Người ta thường dùng các dung dịch nền có nồng độ các chất điện ly trơ lân cận vùng nồng độ 0,1 M. Sự thay đổi nồng độ của các chất điện ly trơ trong một khoảng nào đó không ảnh hưởng nhiều tới thế bán sóng hay chiều cao sóng.
Qua khảo sát sơ bộ về pH, chúng tôi thấy đệm Amoni axetat pH 8,0 là dung dịch phù hợp cho định lượng erythromycin. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nền, chúng tôi tiến hành khảo sát khảo sát nồng độ dung dịch nền Amoni axetat pH 8,0 trong khoảng 0,05 0,25 M. Các thông số chạy máy Vstart: -400 mV, Vstep: 4 mV, Vpulse: 30 mV, Tdrop: 5000 ms, Velectrolise: -700 mV, Telectrolise: 3 s, Tstabilize: 1
(a) (b) (c) (d) (e) Hình 3.8:Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Amoni axetat pH 8,0
(a: 0,05 M; b: 0,01M; c: 0,15M; d: 0,20 M; e: 0,25M) 150,0 170,0 190,0 210,0 230,0 250,0 270,0 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
Nồng độ dung dịch nền ammonium acetate (M)
C ư ờn g độ d òn g er yt hr om yc in A (n A )
Hình 3.9:Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nền Amoni axetat đến cường độ dòng của erythromycin A
Erythromycin có cường độ dòng cao nhất ở Amoni axetat 0,10 M (E1/2= -1.430 mV, I = 254,8 ± 10,2 nA). Vì vậy giá trị này được chọn để khảo sát các thông số tiếp theo (hình 3.9).
Nồng độ dung dịch nền (lực ion của dung dịch nền) có vai trò tạo ra môi trường điện ly, tạo nên dòng dịch chuyển các điện tích khi đặt trong điện trường, hỗ trợ quá trình truyền khối các phân tử erythromycin đến bề mặt điện cực tốt hơn. Khi lực ion của Amoni axetat vượt quá 0,10 M; các ion CH COO-và NH +trở thành yếu tố cản trở
dòng khuếch tán của các phân tử erythromycin đến tích góp tại bề mặt cực làm việc, cường độ dòng erythromycin giảm xuống.
Nourozi và cộng sự (2009) khảo sát tín hiệu điện hóa của erythromycin A bằng kỹ thuật Von-ampe tuần hoàn, trong đó đánh giá ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nền H3PO4từ 0,04 đến 0,06 M thì thấy ở 0,05 M là nồng độ nền thích hợp [39]. Wang Huaisheng và cộng sự (2000) nghiên cứu tín hiệu điện hóa của erythromycin A bằng kỹ thuật stripping sóng vuông hấp phụ trên điện cực thuỷ tinh carbon thì thấy dung dịch NH4Cl 0,025 M là phù hợp [34]. Xue Li và cộng sự (2008) nghiên cứu tín hiệu điện hóa của erythromycin A bằng kỹ thuật von-ampe tuần hoàn trên điện cực nano vàng-điều chỉnh bằng thuỷ tinh carbon thì lại thấy dung dịch NaOH 0,2 M nồng độ nền thích hợp [53].
Trở lại nghiên cứu của luận án, nếu tính theo lực ion thấy rằng khi của amoni axetat tăng dần từ 0,05 M đến 0,1 M thì cường độ dòng sẽ tăng theo, nếu tăng tiếp lực ionnày lên 0,15 M hay cao hơn nữa thì sẽ trở thành yếu tố gây cản trở dòng khuếch tán của erythromycin đến bề điện cực giọt thuỷ ngân từ đó cường độ dòng sẽ giảm.
