- Giới hạn phát hiện trên nền dung dịch đệm, LoD = 0,52 ppb - Giới hạn phát hiện trên nền mẫu tôm càng xanh, MDL = 0,57 ppb - Giới hạn phát hiện trên nền mẫu cá rô phi, MDL = 0,80 ppb
3.2.3 Độ chính xác, độ đúng và hiệu suất thu hồi
y = 0.9847x - 8.6856 R2 = 0.9985 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 300.00 350.00 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 300.00 350.00
Nồng độ Erythromycin của mẫu thêm chuẩn (µg*kg-1)
N ồn g độ E ry th ro m yc in c ủa m ẫu th êm c hu ẩn ph ân tí ch đ ượ c (µ g* kg -1 )
Hình 3.27:Nồng độ erythromycin được xác định trên mẫu tôm càng xanh ở các thời điểm và mức nồng độ khác nhau
y = 0.8902x - 4.1933 R2 = 0.9984 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 300.00 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 300.00 350.00 N ồn g đ ộ e ry th ro m yc in c ủa m ẫu th êm c hu ẩn ph ân tí ch đ ượ c (µ g* kg -1 )
Nồng độ erythromycin của mẫu thêm chuẩn (µg*kg-1)
Hình 3.28:Nồng độ erythromycin được xác định trên mẫu cá rô phi ở các thời điểm và mức nồng độ khác nhau
Hiệu suất thu hồi của erythromycin trên mẫu cá rô phi kém hơn so với trên mẫu tôm càng xanh là do cơ thịt cá có hàm lượng béo và chất xơ cao hơn so với tôm. Chính hai thành phần này đã làm giảm đi hiệu suất thu hồi. Xét trên cùng một đối tượng mẫu thì mẫu có mức nhiễm erythromycin càng cao thì hiệu suất trích ly và thu hồi càng cao.
Xét về độ chính xác và độ đúng, các trị số của hai thông số này rất cao và được thể hiện chi tiết ở bảng 3.14-3.17 phần phụ lục.
3.2.4 Đánh giá khả năng nhận danh erythromycin A với các kháng sinh khác
Độ phân giải của phổ sóng vuông rất cao, hơn nữa việc xác định thế đỉnh của phổ được thực hiện bằng xử lý thống kê theo phân bố Gause nên giá trị thu được rất ổn định. Khi đo ở vùng nồng độ vài trăm ppb giá trị thế đỉnh sai lệch giữa các lần đo chưa đến 1 mV, vì vậy việc xác định phổ thu được có phải của erythromycin hay không được thực hiện rất dễ dàng và tin cậy bằng phương pháp thêm chuẩn hay so sánh trong cùng điều kiện đo. Hơn nữa khi được phân tích bằng phương pháp stripping sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm, thế bán sóng E1/2 của erythromycin hoàn toàn tách biệt với E1/2 của một số kháng sinh khác như chloramphenicol, florfenicol, furazolidone, ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin, danofloxacin (bảng 3.3). Đây là
những kháng sinh bị phát hiện thường xuyên trong các lô hàng thủy sản xuất khẩu, có nguồn gốc từ quá trình nuôi thủy sản. Sự tách biệt thế bán sóng này chứng tỏ được phương pháp stripping sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm ngoài khả năng sàng lọc mà còn có khả năng nhận danh và tính khẳng định.
