- Thiết bị Analyzer SQF-505 của Trung Tâm Nhiệt Đới Việt Nga - chi nhánh phía nam.
- Bộ chiết pha rắn SPE của hãng Phenomenex Code:8B-S001-FBJ, cột cân bằng nước - dầu HLB của hãng Waters.
- Các dụng cụ phân tích thông thường khác (xem phụ lục bảng 3.1).
2.1.3 Hóa chất
- Erythromycin A, chloramphenicol, florfenicol, furazolidone, ciprofloxacin, enrofloxacin, danofloxacin chuẩn của hãng Sigma Aldrich, Fluka Chemical có độ tinh khiết > 98%.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Sơ đồ tiến trình nghiên cứu
Tiến trình nghiên cứu của luận án sẽ tập trung vào 2 mảng nội dung lớn:
- Nội dung thứ I:Nghiên cứu các điều kiện cơ bản của kỹ thuật stripping sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm để định lượng erythromycin, trong đó quan tâm đến việc lựa chọn loại dung dịch nền, pH dung dịch nền, nồng độ dung dịch nền, dung môi hoà tan erythromycin, các thông số chạy máy ở chế độ stripping sóng vuông, các yếu tố gây nhiễu nền, xây dựng đường chuẩn, lựa chọn quy trình trích ly mẫu. Sau đó tiến hành đánh giá thẩm định hiệu năng phương pháp như xác định khoảng đo tuyến tính, giới hạn phát hiện trên dung dịch chuẩn và trên nền mẫu, độ chính xác, độ đúng, hiệu suất thu hồi, khả năng nhận danh, so sánh đối chứng với phương pháp LC-MS/MS. Cuối cùng là lấy mẫu tôm càng xanh, cá rô phi thực tế tại 10 tỉnh ĐBSCL để đánh giá bức tranh thực trạng nhiễm erythromycin.
- Nội dung thứ II: Các thí nghiệm được bố trí ở điều kiện hoàn toàn theo điều kiện nuôi thực tế, được khảo nghiệm ở 2 huyện của Tỉnh Sóc Trăng. Theo dõi quá trình đào thải theo thời gian khi kháng sinh này đi vào cơ thể tôm càng xanh và cá rô phi bằng con đường thức ăn từ đó rút ra quy luật thời gian ngưng thuốc an toàn trước thu hoạch. Song song đó cũng theo dõi quá trình chuyển hoá erythromycin A khi ở trong cơ thể của 2 loài thuỷ sản này, đánh giá xem liệu rằng kháng sinh erythromycin A có chuyển hoá sang các dẫn suất erythromycin B, C, D, E, F hay không; và nếu có thì các dẫn suất này có tồn dư ở mức nguy hại đối với an toàn của thực phẩm hay không.
Hình 2.1: Sơ đồ tổng hợp nội dung nghiên cứu
Quy trình trích ly mẫu Dựng đường chuẩn Yếu tố gây nhiễu nền
Độ chính xác, độ đúng, hiệu suất thu
hồi
Khả năng nhận danh So sánh đối chứng
SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM
ĐÀO THẢI, CHUYỂN HOÁ SINH HỌC ERYTHROMYCIN
ĐÀO THẢI
Stripping sóng vuông Dung môi hoà tan Loại và pH dung dịch
nền
Giới hạn phát hiện Khoảng tuyến tính
Cá rô phi
Tôm càng xanh Tôm càng xanh Cá rô phi
THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP CÁC ĐIỀU KIỆN
THÍCH HỢP
THỰC TRẠNG NHIỄM
ERYTHROMYCIN CHUYỂN HOÁ
Nồng độ dung dịch nền
2.2.2. Phương pháp thực nghiệm
2.2.2.1 Khảo sát các điều kiện thích hợp cho việc định lượng erythromycin trên thiết bị Analyzer SQF - 505
a) Khảo sát và lựa chọn dung dịch nền
Khảo sát lần lượt từng loại dung dịch nền CH3COONH40,1 M; CH3COONa 0,1 M; Borate 0,1 M; Citrat – Phosphat 0,1 M; Đệm Tris 0,1 M có dãy pH 5,0-6,0-7,0-8,0- 9,0-10,0. Chọn dung dịch đệm thích hợp nhất.