3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi hòa tan erythromycin
Sự có mặt của một dung môi hữu cơ nào đó trong dung dịch nền có thể ảnh hưởng đến tính chất điện hóa và khả năng hấp phụ của các chất hữu cơ trên cực giọt thủy ngân và làm cho các tín hiệu điện hóa thu được thay đổi. Khi chất phân tích dễ tan trong nước, người ta thường dùng dung dịch nền là dung dịch nước chứa các chất điện ly trơ khác nhau. Khi chất hữu cơ cần phân tích ít tan trong nước, người ta có thể dùng hỗn hợp nước và các dung môi hữu cơ thích hợp, thường dùng nhất là hệ cồn- nước (ethanol, methanol,..). Có một số chất chỉ tan trong dung môi hữu cơ, như trường hợp phân tích vitamin A, D trong dầu cá, người ta dùng dung môi là dimethyl formamid với các muối Amoni bậc bốn làm nền.
Loại dung môi hòa tan có ảnh hưởng đến cường độ dòng của erythromycin. Yêu cầu của dung môi hòa tan là phải hòa tan tốt chất cần phân tích, không bị tách lớp trong dung dịch nền. Erythromycin dễ tan trong nước nên chúng ta có thể tiến hành
phân tích trong các dung dịch nền là dung dịch nước chứa các chất điện ly trơ. Nhưng trong quá trình chuẩn bị mẫu phân tích có thể phải dùng một số dung môi hữu cơ nên chúng tôi cũng tiến hành khảo sát sự có mặt của một số dung môi hữu cơ thường dùng có ảnh hưởng nhiều tới phổ của eythromycin không.
Các đặc tính quan trọng của dung môi khi xét đến: hằng số điện môi, tính acid hoặc tính bazơ. Một dung môi có hằng số điện môi cao khir> 30 và hằng số điện môi thấp khir< 10. Dung môi có tính acid yếu là dung môi hoà tan rất ít các anion như F-, Cl-, OH-, CH3COO-,…Dung môi có tính acid yếu rất khó nhận điện tử và khó khử, khoảng thế rất rộng ở thế âm, ví dụ như acetronitril. Dung môi có tính acid mạnh thì dễ dàng hoà tan các anion bằng liên kết hydro, dễ nhận điện tử, khoảng thế hẹp ở thế âm, ví dụ như methanol.
Tiến hành ghi phổ của erythromycin trong dung dịch nền Amoni axetat 0,1 M pH 8,0 với sự có mặt của ba dung môi methanol, acetonitril, ethyl axetat để hòa tan chuẩn eythromycin, erythromycin được đo ở nồng độ 50 ppb với các thông số chạy máy Vstart: -400 mV, Vstep: 4 mV, Vpulse: 30 mV, Tdrop: 3000 ms, Velectrolise: -700 mV, Telectrolise: 3 s, Tstabilize: 1 s.
(a) (b) (c)
Hình 3.10: Phổ erythromycin ghi 5 lần khi dùng dung môi hòa tan (a: methanol; b: acetonitril; c:ethyl axetat )
Qua kết quả thu được ở hình 3.10, ta thấy sự có mặt của các dung môi trên vẫn không ảnh hưởng nhiều tới tính chất của phổ eythromycin, chúng ta vẫn ghi được các phổ rõ ràng ở vùng thế như cũ. Qua đó, ta thấy trong quá trình chuẩn bị mẫu đo có thể dùng các dung môi trên.
3.1.5 Nghiên cứu các điều kiện chạy máy thích hợp
3.1.5.1 Nghiên cứu chiều quét
Hình 3.11: Phổ erythromycin theo chiều quét (màu xanh lá: quét xuôi, màu đỏ: quét ngược)
Phản ứng điện hóa của các chất hữu cơ trên cực giọt thủy ngân thường không thuân nghịch hoàn toàn nên chiều quét thế có thể ảnh hưởng rất nhiều đến sự xuất hiện của sóng và dạng sóng. Để thu được sóng erythromycin tốt nhất cho mục đích phân tích, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của chiều quét thế trong vùng từ 0 Volt đến -1.800 Volt.
Khi quét thế từ 0 Volt đến -1.800 Volt chúng tôi thu được sóng rõ và ổn định. Khi quét thế từ -1.800 Volt về 0 Volt hầu như không thu được sóng. Vì thế các thí nghiệm tiếp theo được thực hiện bằng cách quét thế tăng dần về phía âm.
