Để xem xét ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chuyển hóa, dược động học erythromycin trên tôm càng xanh, cá rô phi; và hơn nữa tôm càng xanh và cá rô phi là động vật biến nhiệt nên thông số nhiệt độ được diễn đạt bằng °C_ngày. Độ_ngày được tính toán bằng cách lấy nhiệt độ nước ao nuôi ở giá trị trung bình hàng ngày, nhân với tổng số ngày ở thời điểm lấy mẫu.
Kết quả của khả năng đào thải erythromycin A tại các thời điểm khác nhau trong mẫu cơ thịt tôm càng xanh và cá rô phi sau khi được được cho ăn erythromycin bằng con đường thức ăn ở mức 50 và 100 mg.kg-1thể trọng.ngày-1trong 7 ngày (hình 3.33, 3.34).
Dư lượng trong cá rô phi cao hơn rất nhiều so với trong tôm càng xanh, tới 25- 35 lần mặc dù điều kiện gây nhiễm và thời gian lấy mẫu là hoàn toàn giống nhau. Điều này có thể giải thích: khi cho cá rô phi ăn thức ăn nổi có trộn kháng sinh, khi vừa tiếp xúc mặt nước là thức ăn được cá ăn hết. Trong khi đó ở tôm càng xanh thì tốc độ bắt mồi thức ăn chậm hơn rất nhiều, thức ăn thuộc dạng chìm. Khả năng rất lớn là kháng sinh sẽ bị hoà tan vào nước mặc dù được áo bằng dầu gan mực.
0.0 100.0 200.0 300.0 400.0 500.0 600.0 700.0 0 100 200 300 400 500 600 700
Thời gian (oC - ngày)
Er yt hr om yc in A (µ g/ kg )
50 mg erythromycin/kg thể trọng/ngày 100 mg erythromycin/kg thể trọng/ngày
Hình 3.33:Khả năng đào thải hàm lượng erythromycin A trong cơ thịt tôm càng xanh đã được cho ăn 50 và 100 mg.kg-1thể trọng.ngày-1trong 7 ngày
Hình 3.34:Khả năng đào thải hàm lượng erythromycin A trong cơ thịt cá rô phi đã được cho ăn 50 và 100 mg.kg-1thể trọng.ngày-1trong 7 ngày
Xác định thời gian ngưng thuốc
Giá trị MRL cho erythromycin A được áp vào là 30 µg.kg-1, theo quy định của CFIA (cơ quan kiểm soát thực phẩm Canada) ngày 17/11/2009. Đồ thị này được xây dựng bằng chương trình thống kê theo khuyến cáo của Cơ quan Thú Y Châu Âu (EMEA) [61].
Bằng phương pháp thống kê này, rút ra được thời gian ngưng thuốc 976 °C_ngày (tương đương 34,86 ngày; ở nhiệt độ 28oC) đối với tôm càng xanh đã được cho ăn erythromycin 100 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1 trong thời gian 7 ngày (hình 3.35). Riêng với mức nồng độ 50 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1 trong thời gian 7 ngày thì dư lượng để lại là không đáng kể và ở mức an toàn.
Cũng bằng phương pháp thống kê này, rút ra được thời gian ngưng thuốc 908 °C-ngày (tương đương 32,42 ngày, ở 28oC) đối với cá rô phi đã được cho ăn erythromycin 50 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1 trong thời gian 7 ngày (hình 3.36 và 3.37). Trong khi đó thì cần đến 1.150°C-ngày ngưng thuốc (tương đương 41,07 ngày, ở 28 oC) nếu cá rô phi được được cho ăn 100 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1 trong thời gian 7 ngày. 0 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000 35,000 40,000 45,000 50,000 0 100 200 300 400 500 600 700
Thời gian (oC - ngày)
Ey rth ro m yc in A (µ g/ kg )
Hình 3.35:Đường hồi quy tuyến tính và giới hạn chấp nhận 1 phía (95%), với độ tin cậy 95%, của nồng độ erythromycin A trong cơ thịt tôm càng xanh đã được cho ăn erythromycin
trong 7 ngày (100 mg.kg-1thể trọng.ngày-1).