b) Khảo sát chọn nồng độ dung dịch nền
Sau khi tìm được dung dịch nền ở pH thích hợp, khảo sát ở các nồng độ dung dịch là 0,05 M; 0,10 M; 0,15 M; 0,20 M; 0,25 M để chọn nồng độ thích hợp nhất.
c) Khảo sát chọn dung môi hòa tan erythromycin
Khảo sát các dung môi dùng hòa tan erythromycin: Methanol, Ethyl axetat, Acetonitril. Chọn dung môi thích hợp nhất.
d) Nghiên cứu kỹ thuật đo Stripping SWV
Chiều quét:
o Khảo sát quét xuôi: 0 mV đến -1.800 mV
o Khảo sát quét ngược: -1.800 mV đến 0 mV Vstart:khảo sát Vstarttừ -400 mV đến -1.100 mV Vstep:khảo sát Vsteptừ 2 mV đến 10 mV
Vpulse:khảo sát Vpulsetừ 10 mV đến 40 mV Tdrop:khảo sát Tdroptừ 1.000 ms đến 5.000 ms Telectrolise:khảo sát Telectrolisetừ 3 s đến 6 s
Velectrolise:khảo sát Velectrolise: -400 mV đến -1.400 mV
e) Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố gây nhiễu nền
Các ion cần khảo sát K+, Na+, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Fe3+, Cu2+, Cl-, I-, SO42-, HPO42-ở nồng độ 1 ppm, 2 ppm, 3 ppm, 4 ppm, 5 ppm.
f) Xây dựng đường chuẩn erythromycin trên dung dịch nền
Cố định dung dịch nền ở pH và nồng độ thích hợp. Cố định dung môi thích hợp hòa tan erythromycin. Cố định các thông số chạy máy thích hợp.
Dựng đường chuẩn erythromycin ở các giá trị 50 ppb, 100 ppb, 200 ppb, 300 ppb, 400 ppb, 500 ppb, 600 ppb, 700 ppb, 800 ppb, 900 ppb.
Cách chuẩn bị: cân 0,025 g erythromycin + 100 mL dung môi Được 100 mL dung dịch erythromycin 250 ppm.
Bảng 2.1:Xây dựng đường chuẩn trên dung dịch nền
Điểm chuẩn (ppb) 50 100 200 300 400 500 600 700 800 900
V (µL) chuẩn 250 ppm 5 10 20 30 40 50 60 70 80 90
V (ml) nền 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
g) Khảo sát lựa chọn quy trình trích ly mẫu
Qui trình I:
Dung dịch Amoni formate 10 mM, pH 6,3-6,6 dùng để chiết mẫu được chuẩn bị: hòa tan 0,63 g Amoni formate trong 1 L nước cất. Các bước làm sạch trong quá trình chiết mẫu có sử dụng dung môi methanol (MeOH) và acetonitrile (MeCN) (loại J. T. Baker, LC).
Xay nhuyễn mẫu, cân 5 g rồi cho vào ống nhựa polypropylene ly tâm 50 mL. Mẫu được chiết với 10 mL Amoni formate 10 mM trong 1 phút. Sau đó ly tâm 5.000 rpm trong 10 phút. Phần dịch trong được lọc tiếp qua sợi thủy tinh để loại bỏ tạp có kích thước lớn. Rửa cặn rắn bằng 10 mL đệm Amoni formate 10 mM. Gộp phần dịch chiết và phần rửa thu được tổng thể tích dịch là 20 mL. Cột 60 mg Oasis HLB 3 cm3 được hoạt hóa bằng cách rửa giải bằng 3 mL MeOH tiếp theo là 3 mL nước cất để sẳn sàng cho mẫu qua cột. 20 mL dịch mẫu được điều chỉnh về pH 7,0-7,2 rồi cho qua cột 3 cm3HLB kéo chân không ở tốc độ 2 mL/phút. Sau khi cho 20 mL dịch mẫu qua, cột HLB được rửa bằng 2 mL nước cất. Tiếp theo là rửa 3 mL 20% MeOH/nước. Cột HLB được làm khô trước khi rửa giải cuối cùng. 1 mL 100% MeOH được rửa ở tốc độ 1 mL/phút. Dịch chiết sau khi tinh sạch sẽ được làm khô bằng nitơ rồi hòa với dung dịch đệm Amoni axetat 0,1 M; pH 8,0 để phân tích [28].