Bảng 3.3:Thế bán sóng đặc trưng của một số kháng sinh được định danh bằng phương pháp sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm
Stt Kháng sinh Thế bán sóng E1/2 1 Erythromycin -1.430 mV 2 Chloramphenicol -168 mV 3 Florfenicol -78 mV 4 Furazolidone -1.152 mV 5 Ciprofloxacin -1.336 mV 6 Enrofloxacin -214 mV 7 Danofloxacin -1.120 mV
(Tham khảo phổ của các kháng sinh này trong hình 3.9-3.14 phần phụ lục)
Theo các kết quả của chương trình kiểm soát dư lượng các chất độc hại hàng tháng do Cục Quản Lý Chất Lượng Nông Lâm Sản và Thuỷ Sản thì thấy các kháng sinh này xuất hiện có nồng độ rất thấp chỉ vài ppb, thấp hơn nhiều so với erythromycin (100 ppb). Trước đây theo quyết định 07/2005/QĐ-BTS ngày 24/02/2005 của Bộ Thuỷ Sản quy định mức giới hạn tối đa cho phép của tổng hai chỉ tiêu Enrofloxacin + Ciprofloxacin = 100 ppb. Đến ngày 31/10/2011 thì Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn có quyết định 2654/QĐ-BNN-QLCL quy định Enrofloxacin + Ciprofloxacin = 1 ppb. Ngày 16/01/2012, Thứ trưởng Bộ NN và PTNT Vũ Văn Tám đã ký ban hành Thông tư số 03/2012/TT-BNNPTNT đưa Enrofloxacin vào Danh mục hoá chất, kháng sinh cấm sử dụng. Vì thế, khả năng xuất hiện dư lượng các kháng sinh này cao hơn erythromycin là rất thấp. Nếu các kháng sinh này nghi ngờ xuất hiện ở nồng độ cao, chúng ta có thể thêm chuẩn erythromycin sao cho peak của erythromycin lớn lên và như thế sẽ không bị chèn lấp thế bán sóng.
Để giải thích khả năng nhận dạng kháng sinh của phương pháp stripping sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm cần dựa trên cơ chế xuất hiện của các sóng phổ.
3.2.4.1 Giải thích cơ chế xuất hiện sóng của erythromycin
Trong công thức cấu tạo của eythromycin (hình 3.1) có hai nhóm C = O, đó là cơ sở để hy vọng có thể bắt được tín hiệu khử đặc trưng của eythromycin. Các nhóm C = O, như trong các aldehyde và xeton, thường cho sóng khử trực tiếp theo cơ chế sau:
o Trong giai đoạn thứ nhất xảy ra phản ứng khử thuận nghịch với sự tham gia một điện tử để tạo ra gốc anion:
RR’C = O + e- (+ H+) RR’C`– O- (hay là RR’C`– OH)
o Các gốc anion tiếp tục khử với sự tham gia thêm một điện tử nữa và tạo một sóng khử có sự tham gia hai điện tử.
Tuy nhiên tùy nguyên tử cacbon của nhóm C = O liên kết với các nhóm ái nhân hay ái điện tử mà việc khử nhóm C = O dễ hay khó. Nếu nó liên kết với các nhóm ái điện tử càng mạnh thì việc khử nhóm C = O càng dễ, sóng càng chuyển dịch về phía dương.
Ta hãy xét thế bán sóng của một số chất hữu cơ có nhóm C = O sau:
Formaldehyde H – CH = O Đệm pH 8 E1/2 = -1,50 V Đệm pH 10 E1/2 = -1,63 V Đệm pH 12 E1/2 = -1,74 V Axetaldehyde CH3– CH = O Đệm pH 7 E1/2 = -1,93 V Đệm pH 9 E1/2 = -2,08 V Propionaldehyde CH3– CH2– CH = O LiOH 0,1M E1/2 = -1,96 V [41], [45], [58]
Qua các ví dụ trên ta thấy khi nguyên tử cacbon của nhóm C = O liên kết với các mạch cacbon càng dài, mật độ điện tử trong nhóm C = O càng cao, quá trình khử càng khó, thế bán sóng càng tăng về phía âm. Ngược lại khi các nhóm ái điện tử càng gần nguyên tử cacbon của nhóm C = O, thì nhóm C = O càng dễ khử như các ví dụ sau:
Methylglyoxal CH3– CO – CH = O Đệm pH 7 E1/2 = -1,36 V Glycoaldehyde HO – CH2– CH = O Đệm pH 7 E1/2 = -1,54 V
Nhóm C = O thứ nhất của erythromycin liên kết với một loạt nhóm CH và CH3 là các nhóm ái nhân nên mật độ điện tử khá cao nên rất khó khử. Thế bán sóng của nhóm này phải nằm lân cận vùng -2,0 volt.