Hình 3.36:Đường hồi quy tuyến tính và giới hạn chấp nhận 1 phía (95%), với độ tin cậy 95%, của nồng độ erythromycin A trong cơ thịt cá rô phi đã được cho ăn erythromycin trong
7 ngày (50 mg.kg-1thể trọng.ngày-1).
MRL 30 µg/kg
Hình 3.37:Đường hồi quy tuyến tính và giới hạn chấp nhận 1 phía (95%), với độ tin cậy 95%, của nồng độ erythromycin A trong cơ thịt cá rô phi đã được cho ăn erythromycin trong
7 ngày (100 mg.kg-1thể trọng.ngày-1).
Theo các chương trình quản lý chất lượng Global GAP, Viet GAP, thậm chí BAP hay ASC thì thời gian ngưng thuốc được quy định hết sức chung chung theo công thức 750oD. Chúng tôi đã tìm hiểu cặn kẽ các chương trình này thì biết rằng công thức 750oD được áp dụng từ kết quả nghiên cứu trên cá hồi nước lạnh ở Bắc Âu. Chúng tôi đã tranh luận trực tiếp về vấn đề này thì được chính các chuyên gia thừa nhận rằng thời gian khuyến cáo ngưng thuốc theo công thức 750oD tuy chưa phù hợp cho các đối tượng tôm càng xanh, cá rô phi và ngay cả trên con tôm sú, tôm thẻ và cá tra nhưng vì chưa có các nghiên cứu chính thức nào cho các đối tượng thuỷ sản nuôi tại Việt Nam nên đành tạm thời áp dụng công thức này. Chúng tôi xét thấy động học đào thải thuốc, thời gian ngưng thuốc phụ thuộc rất lớn vào các yếu tố như: loại kháng sinh, liều lượng kháng sinh sử dụng, loài thuỷ sản nuôi, kích cỡ thuỷ sản, nhiệt độ môi trường nuôi, thổ nhưỡng môi trường nuôi. Vì thế không thể máy móc đem áp dụng công thức tính thời gian ngưng thuốc trên con cá hồi sống ở nước lạnh ở Bắc Âu vào các loài thuỷ sản nước ấm ở Việt Nam. Chính vì vậy, kết quả nghiên cứu của đề tài luận án là đầu tiên và hết sức quý báo, đóng góp vào dữ liệu cho các chương trình quản lý chất lượng Global GAP, Viet GAP, BAP và ASC.
3.4.2 Chuyển hóa sinh học của kháng sinh gốc
Đa phần các công trình nghiên cứu lâm sàng về chuyển hóa sinh học của erythromycin A tập trung vào đối tượng động vật trên cạn như chuột, chó, bê, cừu,...và người [3]. Rất hiếm công trình đã nghiên cứu về quá trình hấp thu và đào thải erythromycin trong cơ thể động vật thủy sản. Ở cá hồi vân Oncorhynchus mykiss, sau khi ăn thức ăn có erythromycin ở mức 100 mg.kg-1thể trọng.ngày-1trong thời gian 21 ngày (nhiệt độ nước 11,5°C) thì thời gian ngưng thuốc được xác định là 255°C_ngày [6]. Quá trình tích tụ và đào thải erythromycin ở cá hồiOncorhynchus tshawytschakhi được tiêm erythromycin vào cơ thịt cũng được nghiên cứu [11], [62]. Trên cá rô phi, tốc độ đào thải nhanh của furazolidone cũng cần ít nhất 22 ngày [63]. Bowser P.R. và cộng sự (2009) đã nghiên cứu đánh giá quá trình tích tụ và đào thải florfenicol trên cá rô phi, nhưng không chỉ ra được thời gian ngưng thuốc khi nào là phù hợp [64].
Cho đến nay vẫn chưa có bất kỳ một công trình nghiên cứu nào đánh giá quy luật chuyển hóa sinh học của erythromycin trên thuỷ sản nói chung, cũng như trên tôm càng xanh và cá rô phi nói riêng.
Thí nghiệm của đề tài này được bố trí ở điều kiện hoàn toàn giống với điều kiện nuôi thực tế (mục 2.2.2.4). Kết quả khảo sát cho thấy sàng lọc ban đầu trong nguyên liệu erythromycin base thì chỉ có erythromycin F (5 ppb) hiện diện. Các dạng chuyển hóa sinh học của erythromycin A theo thời gian trên cơ thịt tôm càng xanh và trên cơ thịt cá rô phi được thể hiện chi tiết ở bảng 3.7 và 3.8.