Qui trình II:
Erythromycin chuẩn gốc (1 mg/ml) được chuẩn bị bằng cách cân 25 mg erythromycin tinh khiết dạng bột hòa với 25 ml methanol. Chuẩn này được bảo quản trong tối ở 40C. Chuẩn làm việc được chuẩn bị bằng cách pha loãng với đệm
KH2PO4/H3PO420mM (pH 3,5)/acetonitrile (80:20, v/v). Các chuẩn làm việc này cũng được bảo quản ở 40C.
Cân (5,00±0,02 g) mẫu xay nhuyễn vào ống nhựa ly tâm propylene. Thêm 20mL đệm EDTA–McIlvaine’s vào ống ly tâm, trộn mẫu bằng máy đánh siêu âm rồi ly tâm 5.000 rpm trong 5 phút. Phần cặn được tiếp tục trích 2 lần với 20 và 10 mL đệm EDTA–McIlvaine. Tất cả phần dịch trong chiết được sẽ cho qua giấy lọc Whatman No.1 rồi xử lý tiếp qua bước chiết SPE [37].
Cột 500 mg Oasis HLB cartridges được xử lý để ổn định trước với 5 ml MeOH và 2ml nước cất. Phần dịch mẫu chiết (50 ml) được cho qua cột ở tốc độ 5 ml/phút. Cột được rửa tạp bằng 10 ml nước cất. Rửa giải erythromycin bằng 5ml methanol. Dịch chiết erythromycin được làm khô bằng khí nitơ và sau đó hoàn nguyên với dung dịch đệm Amoni axetat 0,1 M, pH 8,0 rồi đem đo trên Analyzer SQF 505 ở chế độ stripping.
Qui trình III:
Cân 5 g mẫu trắng hoặc mẫu đã được thêm chuẩn, thêm 25 ml dung dịch đệm Tris (0,1 M; pH 10,5) rồi dập mẫu trong 15 phút. Sau đó ly tâm lạnh ở 40C trong 10 phút, tách phần dịch trong bên trên vào ống nhựa polypropylene, phần cặn được chiết tiếp lần 2 với 25 ml đệm Tris.
Thêm 600 µl Acetic acid và 5 ml đệm Natri tungstate (0,15 M) được thêm vào để kết tủa protein. Sau khi để yên 1 giờ ở 40C, mẫu được ly tâm 3000 g trong 10 phút. Phần dịch trong phía trên được tách ra rồi lọc qua bông thủy tinh.
Cột chiết 6-cm3HLB OASIS (200 mg) được chuẩn bị và chạy ổn định trước với 10 ml methanol và 10 ml nước. Mẫu sau khi chiết sơ bộ sẽ cho đi qua cột. Tiến hành rửa tạp 2 lần bằng 20 ml dung dịch methanol - nước (5:95) và 5 ml hexane.
Sau đó, cột OASIS được làm khô chân không trong 10 phút. Rửa giải erythromycin bằng 5 ml methanol-amoni 30% (95:5, v/v) và làm khô bằng khí nitơ. Hòa tan lại erythromycin với 500 µl NH4AC-ACN (80/20 v/v), chuyển vào ống Eppendorf và ly tâm ở 3000 g trong 10 phút. Lấy phần dịch trong hòa với dung dịch đệm Amoni axetat 0,1 M; pH 8,0 đem đo trên Analyzer SQF 505 [32].
Trong nghiên cứu đã thử nghiệm thay thế các dung môi hữu cơ acetonitrile, chloroform hoặc dichloromethane bằng dung dịch đệm Tris pH 10,5 để trích ly
erythromycin. Sau đó kết tủa protein bằng Natri tungstate và làm sạch bằng cột HLB OASIS.
Qui trình IV:
Lấy 5 gam mẫu xay nhuyễn, thêm 100 ml hỗn hợp metaphosphoric acid 0,2% – methanol (6:4, v/v) để loại protein. Lọc sơ bộ. Dịch lọc đem làm khô ở 400C đến khoảng 25 ml. Cho dịch qua cột Oasis HLB. Sau đó rửa với 10 ml nước cất, rửa giải erythromycin với 5ml methanol. Dịch rửa giải được làm khô ở 400C. Cặn khô được hòa tan lại bằng 1 ml methanol nồng độ 30% [29].
