1.3.1.1 Nguyên lý ELISA
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật phân tích sinh hóa dựa trên phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên. Người ta tạo ra kháng nguyên từ chất cần phân tích. Dùng nó gây miễn dịch lên một động vật có xương sống. Hệ thống miễn dịch của động vật thí nghiệm này sẽ phản ứng và tạo ra kháng thể chuyên biệt để chống lại chất đích đã được đưa vào cơ thể chúng. Từ máu động vật, kháng thể đặc hiệu này sẽ được tách chiết, tinh sạch và sử dụng để chế tạo các kit ELISA dùng trong phân tích để phát hiện và định lượng chất đích theo nguyên tắc miễn dịch.
1.3.1.2 Phân tích erythromycin bằng phương pháp ELISA
Các giếng được phủ qua đêm bằng cách ủ ở 4oC với 200 µl phức erythromycin- BSA trong dung dịch đệm carbonate pH 9,6 (1,69 g; 2,86 g NaHCO3 trong 1000 ml nước cất) ở tỉ lệ pha loãng 1:4500, sau đó được khóa “block” trong 1 giờ ở 37 oC với
dung dịch có chứa 3% sữa khô. pH của dung dịch block được điều chỉnh lại về 7,2 trước khi sử dụng.
Mỗi giếng được thêm 100 µl dung dịch chuẩn hoặc mẫu (lặp lại 3 lần), tiếp theo là thêm 100 µl Mab kháng – erythromycin được pha loãng ở tỉ lệ 1:60000. Quá trình cạnh tranh xảy ra trong 2 giờ ở 37oC. Giữa các bước (phủ, blocking và cạnh tranh), tiến hành 3 chu kỳ rửa sử dụng 0,05% Tween 20 trong PBS. Mỗi dung dịch, ngoại trừ dung dịch để phủ, được chuẩn bị trong PBS. Cuối cùng, 200 µl dung dịch nền (2 x 10-4 mol/l TMB + 10-3mol/l H2O2) được thêm vào mỗi giếng, phản ứng enzyme được dừng lại sau 30 giây thêm 50 µl NaN35 mM [21].
1.3.1.3 Nhận xét phương pháp ELISA dùng định lượng erythromycin
- Ưu:Có thể phân tích nhiều mẫu cùng một lúc, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp trong đánh giá sàng lọc.
- Nhược: Đôi khi cho kết quả âm tính giả, dương tính giả. Thời gian chuẩn bị mẫu và phân tích còn quá dài. Chưa có khả năng tái khẳng định cấu trúc của erythromycin.
1.3.2 Phương pháp LC-MS/MS định lượng erythromycin
1.3.2.1 Chuẩn bị mẫu
Quá trình chuẩn bị mẫu bao gồm các bước chiết, làm sạch, làm giàu trước khi đưa vào phân tích bằng LC-MS. Chiết phase rắn (SPE) và chiết lỏng – lỏng (LLE) là kỹ thuật chiết dùng phổ biến nhất. Ngoài ra còn có chiết lỏng áp suất (PLE), vi chiết phase rắn (SPME), phân tán nền phase rắn (MSPD) cũng được dùng.
a) Nền mẫu thực phẩm
Đối với nền mẫu động vật ở dạng mật ong, mô thịt, trứng, sữa, quá trình chuẩn bị bao gồm các bước loại protein, mỡ, đường, yếu tố gây nhiễu. Tùy theo bản chất của mẫu và khối lượng mẫu (1-5 g) mà dùng các cột chiết khác nhau như SPE, LLE, MSPD. Ưu điểm của cột chiết SPE là dịch chiết của mẫu được làm sạch, nên các yếu tố gây nhiễu bị loại bỏ, các hiệu ứng nền được giảm thiểu. Hơn nữa, chất phân tích được làm giàu đến mức đạt được độ nhạy với LoD dưới ppb. Các kiểu cột SPE dùng
chiết erythromycin gồm cột HLB (cân bằng dầu – nước), Strata – X, Bond Elut C18, Bond Elut diol, Bond Elut SCX. Trong đó cột HLB, được làm từ copolymer của N- vinylpyrrolidone ưa nước và divinylbenzene ưa dầu, được ưa chuộng do có thời gian lưu tốt và hiệu suất thu hồi cao đối với cả các chất phân cực và không phân cực. Cột Strata – X có chức năng tương tự cột HLB, và cũng cho hiệu quả tương đương. Erythromycin được hấp thu tốt trên cột HLB và rửa giải bằng methanol 40%, hao hụt erythromycin không đáng kể. Nhìn chung, SPE được thao tác gián đoạn bằng cách cho dịch mẫu lỏng đi qua cột (30 – 500 mg) được đặt trên 1 cột chân không. Erythromycin được giữ lại trên cột. Rửa cột với nước hoặc đệm, cuối cùng rửa giải erythromycin với vài ml dung môi hữu cơ (methanol hoặc acetonitrile) để dễ bay hơi và làm giàu đến 1 thể tích phù hợp để tiêm vào LC-MS [22].