Các enzyme tiêu hóa như tryptase, pepsin, cellulase, amylase và các enzyme chuyển hóa khác như alkaline phosphatase (AKP), acid phosphatase (ACP), superoxide dismutase (SOD) và glutathione-S-transferase (GST) được biết đến là những enzyme chính có trong gan tụy của tôm càng xanh [24]. Riêng hệ enzyme đường ruột của cá rô phi được biết đến là maltase, leucine aminopeptidase, dipeptidyl aminopeptidase IV, lipase, non-specific esterases, và alkaline esterase [65]. Các enzyme này hoặc là do tính đặc hiệu cơ chất rất cao, hoặc là do đặc hiệu kiểu phản ứng, sẽ không tham gia xúc tác chuyển hóa erythromycin.
Khi xử lý ở liều 100 mg.kg-1thể trọng.ngày-1trong 7 ngày bằng con đường thức ăn, erythromycin A đã chuyển hóa sang erythromycin E (2,09 ppb) ở ngày thứ nhất sau ngưng thuốc. Ở ngày thứ 23 sau ngưng thuốc, erythromycin E (5,81 ppb) và erythromycin F (3,52 ppb) được phát hiện ở mức nồng độ không đáng kể. Điều này nói lên rằng quá trình chuyển hóa erythromycin là có xảy ra, nhưng sẽ không là mối quan ngại lớn nếu người nuôi tuân thủ đúng thời gian ngưng thuốc cũng như liều sử dụng.
Erythromycin được chuyển hóa nhanh chóng ở gan, chủ yếu thông qua quá trình khử methyl (N-demethylation), ở chuột, chó, thỏ, động vật nhai lại, người. Des-N- methyl-erythromycin là dẫn xuất chuyển hóa chính và chủ yếu nhất bằng con đường vi sinh của erythromycin. Dẫn xuất này được cho là đóng góp 1/3 hoạt tính phóng xạ của mật sau 2 giờ dùng erythromycin đồng vị. Có đến 7 dẫn xuất erythromycin được tạo thành, trong số đó, 2 dẫn xuất được bài tiết trong mật, 3 dẫn xuất được bài tiết trong nước tiểu, 2 dẫn xuất được bài tiết trong phân. Phần còn lại được tạo ra từ quá trình chuyển hóa erythromycin bởi vi khuẩn đường ruột. Des-N-methyl-erythromycin được bài tiết vào mật và thải ra phân. Erythromycin được hấp thu ở ruột non ở dạng erythromycin base [1].
Các cytochrome P-450 isozyme ở gan của chuột xúc tác quá trình khử methyl hóa erythromycin rất giống với dạng cytochrome P-450 ở gan của thỏ, điều này có thể suy rộng ra đến tôm càng xanh vì ở gan tụy tôm càng xanh có 1 protein tương tự như dạng cytochrome P-450 ở chuột. Cytochrome P-450 3A là cytochrome P-450 phổ biến nhất và chủ yếu xúc tác phân giải erythromycin. Có một sự tương đồng rất lớn được tìm thấy giữa Cytochrome P-450 ở cừu tham gia N-demethylation erythromycin và dạng được phân lập ở thỏ. Ở gia súc, một dạng cytochrome P-450 isozyme tham gia xúc tác quá trình N-demethylation erythromycin [1].