3.1.5.2 Nghiên cứu chọn thế bắt đầu ghi phổ Vstart
phụ điện hóa khi áp thế một chiều lên cực giọt thủy ngân, cũng như tính thuận nghịch, do đó việc chọn thế một chiều bắt đầu ghi phổ cũng có thể có ảnh hưởng tới cường độ dòng đo được.
(a) (b) (c) (d)
(e) (f) (g) (h)
Hình 3.12: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở Vstart(a: -400 mV; b: -500 mV; c: -600 mV; d: - 700 mV; e: -800 mV; f: -900 mV; g: -1000 mV; h: -1100 mV)
Chúng tôi đã tiến hành ghi phổ erythromycin nồng độ 100 ppb trong dung dịch nền Amoni axetat 0,1 M; pH 8,0 với các giá trị thế bắt đầu ghi phổ Vstartkhác nhau. Mode PSA-F, quét xuôi, Vstep: 4 mV, Vpulse: 30 mV, Tdrop: 1000 ms, Velectrolise: -700 mV, Telectrolise: 3 s, Tstabilize: 1 s. Kết quả được trình bày ở hình 3.12.
Về lý thuyết khi làm việc với cực giọt thủy ngân, người ta thường đặt giá trị Vstart trong vùng từ 400 mV đến -1.800 mV mặc dù thiết kế máy cho phép cài đặt bất cứ giá trị Vstart nào trong khoảng thế từ 4.000 mV đến -4.000 mV. Không nên đặt thế quá dương trước 400 mV hay quá âm sau -1.800 mV. Ở thế quá dương sẽ xảy ra phản ứng hòa tan thủy ngân, ở thế quá âm xảy ra quá trình phân hủy nền. Thường ta đặt Vstarttrước thế đỉnh khoảng 300 mV để chân sóng đủ rõ.
y = 0,1332x + 162,8 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 -1200 -1100 -1000 -900 -800 -700 -600 -500 -400 -300 -200 Vstart (mV) C ư ờ ng đ ộ dò ng e ry th ro m yc in A (n A )
Hình 3.13:Ảnh hưởng của Vstartđến cường độ dòng của erythromycin A
Qua kết quả hình 3.13 ta thấy nếu bắt đầu ghi phổ càng sớm thì dòng thu được càng lớn. Nguyên nhân là do thời gian hấp phụ hoạt chất trước khi xảy ra phản ứng điện hóa kéo dài, lượng erythromycin tích lũy trên mặt cực càng lớn nên sóng càng cao. Chúng tôi không tiến hành ghi phổ ở thế sớm hơn nữa, vì vùng gần 0 Volt xảy ra phản ứng khử của oxy luôn có mặt trong dung dịch và có thể ảnh hưởng đến sự tích góp của hoạt chất cần phân tích. Các thí nghiệm phân tích sau này sẽ được ghi với Vstart -400 mV. Do đó phản ứng oxi hoá - khử giữa erythromycin và oxi hoà tan trong dung dịch được giảm thiểu đến mức thấp nhất.
3.1.5.3 Nghiên cứu chọn bước thế 1 chiều Vstep
Máy sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm ANALYZER SQF-505 có tốc độ quét thế và ghi phổ rất nhanh. Trong khoảng thời gian 2 giây máy có thể quét thế một chiều từ 0,0 V đến -2,0 V; có thể thực hiện hàng nghìn phép đo dòng Faraday
xoay chiều, tính toán và hiển thị tức thời phổ ghi được trên màn hình. Tốc độ quét thế một chiều đôi khi có ảnh hưởng ít nhiều đến phổ và kết quả đo dòng, vì vậy chúng tôi đã tiến hành ghi phổ dung dịch erythromycin nồng độ 100 ppb trong dung dịch nền Amoni axetat 0,1 M; pH 8,0 một số tốc độ quét thế một chiều tương ứng với thế bước Vstep = 6, 8, 10 mV/ bước thế. Mode PSA-F, quét xuôi, Vstart:-400 mV, Vpulse: 30 mV, Tdrop: 3000 ms, Velectrolise: -700 mV, Telectrolise: 3 s, Tstabilize: 1 s. Khi khảo sát các bước thế 2 và 4 mV thì giọt rơi trước điểm kết thúc, hoặc không ổn định, không ghi được phổ nên không trình bày phổ ở bước thế 2 và 4 mV mà chỉ trình bày phổ ở ba thế 6, 8, 10 mV. Chúng tôi thu được các phổ ở hình 3.14.