LC-MS được nối trực tiếp với SPE bằng kỹ thuật chuyển cột. Mẫu thịt (1 g) sau khi được đồng hóa sẽ được loại protein bằng 5ml acetonitrile. Sau ly tâm, đệm Tris (0,1 M; pH 7) có chứa 5% acetonitrile được thêm vào phần dịch nổi. Hỗn hợp sau đó được làm khô nhẹ dưới dòng khí nitơ để loại acetonitrile. Dư lượng erythromycin lúc đó được hoàn nguyên với cùng đệm Tris. Sau khi loại béo bằng hexane, dịch chiết sẳn sàng đi vào cột SPE nối trực tiếp với LC-MS. Phương pháp đạt được LoD ≤ 0,1 ppb. SPE trực tiếp sẽ giúp phân tích được nhiều mẫu trong thời gian ngắn. Tuy nhiên là cột giảm dần khả năng hấp phụ, nguy cơ nhiễm chéo, nhất là sau khi chiết mẫu có nồng độ erythromycin cao. Ngoài ra, độ bền của chất phân tích trong dịch chiết mẫu trước khi đưa vào SPE trực tiếp cũng là điều đáng quan tâm do thời gian chờ kéo dài trong auto- sampler, một số chất như tetracyclines bị phân hủy nhanh chóng. Tuy nhiên, erythromycin tương đối bền ở pH 7 nên phù hợp cho SPE trực tiếp [22].
Kết hợp SPE và LLE chiết erythromycin được cho là hữu hiệu. Để phân tích erythromycin trong thịt cá hồi, đệm Amoni formate (10 mM) được ưa dùng hơn dung môi hữu cơ để dùng trong bước đầu tiên của quá trình chiết. Ở một trường hợp ứng dụng khác, đệm phosphat được thêm vào mẫu đã được xay nhuyễn, hỗn hợp được phân đoạn với chloroform để thực hiện chiết bằng LLE, tiếp theo là chiết bằng Bond Elut diol để chiết erythromycin trong mẫu thịt bò [22].
Kỹ thuật phân tán nền phase rắn (MSPD) nhìn chung là rẻ tiền và thân thiện với môi trường bởi vì nước được dùng làm dung môi chiết để chiết erythromycin trong sữa
và yoghurt. Mẫu (1,5 mL hoặc g) được phân tán vào trong vật liệu hỗ trợ rắn (ví dụ cát 5-6 g) rồi trộn. Hỗn hợp được nhồi vào cột MSPD. Sau đó erythromycin được rửa giải bằng nước 70oC, pH 4,6 đã được acid hóa bằng acid formic; dịch chiết sau đó được chỉnh về pH 6 trước khi tiêm vào LC-MS. Phương pháp cho độ nhạy cao với LoD ở mức dưới ppb [22].