Bảng 3.7:Các dạng chuyển hóa sinh học của erythromycin theo thời gian trên cơ thịt tôm càng xanh được cho ăn ở liều 50 &100 mg.kg-1thể trọng.ngày-1trong 7 ngày
Tên mẫu Các dẫn xuất củaerythromycin MDL (ppb) Hàm lượng (ppb) 50 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1 100 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1 Erythromycin Base Erythromycin B 1,0 KPH KPH Erythromycin C 1,0 KPH KPH Erythromycin D 1,0 KPH KPH Erythromycin E 1,0 KPH KPH Erythromycin F 1,0 5,00 5,00
Cơ thịt tôm càng xanh ở ngày thứ 1 sau ngưng thuốc Erythromycin B 2,0 KPH KPH Erythromycin C 2,0 KPH KPH Erythromycin D 2,0 KPH KPH Erythromycin E 2,0 KPH 2,09 Erythromycin F 2,0 KPH KPH
Cơ thịt tôm càng xanh ở ngày thứ 23 sau ngưng thuốc Erythromycin B 2,0 KPH KPH Erythromycin C 2,0 KPH KPH Erythromycin D 2,0 KPH KPH Erythromycin E 2,0 KPH 5,81 Erythromycin F 2,0 KPH 3,52
MDL: Giới hạn phát hiện của phương pháp, KPH: Không phát hiện
3.4.2.2 Cá rô phi
Khi cá rô phi được xử lý erythromycin base ở liều thấp (nhóm A), ở ngày thứ nhất sau ngưng thuốc thì không phát hiện được bất kỳ dẫn xuất chuyển hóa nào của erythromycin. Tuy nhiên đến ngày thứ 23 thì phát hiện có các dẫn xuất erythromycin E (2,30 ppb) và erythromycin F (2,37 ppb) trong cơ thịt cá, dư lượng này là không đáng lo ngại. Trong trường hợp cá rô phi được xử lý erythromycin base ở liều cao (nhóm B) thì ngay ở ngày thứ nhất sau ngưng thuốc, phát hiện thấy dẫn xuất chuyển hóa erythromycin C (131,5 ppb) và erythromycin E (258,3 ppb). Ở ngày thứ 23 sau ngưng
thuốc, erythromycin E (6,94 ppb) và erythromycin F (5,90 ppb) được phát hiện ở mức nồng độ không đáng kể.
Bảng 3.8:Các dạng chuyển hóa sinh học của erythromycin theo thời gian trên cơ thịt cá rô phi được cho ăn ở liều 50 & 100 mg.kg-1thể trọng.ngày-1trong 7 ngày
Tên mẫu Các dẫn xuấtcủa erythromycin MDL (ppb) Hàm lượng (ppb) 50 mg.kg-1thể trọng.ngày-1 100 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1 Erythromycin Base Erythromycin B 1,0 KPH KPH Erythromycin C 1,0 KPH KPH Erythromycin D 1,0 KPH KPH Erythromycin E 1,0 KPH KPH Erythromycin F 1,0 5,00 5,00
Cơ thịt cá rô phi ở ngày thứ 1 sau ngưng thuốc Erythromycin B 2,0 KPH KPH Erythromycin C 2,0 KPH 131,49 Erythromycin D 2,0 KPH KPH Erythromycin E 2,0 KPH 258,28 Erythromycin F 2,0 KPH KPH
Cơ thịt cá rô phi ở ngày thứ 23 sau ngưng thuốc Erythromycin B 2,0 KPH KPH Erythromycin C 2,0 KPH KPH Erythromycin D 2,0 KPH KPH Erythromycin E 2,0 2,30 6,94 Erythromycin F 2,0 2,37 5,90
MDL: Giới hạn phát hiện của phương pháp, KPH: Không phát hiện
Trong cá rô phi, các enzyme như maltase, leucine aminopeptidase, dipeptidyl aminopeptidase IV, lipase, non-specific esterases, và alkaline phosphatase là những enzyme hiện diện ở các vị trí đặc biệt dọc ở 4 đoạn ruột đầu tiên. Maltase hoạt động mạnh ở đoạn ruột thứ ba. Trong khi aminopeptidases và alkaline phosphatase hoạt động ở 3 đoạn ruột đầu. Lipase hoạt động mạnh nhất ở hai đoạn ruột đầu. Các enzyme esterase không đặc hiệu thì được thấy ở bốn đoạn ruột đầu. Dipeptidylaminopeptidase IV được thấy ở tất cả các lớp cơ bản của các đoạn ruột, bao gồm cả phần ruột cuối.
Bốn vị trí đầu tiên của ruột đóng vai trò quan trọng nhất trong việc tiêu hóa, hấp thu các chất [66].