(a) (b) (c)
Hình 3.14: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở Vstep(a: 6 mV; b: 8 mV; c: 10 mV)
y = -12,395x + 284,64 150 160 170 180 190 200 210 220 4 6 8 10 12 Vstep (mV) C ư ờn g độ d òn g er yt hr om yc in A (n A )
Ta thấy tốc độ quét thế cũng có ảnh hưởng đến chiều cao sóng. Phổ ghi với chế độ Vstep = 6 mV có giá trị cao nhất. Nguyên nhân của hiện tượng này là khi quét thế tốc độ quá cao, sự khuếch tán của hoạt chất đến bề mặt thủy ngân không đủ bổ sung cho các hoạt chất đã tham gia phản ứng điện hóa. Chúng tôi cần có phép phân tích với độ nhạy càng cao càng tốt nên sẽ tiến hành ghi phổ với chế độ Vstep= 6 mV.
3.1.5.4 Nghiên cứu chọn biên độ xung vuông Vpulse
Trong cực phổ sóng vuông quét nhanh người ta áp lên cực giọt thủy ngân hai thành phần thế: thế một chiều tăng dần theo thời gian và thế xoay chiều là các xung vuông. Thế một chiều hay được dùng trong khoảng từ 0 volt đến -2,0 volt. Các xung vuông xoay chiều trong máy SQF-505 có biên độ 10 – 20 – 30 – 40 mV và tần số 250 Hz. Người ta tiến hành phép đo cường độ dòng Faraday xoay chiều ở đầu xung và cuối xung vuông. Phổ sóng vuông là đường thể hiện dãy hiệu số hai lần đo và thế một chiều.
(a) (b) (c) (d)
Hình 3.16:Phổ erythromycin 5 lần lặp lại ở Vpulse
(a: 10 mV; b: 20 mV; c: 30 mV; d: 40 mV)
Chúng tôi đã tiến hành ghi phổ erythromycin nồng độ 100 ppb trong nền Amoni axetat 0,1 M; pH 8,0 với các biên độ khác nhau. V : -400 mV, V : 6 mV, T :
3000 ms, Velectrolise: -700 mV, Telectrolise: 3 s, Tstabilize: 1 s. Chúng tôi thu được các phổ ở hình 3.16. y = 15,258x + 78,47 100 200 300 400 500 600 700 800 0 10 20 30 40 50 Vpulse (mV) C ư ờn g độ d òn g er yt hr om yc in A (n A )
Hình 3.17:Ảnh hưởng của Vpulseđến cường độ dòng của erythromycin A
Ta thấy cường độ dòng đo được khi dùng xung 40 mV cao gấp 3 lần khi dùng xung 10 mV. Độ lệch chuẩn khi dùng xung 30 mV khoảng 1,5% , với xung 40 mV khoảng 2%. Trong kiểm tra dư lượng kháng sinh, thiết bị có độ nhạy càng cao càng tốt, nên chúng tôi sẽ dùng các phép đo với biên độ xung = 40 mV. Về nguyên tắc, nếu dùng xung có biên độ càng lớn thì cường độ dòng càng cao, phép đo càng nhạy, nhưng dùng biên độ xung cao quá độ phân giải sẽ thấp, độ lặp của kết quả đo cũng kém đi.