b) Nền mẫu sinh phẩm
Nền mẫu sinh phẩm bao gồm huyết tương, nước bọt, mô,…. Có kích thước mẫu tương đối nhỏ, thường 50 – 500 µL. Vì thế chiết lỏng – lỏng hoặc phân đoạn là kỹ thuật chiết đơn giản, nhanh và được thực tế áp dụng. Mẫu trước tiên được pha loãng với đệm natri carbonate hoặc phosphat, tiếp theo chiết thông qua LLE với methyltert- butyl ether, với hỗn hợp methyl tert-butyl ether và hexane (50:50, v/v), ethyl axetat, hỗn hợp hexane và ethyl axetat (50:50, v/v), hỗn hợp ethyl axetat và isopropanol (95:5, v/v). Sau khi ly tâm và loại dung môi hữu cơ, dư lượng được hoàn nguyên với 1 hỗn hợp gồm nước, methanol hoặc acetonitrile để phân tích bằng LC-MS [22].
c) Nền mẫu môi trường
Do nền môi trường chứa rất nhiều tạp nên việc chiết erythromycin khá phức tạp, phải dùng đến HLB. Các phương pháp chiết truyền thống như LLE được thay bằng SPE. Cần phải lấy 1 lượng mẫu lớn để đạt được LoD thích hợp. Mẫu được tiền xử lý bằng cách lọc qua lưới lọc bằng sợi thủy tinh (0,2 µm), điều chỉnh pH (<7 hoặc thậm chí là tới 3), bổ sung tác nhân tạo phức trước khi vào bước SPE để tránh làm tắc cột và nhằm tăng hiệu suất chiết. Tuy nhiên vì erythromycin không bền ở pH acid, nó dễ dàng bị phân hủy thành erythromycin-H2O với việc mất đi 1 phân tử nước ở pH acid. Vì vậy rất nhiều nghiên cứu cho thấy erythromycin được xác định ở dạng erythromycin-H2O ởm/z716. Erythromycin khi vào cơ thể thủy sản nuôi, đi qua hệ dạ dày pH acid, thải ra ngoài theo phân và tồn lưu trong môi trường ở dạng erythromycin- H2O [22].
Các mẫu môi trường dạng rắn như đất, trầm tích, bùn thì được chiết với đệm amoni hydroxide (pH 10), phosphat (pH 6). Vì mẫu đất, trầm tích, bùn rất phức tạp nên cần thêm 1 bước làm sạch [22].
Sau khi tiền xử lý, dịch chiết được cho vào cột SPE để làm sạch và làm giàu để đạt LoD ở mức ng/L hoặc ppb. Rất nhiều loại cột SPE khác nhau được dùng như HLB,
Strata-X, LiChrolute EN, LiChrolute RP-18, diol, Isolut ENV+, SAX, và Strata-X-C. Trong đó HLB được dùng nhiều nhất.
Việc sử dụng vi chiết phase rắn (SPME) là kỹ thuật tương đối mới, đơn giản, hiệu quả tiết kiệm để chiết erythromycin từ các mẫu nước thải. SPME bao gồm 1 sợi quang với phase tĩnh là lỏng hoặc rắn để hấp phụ chất phân tích. Chất phân tích được giải hấp phụ bằng cách ngâm sợi quang vào trong dung môi hữu cơ. Phương pháp đạt được LoD 2,8 ng/L. SPME tỏ ra hợp lý hơn phương pháp truyền thống SPE để định lượng erythromycin trong môi trường nuôi thủy sản. Tuy nhiên nó có nhược điểm là LoD cao hơn và độ chính xác kém hơn là SPE [22].
1.3.2.2 Phân tích erythromycin bằng sắc ký
Phân tách erythromycin bằng sắc ký lỏng sử dụng cột sắc ký phase đảo, dùng cột silica C18. Bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép gần đây UPLC dùng cột C18 có kích thước hạt dưới 2µm. Đặc biệt khi được ghép nối với đầu dò khối phổ MS sẽ cho độ phân giải, tốc độ và độ nhạy cao [22].
Thành phần, nồng độ và pH phase động rất quan trọng để ion hóa và phân tách sắc ký. Acetonitrile và methanol là 2 dung môi hữu cơ phổ biến nhất được dùng làm phase động cho LC và UPLC. Acid formic (0,1%) hoặc amoni axetat (10 – 20 mM) thường được làm thành phần bổ sung cho phase động. Heptafluorobutyric acid (HFBA, 0,04%), trifluoroacetic acid (TFA; 0,02-0,1%) hoặc non-afluoropentanoic acid (NFPA, 1mM) được dùng để cải thiện hình dạng peack sắc ký để kéo dài thời gian lưu của chất phân tích [22].