Nhóm C = O thứ hai liên kết trực tiếp với một nguyên tử oxy là một tác nhân ái điện tử, cho nên có thể kết luận sóng của erythromycin có thế đỉnh vùng -1,4 volt là sóng khử của nhóm C = O thứ hai.
Phương trình điện hoá của erythromycin:
Avramovivic và cộng sự (2008) đã nghiên cứu cơ chế phản ứng điện hoá của erythromycin A trên điện cực vàng bằng phương pháp von-ampe tuần hoàn mà không phải là phương pháp sóng vuông quét nhanh điện cực giọt chậm thuỷ ngân. Kết quả cho thấy rằng erythromycin A bị oxi hoá qua hai giai đoạn:
Giai đoạn một:Loại đi 1 electron của một trong số các nguyên tử nitơ để hình thành 1 cation aminium gốc tự do.
Giai đoạn hai: Cation aminium gốc tự do không bền, nó sẽ phản ứng với nguyên tử hidrô của nước để hình thành dạng muối
Nhóm tác giả của nghiên cứu này còn đưa ra thêm giả thuyết rằng nhóm amine cũng có thể qua quá trình demethyl hoá bằng cách qua bước chuyển 2 electron
[60]
3.2.4.2 Từ đây chúng tôi xin được khái quát hoá và đưa ra giả thuyết khả năng xuất hiện sóng của một số họ kháng sinh (thường gặp trong nuôi trồng thuỷ sản) bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm
a) Họ Phenicol
Trong họ phenicol có một số kháng sinh có thể kể đến như Chloramphenicol (C11H12Cl2N2O5), Florfenicol (C12H14Cl2FNO4S), Thiamphenicol (C12H15Cl2NO5S).
Trong công thức cấu tạo của họ kháng sinh phenicol có 3 nhóm chức điện hoá: - Nhóm -Cl2: CH2= CCl2có E1/2> -0,2 V; CH2= CH-CH2Cl có E1/2: -1,95 V
- Nhóm C = O cũng có thể tham gia phản ứng khử.
- Nhóm nitro có trị số E1/2dao động trong khoảng -0,2 đến -1,0 V phụ thuộc vào giá trị pH, các nhóm liên kết với nhóm NO2và dung môi sử dụng. Tuỳ thuộc pH dung dịch nền, nhóm này cho 1 sóng hay 2 sóng khử.
Vậy nên thế bán sóng của chloramphenicol E1/2= -168 mV và thế bán sóng của florfenicol E1/2= -78 mV có thể dự đoán chính là nhờ vào nhóm -Cl2.
Nitrobenzen khử tốt trên điện cực giọt thuỷ ngân. Với cực phổ sóng vuông, nitrobenzene cho hai sóng tương ứng với hai giai đoạn trao đổi 4 và 2 electron, tạo thành phenylhydroxylamin và aniline.
Ar NO2+ 4e-+ 4H+ArNHOH + H2O ArNHOH + 2e-+ 2H+ArNH2+ H2O
Sóng khử đến phenylhydroxylamin thuận lợi để định lượng. Phản ứng khử diphenylhydroxylamin giống như giai đoạn 2 của quá trình khử điện cực, chỉ xảy ra ở môi trường acid. Khi tăng pH, chiều cao của sóng khử thứ 2 sẽ bị giảm dần, ở pH từ 6 trở lên chỉ còn một sóng. Điều này được giải thích rằng trong môi trường kiềm phenylhydroxylamin tham gia phản ứng kết hợp với sự tạo thành azoxybenzen, sau đó nó bị khử cho đến hydrazobenzen và nước.
