3.1.5.1 Nghiên cứu chiều quét
Hình 3.11: Phổ erythromycin theo chiều quét (màu xanh lá: quét xuôi, màu đỏ: quét ngược)
Phản ứng điện hóa của các chất hữu cơ trên cực giọt thủy ngân thường không thuân nghịch hoàn toàn nên chiều quét thế có thể ảnh hưởng rất nhiều đến sự xuất hiện của sóng và dạng sóng. Để thu được sóng erythromycin tốt nhất cho mục đích phân tích, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của chiều quét thế trong vùng từ 0 Volt đến -1.800 Volt.
Khi quét thế từ 0 Volt đến -1.800 Volt chúng tôi thu được sóng rõ và ổn định. Khi quét thế từ -1.800 Volt về 0 Volt hầu như không thu được sóng. Vì thế các thí nghiệm tiếp theo được thực hiện bằng cách quét thế tăng dần về phía âm.
3.1.5.2 Nghiên cứu chọn thế bắt đầu ghi phổ Vstart
phụ điện hóa khi áp thế một chiều lên cực giọt thủy ngân, cũng như tính thuận nghịch, do đó việc chọn thế một chiều bắt đầu ghi phổ cũng có thể có ảnh hưởng tới cường độ dòng đo được.
(a) (b) (c) (d)
(e) (f) (g) (h)
Hình 3.12: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở Vstart(a: -400 mV; b: -500 mV; c: -600 mV; d: - 700 mV; e: -800 mV; f: -900 mV; g: -1000 mV; h: -1100 mV)
Chúng tôi đã tiến hành ghi phổ erythromycin nồng độ 100 ppb trong dung dịch nền Amoni axetat 0,1 M; pH 8,0 với các giá trị thế bắt đầu ghi phổ Vstartkhác nhau. Mode PSA-F, quét xuôi, Vstep: 4 mV, Vpulse: 30 mV, Tdrop: 1000 ms, Velectrolise: -700 mV, Telectrolise: 3 s, Tstabilize: 1 s. Kết quả được trình bày ở hình 3.12.
Về lý thuyết khi làm việc với cực giọt thủy ngân, người ta thường đặt giá trị Vstart trong vùng từ 400 mV đến -1.800 mV mặc dù thiết kế máy cho phép cài đặt bất cứ giá trị Vstart nào trong khoảng thế từ 4.000 mV đến -4.000 mV. Không nên đặt thế quá dương trước 400 mV hay quá âm sau -1.800 mV. Ở thế quá dương sẽ xảy ra phản ứng hòa tan thủy ngân, ở thế quá âm xảy ra quá trình phân hủy nền. Thường ta đặt Vstarttrước thế đỉnh khoảng 300 mV để chân sóng đủ rõ.
y = 0,1332x + 162,8 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 -1200 -1100 -1000 -900 -800 -700 -600 -500 -400 -300 -200 Vstart (mV) C ư ờ ng đ ộ dò ng e ry th ro m yc in A (n A )
Hình 3.13:Ảnh hưởng của Vstartđến cường độ dòng của erythromycin A
Qua kết quả hình 3.13 ta thấy nếu bắt đầu ghi phổ càng sớm thì dòng thu được càng lớn. Nguyên nhân là do thời gian hấp phụ hoạt chất trước khi xảy ra phản ứng điện hóa kéo dài, lượng erythromycin tích lũy trên mặt cực càng lớn nên sóng càng cao. Chúng tôi không tiến hành ghi phổ ở thế sớm hơn nữa, vì vùng gần 0 Volt xảy ra phản ứng khử của oxy luôn có mặt trong dung dịch và có thể ảnh hưởng đến sự tích góp của hoạt chất cần phân tích. Các thí nghiệm phân tích sau này sẽ được ghi với Vstart -400 mV. Do đó phản ứng oxi hoá - khử giữa erythromycin và oxi hoà tan trong dung dịch được giảm thiểu đến mức thấp nhất.