1.3.2.3 Khối phổ
Phân tích khối phổ (phân tích “tỉ lệ khối lượng theo điện tích (m/z) của ion“) là kỹ thuật phân tích dựa trên sự bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích, hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc bằng các phân tử mang năng lượng cao (như va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa proton, bắn phá ion, ion hóa trường...). Ion phân tử và các mảnh ion có khối lượng -> số khối z=m/e (khối lượng ion/điện tích).
Hai kỹ thuật ion hóa phổ biến nhất được dùng trong LC-MS là ion hóa tia điện tử (ESI) và ion hóa bằng hóa chất ở áp suất khí quyển (APCI). ESI là quá trình mà các ion trong dung dịch được chuyển thành phase khí thông qua 1 cơ chế bốc hơi và giải hấp ion. APCI là kỹ thuật ion hóa mà chất phân tích được ion hóa thông qua các phản ứng ion và phân tử, xảy ra ở áp suất không khí. ESI áp dụng được cho các chất phân cực và dung môi không phân cực, có khoảng khối lượng rất rộng. Mặc dù APCI được chứng minh giúp giảm các hiệu ứng nền, nhưng ESI vẫn được ưa chuộng hơn trong khi phân tích erythromycin bằng LC-MS. Một kỹ thuật khác tương đối mới là ion hóa quang ở áp suất không khí (APPI). Nguyên lý cơ bản của APPI cho sự hình thành 1 ion mang điện là thông qua quá trình ion hóa quang học, chuyển proton và trao đổi điện tích. APPI có khoảng ion hóa tương tự như trong APCI, và được mở rộng sang vùng các chất có độ phân cực thấp. Vì thế, APPI được áp dụng khá nhiều cho các chất không phân cực hơn là ESI và APCI [22].
Erythromycin thuộc nhóm kháng sinh macrolides, phân tử có 1 nguyên tử nitơ dễ bị proton hóa để thành các ion mang điện tích đơn ([M+H]+).
Hiệu ứng nền là 1 trở ngại trong phân tích định lượng bằng LC-MS, đặc biệt là khi sử dụng ESI. Nền có thể làm tăng hoặc kềm hãm quá trình ion hóa chất phân tích, thay đổi giữa mẫu này với mẫu khác. Hiệu ứng nền có thể ước lượng hoặc định lượng được bằng cách so sánh hiệu ứng của chất phân tích trong dung môi hoặc đệm với hiệu ứng của chất phân tích khi có nền mẫu. Chuẩn đồng phân đánh dấu bền, đường cong chuẩn đã làm phù hợp nền, phương pháp thêm chuẩn là những giải pháp để giảm thiểu các hiệu ứng nền và làm tăng độ đúng của phương pháp. Do thiếu các chuẩn được đánh dấu bằng deuterium nên phải dùng đến các đồng phân như roxithromycin làm nội chuẩn, để giảm thiểu hiệu ứng nền. Phương pháp thêm chuẩn tỏ ra hiệu quả để bù cho các hiệu ứng nền. Nhưng quy trình trở nên dài dòng vì đòi hỏi chuẩn bị mẫu thêm. [13C2]-erythromycin A có thể được tận dụng làm nội chuẩn. Tuy nhiên có hiện tượng gây nhiễu (11,5%) từ [13C2]-erythromycin A (m/z 736) xuất hiện tự nhiên trong erythromycin A trên diện tích peak của nội chuẩn. Để giải quyết, [13C4]-erythromycin (m/z 738) thường thấy trong [13C2]-erythromycin A, được dùng như chất tham chiếu chuẩn trong khi định lượng. Bằng cách này, nhiễu trên nội chuẩn được giảm thiểu đến
mức thấp nhất của [13C4]-erythromycin A (m/z 738) trong erythromycin A (m/z 734) [22].