Nitrobenzen trong môi trường nước và nước-dung môi hữu cơ, nitrobenzene trong khoảng thế -0,1 V đến -0,6 V trên tất cả độ dài pH cho một sóng 4 điện tử theo tính chất đặc trưng giới hạn khuếch tán tương ứng của quá trình. Giá trị E1/2 của sóng này đến pH 9 được dịch chuyển về hướng thế âm hơn, sau đó trở nên cố định ở khoảng - 0,2 V. Ở thế âm hơn (-0,3 V đến -1,0 V) trong môi trường acid xuất hiện 1 sóng 2
điện tử có chiều cao giảm với sự tăng pH, nó hoàn toàn bị mất ở pH 5,5. Khi pH > 5,5 sự khử cực phổ của nitrobenzene trong môi trường nước được thể hiện bằng sự tạo thành N-phenylhydroxylamin và trên cực phổ đồ xuất hiện chỉ 1 sóng 4 điện tử. Giá trị E1/2của sóng 4 điện tử phụ thuộc vào thành phần ion của dung dịch điện ly nền.
Các sóng tương ứng thể hiện: đầu tiên sự khử phân tử nitrobenzene đến N- phenylhydroxylamin, sóng thứ 2 sự khử tiếp theo đến aniline (sau sự proton hoá với sự tạo thành cation N-phenylhydroxyamoni).
3 5 6 2 , 2 2 5 6 5 6 4 , 4 2 5 6H NO C H NHOH C H NH OH C H NH C e H H e H
Sự khử cực phổ của nitrobenzene có sự trao đổi proton không đi đến tạo thành nitrobenzene, bởi vì nó bị khử ở thế âm ít hơn so với nitrobenzene. Để nhận được sản phẩm hydroxylamine, môi trường điện phân không chứa các tác nhân ái nhân mạnh như đệm axetat. Để nhận được sản phẩm khử là amin, quá trình khử nitro đến amin trong chất điện ly nền thường dùng là acid sulfuric loãng.
b) Họ Nitrofuran
Một số kháng sinh trong họ nitrofuran có thể kể đến như: Furazolidone (C8H7N3O5), Furaltadone (C13H16N4O6), Nitrofurantoine (C8H6N4O5), Nitrofurazone (C6H6N4O4)
Trong họ kháng sinh nitrofuran có 3 nhóm chức điện hoá:
- Nhóm NO2có E1/2 trong khoảng - 0,2 V đến - 1,0 V. Trong môi trường phi proton (acetonitril), nitrobenzen bị khử ở 2 giai đoạn. Sóng đầu tiên thuận nghịch thể hiện sự trao đổi 1 điện tử (E1/2 -1,0 V) tạo thành anion gốc tự do của nitrobenzen. Sóng thứ hai 3 điện tử (E1/2 -1,5 V) không thuận nghịch và thường được thể hiện không chính xác. Tổng quá trình khử của nhóm NO2 trong môi trường phi proton biểu diễn bằng phương trình NHOH H C NO H C NO H C e e H 5 6 4 , 3 2 5 6 2 5 6 [ ]
NO2khi gắn với các khung khác thì thế đỉnh sẽ bị dao động ở trong khoảng thế khác. - Nhóm C = N có E1/2 trong khoảng -1,0 V đến - 1,8 V. Tuỳ thuộc trị số pH và các nhóm liên kết với nhóm NO2, C = N, thế bán sóng dao động trong khoảng này. Thế bán sóng của furazodidone -1.152 mV trong dung dịch nền amoni axetat pH 8 là do C = N.
Phản ứng khử của nhóm C = N theo phương trình sau: NR' [RCHNR ]' [RCHNR ]'2 RCH e e
- Ngoài ra còn có nhân dị vòng 2-oxo-1,3-oxolidin cũng có thể tham gia phản ứng khử. Trong dung môi phi proton và môi trường pH cao, nitrofuran được xác định dựa trên sự khử nhóm nitro trên điện cực thủy ngân xảy ra qua 2 giai đoạn như trong sơ đồ:
Bước 1: . 2 2 1e R NO NO R O H NHOH R H e NO R . 2 2 3 4 Bước 2: RNHOH2H 2e RNH2H2O c) Họ Fluoroquinolon
Một số kháng sinh thuộc họ fluoroquinolon như: Enrofloxacin (C19H22FN3O3), Ciprofloxacin (C17H18FN3O3), Norfloxacin (C16H18FN3O3), Danofloxacin (C19H20FN3O3), Sarafloxacin (C20H17F2N3O3), Orbifloxacin (C19H20F3N3O3), Difloxacin (C21H19F2N3O3), Ibafloxacin (C15H14FNO3), Flumequine (C14H12FNO3),….
