép nối các kỹ thuật Stripping với các kỹ thuật trên a) Cực phổ cổ điển: Cực phổ cổ điện dựa trên sự nghiên. .. ứng dụng kỹ thuật Von- 21 ampe để định lượng erythromycin; Chưa có bất kỳ công trình nào nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm dùng để định lượng erythromycin 1.3.3 Kỹ thuật phân tích Von-ampe Von-ampe là các kỹ thuật phân tích điện hóa dựa trên nghiên cứu quan hệ đường Dòng - Thế khi tiến hành điện phân chất cần phân tích trong những điều kiện đặc biệt 1.3.3.1 Các dạng... giới hạn định lượng Tổng quan tài liệu về việc nghiên cứu phương pháp xác định erythromycin (bảng 1.4), thấy rằng: Chưa có công bố nào của các tác giả trong nước nghiên cứu về quá trình định lượng erythromycin bằng kỹ thuật cực phổ sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm; Các công bố ở nước ngoài cho tới nay chủ yếu là các phương pháp ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ; Có rất ít nghiên cứu ứng... dụng kháng sinh liên tục trong một thời gian khá dài Điều này do ý thức tự phát, hoàn toàn không có những qui định ràng buộc nào về thời gian sử dụng và loại kháng sinh sử dụng 1.1.2 Ảnh hưởng của kháng sinh tồn dư đến chất lượng thực phẩm Do việc sử dụng kháng sinh một cách bừa bãi, bản thân một số loại kháng sinh có thể gây những hậu quả xấu cho năng suất chăn nuôi trong việc sử dụng kháng sinh. .. 5 Erythromycin A khi vào cơ thể tôm cá có sự chuyển hoá sinh học sang các dẫn xuất khác như erythromycin C, E, F Từ đây đưa ra được giả thuyết giải thích cơ chế chuyển hoá sinh học erythromycin trong tôm càng xanh, cá rô phi khi nuôi  Ý nghĩa thực tiễn: 1 Đã nghiên cứu xây dựng thành công quy trình phân tích định tính và định lượng erythromycin trong tôm càng xanh và cá rô phi bằng kỹ thuật sóng vuông. .. Kibwage đã nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế trên vi khuẩn gram [+] và gram [-] của erythromycins A, B, C, và D Thí nghiệm được tiến hành trên 21 loài vi khuẩn gram [+] và 15 loài vi khuẩn gram [-] Kết quả thấy erythromycin B có khả năng ức chế vi khuẩn kém hơn so với erythromycin A, khả năng ức chế vi khuẩn của erythromycin C và D chỉ bằng 50% erythromycin A [4] 1.2.2 Chuyển hóa sinh học của erythromycin. .. dùng hiệu ứng này để tiến hành phân tích erythromycin ở các nồng độ rất thấp bằng kỹ thuật stripping hấp phụ trên cực giọt chậm hay cực ngồi, cực treo 4 Đã nghiên cứu và chọn được dung dịch nền thích hợp, các thông số chạy máy tối ưu, quy trình chuẩn bị mẫu đo hợp lý để phân tích erythromycin trong các mẫu tôm càng xanh, cá rô phi có kết quả tin cậy Các số liệu đã được so sánh với kỹ thuật phân tích truyền... được bán trên thị trường không ít loại không đảm bảo hàm lượng và chất lượng cho nên việc điều trị và phòng bệnh ít hiệu quả Người chăn nuôi phải dùng nhiều loại kháng sinh khác nhau để phòng và chữa bệnh Phần lớn phác đồ trị liệu là do kinh nghiệm hoặc do sự quảng cáo của các nhà sản xuất và nhà phân phối Người nuôi đã biết cách chuyển hướng sử dụng kháng sinh, từ kháng sinh cấm sử dụng sang kháng sinh