Bảng 1.4:Một số công trình nghiên cứu phương pháp phân tích erythromycin
Năm Tác giả Mẫu Phương Pháp LOD/LOQ
(ppb) 1994 Zierfels và cộng sự [23] Trứng, thịt, sữa, gan, thận ngan HPLC <10 * 1998 Li và cộng sự [24] Huyết thanh người LC-MS/MS 0,5 **
2000 Dreassi và cộng sự [25] Huyết thanh bò,
heo, gia cầm HPLC-UV 250
** Sữa HPLC-UV 25** Thận, gan, thịt, mỡ bò, heo, gia cầm HPLC-UV 125**
2000 Wang và cộng sự [26] Thuốc, nước tiểu
người ASV-PGCE 5 * 2001 Leal và cộng sự [27] Thịt gà LC-FL 400* 2001 Draisci và cộng sự [21] Thịt bò ELISA 0,4* Thịt và gan bò LC-MS/MS 50** Thận bò LC-MS/MS 80**
2003 Billedeau và cộng sự [28] Cá hồi LC – ESI/MS 5*, 16**
2003 Horie và cộng sự [29] Thịt và thuỷ sản LC- ESI-MS 10*
2003 Schlusener và cộng sự [30] Phân HPLC-MS/MS 0,4-11,0*
2005 Xiao và cộng sự [31] Thuốc
(propionate, base)
HPLC–ESI-MS 1*
2006 Deubel và cộng sự [32] Mẫu cơ thịt LC-MS/MS 0,25*
2006 Yun-Hua và cộng sự [33] Cá rô phi HPLC 400*
2006 Wang và cộng sự [34] Sữa bò tươi LC-ESI/MS/MS 0,07*
2006 Tang và cộng sự [35] Thịt LC-MS/MS 0,1*
2007 Deng và cộng sự [36] Huyết thanh
chuột ECL 0,35
*
2008 Berrada và cộng sự [37] Thịt, thuỷ sản LC-ESI/MS 25*
2009 Granja và cộng sự [38] Mật ong LC-MS/MS 1,27*; 5,0**
2009 Norouzi và cộng sự [39] Huyết thanh,
nước tiểu người CV 2,4
*; 7,0**
*LOD: giới hạn phát hiện , ** LOQ: giới hạn định lượng
Tổng quan tài liệu về việc nghiên cứu phương pháp xác định erythromycin (bảng 1.4), thấy rằng: Chưa có công bố nào của các tác giả trong nước nghiên cứu về quá trình định lượng erythromycin bằng kỹ thuật cực phổ sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm; Các công bố ở nước ngoài cho tới nay chủ yếu là các phương pháp ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ; Có rất ít nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Von-
ampe để định lượng erythromycin; Chưa có bất kỳ công trình nào nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm dùng để định lượng erythromycin.
1.3.3 Kỹ thuật phân tích Von-ampe
Von-ampe là các kỹ thuật phân tích điện hóa dựa trên nghiên cứu quan hệ đường Dòng - Thế khi tiến hành điện phân chất cần phân tích trong những điều kiện đặc biệt.
1.3.3.1 Các dạng von-ampe
Tùy cách đặt thế, cách đo dòng, quá trình tiến hành điện phân, hình thức cực dùng,…mà có những kỹ thuật Von-ampe khác nhau. Các kỹ thuật Von-ampe thường được sử dụng trong thực tế là:
Cực phổ cổ điển Cực phổ xung vi phân Cực phổ sóng vuông
Cực phổ sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm Ghép nối các kỹ thuật Stripping với các kỹ thuật trên
a) Cực phổ cổ điển:
Cực phổ cổ điện dựa trên sự nghiên cứu quan hệ dòng một chiều và thế một chiều khi tiến hành điện phân chất cần phân tích trong một dung dịch nền chứa các chất điện ly thích hợp với cực làm việc là cực giọt thủy ngân và một cực so sánh có thế trong đổi.
Trong một thời gian khá dài từ nửa cuối thế kỷ XX, cực phổ cổ điển, đo quang, và quang phổ UV/VIS là những kỹ thuật chính dùng trong nhiều phòng thí nghiệm liên quan tới việc phân tích các chất vô cơ và hữu cơ. Kỹ thuật quang được dùng rộng rãi hơn nhờ thao tác đơn giản, máy móc không phức tạp. Người ta dùng kỹ thuật cực phổ