Khi phân tích cơ chế chuyển hóa, thấy rằng: Có sự oxy hóa tại vị trí R2và R3 trong phân tử erythromycin A (xem bảng 1.1) làm biến đổi erythromycin A thành erythromycin E ở cả tôm càng xanh và cá rô phi và có sự khử methyl của R4làm biến đổi erythromycin A thành erythromycin C ở cá rô phi. Như vậy các enzyme oxy hóa khử có trong gan và trong mô cơ của tôm và cá đã xúc tác phân giải erythromycin.
Gadagbui B.K. và cộng sự (1996), khi nghiên cứu đặc điểm loài về các enzyme chuyển hóa sinh học ở gan cá rô phi (Oreochromis niloticus) và cá trê (Clarias anguillaris) thấy rằng: Cùng với các enzyme đường ruột, các enzyme gan tụy của cá rô phi như CYP1A protein, 7-ethoxyresorufin O-deethylase (EROD), glutathione S- transferase (GST), UDP-glucuronasyl transferase (UDP-GT) và lipogenic enzyme là những enzyme chủ đạo và có liên quan mật thiết với quá trình khử methyl từ erythromycin [65]. Điều này đã lý giải các dẫn xuất chuyển hóa xuất hiện ở mức thấp ở ngày thứ 23 sau ngưng thuốc.
Một cơ chế giải thích khác cho sự hình thành nên erythromycin C. Đó là kết quả của các phản ứng trùng ngưng liên tiếp và sản sinh ra 7 đơn vị cacbon - số 3. Chu kỳ thứ tư tham gia vào việc hình thành nhóm β-keto (khử β-keto, mất nước và khử enoyl) để tạo ra nhóm methylene gắn vào vị trí C-7 ở vòng lactone. Erythromycin C được tạo ra từ việc bất hoạt quá trình khử enoyl trong suốt chu kỳ thứ 4 của sinh tổng hợp macrolactone. Điều này nhờ vào sự tham gia của enzyme enoyl reductase. Các enzyme chủ yếu tham gia vào quá trình chuyển hóa erythromycin A để tạo ra các dẫn xuất erythromycin khác bao gồm: acyltransferase, dehydratase, enoyl reductase, β-keto reductase, β-ketoacyl-ACP synthase, thioesterase. Vòng lactone được cho là cơ chất cho các enzyme điều chỉnh mycarosyl và desosaminyltransferases, C-12 hydroxylase [67].
Vậy nên cơ chế tổng hợp erythromycins có thể thông qua hình thành vòng lactone 14-membered macrolide và việc bổ sung thêm 2 phân tử đường: L-mycarose ở C-3 và D-desosamine ở C-5 để hình thành erythromycin D. Sau erythromycin D, con đường bị rẽ nhánh như hình 3.38.
Erythromycin D được hydroxylate hóa ở vị trí C-12 để hình thành erythromycin C, hoặc được methyl hóa ở vị trí C-3” để hình thành erythromycin B. Trong khi đó cơ chế hình thành erythromycin A từ erythromycin C được giải thích rõ bằng phản ứng methyl hóa ở vị trí C-3” [68].
Việc hình thành erythromycin F khi mà H-2 không còn kết nối với nhóm methyl mà thay vào đó là nhóm H-3, nhóm methyl C-2 bị oxi hóa và nhóm C-12 bị hydroxyl hóa. Erythromycin F cũng được là tiền chất để hình thành erythromycin E. Erythromycin E khác với erythromycin A ở vị trí nhóm thế 12-OH; nhóm 2-CH3và C- 1” bị oxi hóa [69].
KẾT LUẬN
Các kết quả đạt được cho phép đi tới kết luận về những đóng góp mới của đề tài này về mặt lý thuyết và thực tiễn gồm:
1. Đề tài đã xây dựng được phương pháp sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm trong việc phân tích dư lượng kháng sinh erythromycin trong tôm, cá đạt được giới hạn phát hiện (LoD = 0,52 ppb), đáp ứng yêu cầu giới hạn dư lượng cho phép theo tiêu chuẩn quốc tế (Codex, FAO/WHO, EU, Mỹ, Canada, Úc), rút ngắn thời gian phân tích, đơn giản hóa kỹ thuật, tiết kiệm chi phí. Các thông số thích hợp của quá trình định lượng erythromycin A: dung dịch nền Amoni axetat 0,1 M; pH 8,0; acetonitrile