3.1.5.5 Nghiên cứu chọn thời điểm quét thế trong đời sống 1 giọt thủy ngân Tdrop
Trong kỹ thuật cực phổ sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm, người ta dùng các giọt thủy ngân chậm hình thành tự nhiên với đời sống giọt ổn định khoảng 10 giây một giọt. Phần mềm SQF-505 cho phép bắt đầu ghi phổ tại bất cứ thời điểm nào kể từ khi giọt thủy ngân bắt đầu hình thành. Quá trình ghi phổ chỉ tiến hành mất một, hai giây.
Giá trị Tdrop này thể hiện thời điểm bắt đầu ghi sóng kể từ thời điểm hình thành một giọt thủy ngân mới. Để ghi toàn phổ ta nên chọn giá trị 1.000 ÷ 5.000 ms để trong quá trình ghi giọt không bị rơi. Giá trị Tdropcàng lớn sóng càng lớn vì được ghi ở vùng giọt lớn, cường độ dòng qua cực làm việc càng cao, độ nhạy càng cao. Mode PSA-F, quét xuôi, Vstart: -400 mV, Vstep: 6 mV, Vpulse: 40 mV, Velectrolise: -700 mV, Telectrolise: 3 s, Tstabilize: 1 s. Kết quả phổ được trình bày ở hình 3.18.
Qua kết quả ở hình 3.19 ta thấy: Khi giá trị Tdrop càng cao thì dòng đo được càng lớn, độ nhạy càng tăng. Khi ghi ở chế độ Tdrop = 5.000 ms, cường độ dòng lớn gấp khoảng 4 lần khi ghi ở chế độ Tdrop= 1.000ms và các kết quả ghi rất ổn định. Nếu dùng các giá trị Tdroplớn hơn (6.000, 7.000 ms) giọt sẽ bị rơi khi đang ghi phổ nên kết quả ghi không tốt, vì vậy với điện cực này chúng tôi sẽ dùng chế độ Tdrop = 5.000 ms trong các nghiên cứu định lượng.
(a) (b) (c) (d) (e)
Hình 3.18: Phổ erythromycin 5 lần lặp lại ở Tdrop
(a: 1.000 ms; b: 2.000 ms; c: 3.000 ms; d: 4.000 ms; e: 5.000 ms) y = 0,0631x + 70,59 100 150 200 250 300 350 400 450 0 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 Tdrop (ms) C ư ờn g độ d òn g er yt hr om yc in A (n A )
3.1.5.6 Nghiên cứu chọn thời gian điện phân tích góp Telectrolise
Để tăng độ nhạy cho các phương pháp phân tích điện hóa người ta thường dùng kỹ thuật Stripping với quá trình tiền tích góp để làm tăng nồng độ chất cần phân tích trên bề mặt cực làm việc trước mỗi quy trình ghi phổ.
Nhờ kỹ thuật này mà kỹ thuật phân tích điện hóa đã trở thành một trong những phương pháp có độ nhạy cao nhất. Đôi khi người ta có thể đạt đến giới hạn phát hiện vài chục ppb chỉ với những thiết bị không quá đắt tiền.
Với các chất hữu cơ, kỹ thuật stripping dựa trên hiện tượng các chất hữu cơ bị hấp phụ trên mặt giọt thủy ngân hay cực rắn khi chọn được thế tích góp và dung dịch nền thích hợp. Người ta có thể tiến hành kỹ thuật đo này trên cực rắn quay, cực giọt thủy ngân treo hay ngồi, còn máy ANALYZER SQF-505 cho phép thực hiện kỹ thuật stripping trên cực giọt chậm.
(a) (b) (c)
Hình 3.20:Phổ erythromycin ghi 5 lần với Telectrolise
(a: 3.000 ms; b: 4.000 ms; c: 5.000 ms)
Người ta dùng một cực giọt thủy ngân càng chậm càng tốt và tiến hành tích góp chất cần phân tích trên bền mặt giọt khoảng vài giây trước khi tiến hành ghi phổ. Cực