Qui trình V:
Cân 5 gam mẫu xay nhuyễn + 20 ml acetonitril vào ống nhựa polypropylene, trộn đều. Ly tâm và tách thu phần dịch trong rồi làm khô. Hoàn nguyên với 20 ml đệm Citrat 0,1 M (pH 6,0). Loại béo bằng cách thêm 20 ml n-Hexan rồi ly tâm, tách thu phần dịch trong qua bước làm sạch tiếp theo.
Cột HLB được chạy ổn định trước với 5 ml đệm Citrat 0,1 M; pH 6,0. Cho mẫu lên cột, rửa bằng 2 ml nước cất, rồi tiếp 1 ml methanol. Làm khô 5 phút. Sau đó cho 5 ml đệm Phosphat pH 9,3 qua; rồi cho 3 ml methanol đi qua cột. Lấy 3 ml dịch methanol rửa giải này làm khô rồi hoàn nguyên với 2 ml đệm Phosphat 0,1 M; pH 9,3 [55].
Ở từng quy trình, tiến hành lấy 5 mẫu, chia trung bình, chọn quy trình nào thích hợp.
2.2.2.2 Các thông số thẩm định phương pháp
a) Khoảng nồng độ tuyến tính
Dựng đường chuẩn trong khoảng từ 50-900 ppb, dùng phương pháp hồi quy bình phương cực tiểu để xác định phương trình đường chuẩn Y = A.X + B, và hệ số R2 với % RSD.
b) Giới hạn phát hiện (LoD)
LoD = 3,3 (/S)
S: Độ dốc của đường chuẩn
c) Độ chính xác, độ đúng, hiệu suất thu hồi
Độ chính xác được xác định bằng cách khảo sát ở 3 nồng độ 100, 200, 300 ppb; mỗi nồng độ lặp lại 6 lần trong 1 ngày để đưa ra giá trị % RSD. Độ chính xác liên- ngày (inter-day precision) cũng được khảo sát ở 3 nồng độ 100, 200, 300 ppb; mỗi nồng độ lặp lại 6 lần, lặp lại 3 ngày liên tiếp, cũng để đưa ra cho được giá trị % RSD.
Độ đúng (accuracy) được xác định bằng cách ngoại suy cường độ dòng (lặp lại 6 lần) của 3 dung dịch chuẩn (100, 200, 300 ppb) từ đường chuẩn đã dựng. Trong mỗi nồng độ, tính toán phần trăm sai số liên quan (relevant error) và độ đúng (accuracy).
Hiệu suất thu hồi:
H = Cpt*100/ Cc
Cpt: Nồng độ erythromycin phân tích được của mẫu thêm chuẩn (ppb) Cc: Nồng độ erythromycin mẫu thêm chuẩn (ppb)
d) Khả năng nhận danh erythromycin A với các kháng sinh khác
Khảo sát sự hiện diện của lần lượt các kháng sinh chloramphenicol, florfenicol, furazolidone, ciprofloxacin, enrofloxacin, danofloxacin xem có tách biệt và nhận danh rõ so với erythromycin A.
e) So sánh đối chứng kết quả Stripping SWV với LC-MS/MS
Tôm càng xanh được nuôi đến trọng lượng thương phẩm (70 ± 5 g/con), lấy 3 mẫu và phân tích tại trung tâm kiểm định Intertek Việt Nam để dùng làm mẫu trắng “blank”. Sau đó tôm nuôi được được cho ăn erythromycin bằng con đường thức ăn; liều được cho ăn 100 mg erythromycin/kg thể trọng/ ngày; thời gian được cho ăn 7 ngày liên tiếp và tiến hành lấy mẫu sau ngày thứ 7, 8 và 9 kể từ thời điểm ngưng thuốc. Lúc này ta sẽ có 3 nhóm mẫu nhiễm erythromycin (cao, trung bình, thấp). Ở mỗi nhóm nồng độ (6 mẫu), chia làm 2 phần bằng nhau:
- Phần I: Phân tích bằng Stripping SWV (3 mẫu nồng độ thấp, 3 mẫu nồng độ trung bình, 3 mẫu nồng độ cao).
- Phần II: Gửi phân tích đối chứng bằng LC-MS/MS tại trung tâm kiểm định Intertek Việt Nam (3 mẫu nồng độ thấp, 3 mẫu nồng độ trung bình, 3 mẫu nồng độ cao).