Nhóm fluoroquinolon trong công thức cấu tạo có khung quinolon, nhân quinon, nhóm này có phản ứng khử trên điện cực giọt thuỷ ngân.
+ 2e- + 2H+
Hệ thống quinon-hydroquinon trong môi trường nước và môi trường hữu cơ nước là một trong những dạng cực phổ hữu cơ có phản ứng điện hoá thuận nghịch. Trên cực phổ đồ cổ điển củao- vàp-benzoquinon, naphtoquinon, anthraquinon và một số quinon có nhiều nhóm thế ở vùng thế dương (+0,3 V đến -0,3 V) xuất hiện sóng hai
N R1 OH N R1 O
điện tử thuận nghịch, E1/2 của sóng tăng tuyến tính với sự tăng pH trong khoảng pH xác định (E1/2/pH = -5,8 mV/ 1 đv pH).
Phương trình điện hoá xảy ra như sau:
+ 2e- + 2H+
Tính thuận nghịch của sóng thể hiện ở sự đồng nhất E1/2 sóng khử cathod của quinon với E1/2 sóng oxy hoá anod của hydroquinone. Tính thuận nghịch của sóng cho phép ta nghiên cứu và phân tích các dạng oxi hoá cũng như dạng khử. Tính chất cực phổ này có thể dùng để xác định thế oxy hoá khử của một số quinon. Trong môi trường acid mạnh, sự chuyển điện tử có thể xảy ra trước sự proton hoá của phân tử quinon (có thể chuyển đổi trước 2 proton), đặc biệt xuất hiện trong phản ứng điện hoá trên điện cực rắn. Sự khử cực phổ của quinon trong môi trường nước được thể hiện chỉ một sóng thứ 2, mà quá trình chuyển điện tử có thể xảy ra ở 2 giai đoạn thuận nghịch với sự tạo thành một sản phẩm trung gian semiquinon, tiếp tục tham gia quá trình điện hoá, hoặc có thể không phụ thuộc vào tỷ lệ với quinon và hydroquinone hoặc dimmer hoá trong dung dịch.
Trong môi trường không proton (acetonitril) những quinon khác nhau cho hai sóng một điện tử thuận nghịch tương ứng sự khử đến Q-
.và tiếp theo đến Q2- . Phương trình điện hoá xảy ra như sau:
2 . . Q Q Q e e
Tiến hành đo sóng khử của ciprofloxacin trực tiếp trong dung dịch nền amoni axetat pH 8, có thế bán sóng -1.336 mV. Đối với một số quinon có nhiều nhóm thế, tuỳ thuộc nhóm thế liên kết mà tạo sóng dao động ở vùng + 0,3 V đến - 0,3 V. Thế bán sóng của enrofloxacin nằm ở thế -214 mV, còn thế bán sóng của ciprofloxacin -1.336 mV không nằm trong khoảng đo này do khung quinolon ngoài nhân quinon có nhiều nhóm thế trong phân tử làm cho thế bán sóng dịch chuyển về thế âm hơn.
O
O
OH
3.2.5 So sánh đối chứng kết quả SSWV với LC-MS/MS
3.2.5.1 Trên mẫu tôm càng xanh
Hiệu suất thu hồi: > 90,92 %, MDL: 0,57 µg.kg-1; R_adjust: 0,99999; RSD: 0,911,58 % (Hình 3.29).
3.2.5.2 Trên mẫu cá rô phi
Hiệu suất thu hồi: > 85,07%; MDL: 0,80 µg.kg-1; R_adjust: 1,0; RSD: 0,80 2,10 % (Hình 3.30).
Hình 3.29:Đường chuẩn erythromycin trên nền mẫu tôm càng xanh