Cá rô phi được nuôi đến trọng lượng thương phẩm (500 ± 25 g/con), lấy 3 mẫu và phân tích tại trung tâm kiểm định Intertek Việt Nam để dùng làm mẫu trắng “blank”. Sau đó cá nuôi được tiến hành được cho ăn erythromycin bằng con đường thức ăn; liều được cho ăn 100 mg erythromycin/kg thể trọng/ ngày; thời gian được cho ăn 7 ngày liên tiếp và tiến hành lấy mẫu sau ngày thứ 7, 8 và 9 kể từ thời điểm ngưng thuốc. Lúc này ta sẽ có 3 nhóm mẫu nhiễm erythromycin (cao, trung bình, thấp). Ở mỗi nhóm cho ăn (6 mẫu), chia làm 2 phần bằng nhau:
- Phần I: Phân tích bằng Stripping SWV (3 mẫu nồng độ thấp, 3 mẫu nồng độ trung bình, 3 mẫu nồng độ cao).
- Phần II: Gửi phân tích đối chứng bằng LC-MS/MS tại trung tâm kiểm định Intertek Việt Nam (3 mẫu nồng độ thấp, 3 mẫu nồng độ trung bình, 3 mẫu nồng độ cao).
2.2.2.3. Ứng dụng phương pháp phân tích khảo sát dư lượng erythromycin ở tôm, cá
Lấy các mẫu tôm càng xanh, mẫu cá rô phi đại diện ở 10 tỉnh đồng bằng sông Cửu Long (mỗi tỉnh lấy mẫu ở 3 huyện, mỗi huyện lấy 5 mẫu, mỗi mẫu ít nhất 500 g). Mẫu được thu tỉa bằng cách dùng chài, tiến hành vào lúc sáng sớm hoặc chiều mát. Sau khi bắt lên thì làm chết đột ngột bằng nước đá (0-4oC), sơ chế ngay mẫu, cho mẫu vào túi zipper hàn miệng có đánh mã số riêng theo từng lô, bảo quản bằng nước đá khô trong thùng cách nhiệt ở nhiệt độ mát (0-4oC) chuyển về phòng phân tích trong vòng 4 giờ. Tại phòng phân tích, tất cả mẫu được phân tích và xử lý thống kê để đánh giá thực trạng nhiễm erythromycin. Nếu mẫu chưa phân tích kịp thì bảo quản trong ngăn đông. Mỗi mẫu được phân tích 5 lần (n=5) trên máy Analyzer SQF - 505. Kết quả thể hiện: trung bình ± SD, % RSD.
2.2.2.4. Xác định quy luật chuyển hóa sinh học, đào thải của erythromycin trong cơ thể thủy sản khi nuôi
a) Tôm càng xanh
- Vị trí nuôi thí nghiệm: ấp An Phú, Thị Trấn Kế Sách, Tỉnh Sóc Trăng. - Mật độ thả giống: 40 con/m2. Kích cỡ thả giống: 5-6 g/con.
- Diện tích ao thử nghiệm 5 m x 6 m = 30 m2, độ sâu mực nước 1,2 m.
- Thức ăn cho tôm càng xanh của Cty Grobest thuộc dạng chìm.
- Thời gian nuôi 6 tháng. Kích cỡ tôm khi xử lý kháng sinh:50 g/con, sử dụng kháng sinh erythromycin base.
- Phân tích sàng lọc các dạng erythromycin B, C, D, E, F có trong nguyên liệu erythromycin base này theo phương pháp LC-MS/MS.
- Thời gian xử lý kháng sinh: 7 ngày.
- Con đường đưa kháng sinh vào cơ thể: thức ăn viên (cỡ số 4), trộn đều với kháng sinh rồi áo bên ngoài bằng dầu mực để yên 30 phút trước khi cho ăn. Dầu mực ANOVA được cung cấp bởi Cty Hải Đức.
- Liều kháng sinh xử lý: 50 và 100 mg/kg thể trọng/ngày.
- Số lần cho ăn thức ăn trong ngày: 4 lần (6h, 11h, 17h, 22h). Thức ăn (có gây nhiễm erythromycin) cho tôm được chuẩn bị sao cho khi ăn luôn ăn với lượng thiếu. Giám sát lượng thức ăn thừa bằng cách dùng sàng cho ăn.
- Lấy mẫu phân tích khẳng định dư lượng erythromycin A, phân tích sàng lọc các dạng