3.1.5.3 Nghiên cứu chọn bước thế 1 chiều Vstep
Máy sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm ANALYZER SQF-505 có tốc độ quét thế và ghi phổ rất nhanh. Trong khoảng thời gian 2 giây máy có thể quét thế một chiều từ 0,0 V đến -2,0 V; có thể thực hiện hàng nghìn phép đo dòng Faraday
xoay chiều, tính toán và hiển thị tức thời phổ ghi được trên màn hình. Tốc độ quét thế một chiều đôi khi có ảnh hưởng ít nhiều đến phổ và kết quả đo dòng, vì vậy chúng tôi đã tiến hành ghi phổ dung dịch erythromycin nồng độ 100 ppb trong dung dịch nền Amoni axetat 0,1 M; pH 8,0 một số tốc độ quét thế một chiều tương ứng với thế bước Vstep = 6, 8, 10 mV/ bước thế. Mode PSA-F, quét xuôi, Vstart:-400 mV, Vpulse: 30 mV, Tdrop: 3000 ms, Velectrolise: -700 mV, Telectrolise: 3 s, Tstabilize: 1 s. Khi khảo sát các bước thế 2 và 4 mV thì giọt rơi trước điểm kết thúc, hoặc không ổn định, không ghi được phổ nên không trình bày phổ ở bước thế 2 và 4 mV mà chỉ trình bày phổ ở ba thế 6, 8, 10 mV. Chúng tôi thu được các phổ ở hình 3.14.
(a) (b) (c)
Hình 3.14: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở Vstep(a: 6 mV; b: 8 mV; c: 10 mV)
y = -12,395x + 284,64 150 160 170 180 190 200 210 220 4 6 8 10 12 Vstep (mV) C ư ờn g độ d òn g er yt hr om yc in A (n A )
Ta thấy tốc độ quét thế cũng có ảnh hưởng đến chiều cao sóng. Phổ ghi với chế độ Vstep = 6 mV có giá trị cao nhất. Nguyên nhân của hiện tượng này là khi quét thế tốc độ quá cao, sự khuếch tán của hoạt chất đến bề mặt thủy ngân không đủ bổ sung cho các hoạt chất đã tham gia phản ứng điện hóa. Chúng tôi cần có phép phân tích với độ nhạy càng cao càng tốt nên sẽ tiến hành ghi phổ với chế độ Vstep= 6 mV.
3.1.5.4 Nghiên cứu chọn biên độ xung vuông Vpulse
Trong cực phổ sóng vuông quét nhanh người ta áp lên cực giọt thủy ngân hai thành phần thế: thế một chiều tăng dần theo thời gian và thế xoay chiều là các xung vuông. Thế một chiều hay được dùng trong khoảng từ 0 volt đến -2,0 volt. Các xung vuông xoay chiều trong máy SQF-505 có biên độ 10 – 20 – 30 – 40 mV và tần số 250 Hz. Người ta tiến hành phép đo cường độ dòng Faraday xoay chiều ở đầu xung và cuối xung vuông. Phổ sóng vuông là đường thể hiện dãy hiệu số hai lần đo và thế một chiều.
(a) (b) (c) (d)
Hình 3.16:Phổ erythromycin 5 lần lặp lại ở Vpulse
(a: 10 mV; b: 20 mV; c: 30 mV; d: 40 mV)
Chúng tôi đã tiến hành ghi phổ erythromycin nồng độ 100 ppb trong nền Amoni axetat 0,1 M; pH 8,0 với các biên độ khác nhau. V : -400 mV, V : 6 mV, T :
3000 ms, Velectrolise: -700 mV, Telectrolise: 3 s, Tstabilize: 1 s. Chúng tôi thu được các phổ ở hình 3.16. y = 15,258x + 78,47 100 200 300 400 500 600 700 800 0 10 20 30 40 50 Vpulse (mV) C ư ờn g độ d òn g er yt hr om yc in A (n A )
Hình 3.17:Ảnh hưởng của Vpulseđến cường độ dòng của erythromycin A
Ta thấy cường độ dòng đo được khi dùng xung 40 mV cao gấp 3 lần khi dùng xung 10 mV. Độ lệch chuẩn khi dùng xung 30 mV khoảng 1,5% , với xung 40 mV khoảng 2%. Trong kiểm tra dư lượng kháng sinh, thiết bị có độ nhạy càng cao càng tốt, nên chúng tôi sẽ dùng các phép đo với biên độ xung = 40 mV. Về nguyên tắc, nếu dùng xung có biên độ càng lớn thì cường độ dòng càng cao, phép đo càng nhạy, nhưng dùng biên độ xung cao quá độ phân giải sẽ thấp, độ lặp của kết quả đo cũng kém đi.
3.1.5.5 Nghiên cứu chọn thời điểm quét thế trong đời sống 1 giọt thủy ngân Tdrop
Trong kỹ thuật cực phổ sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm, người ta dùng các giọt thủy ngân chậm hình thành tự nhiên với đời sống giọt ổn định khoảng 10 giây một giọt. Phần mềm SQF-505 cho phép bắt đầu ghi phổ tại bất cứ thời điểm nào kể từ khi giọt thủy ngân bắt đầu hình thành. Quá trình ghi phổ chỉ tiến hành mất một, hai giây.
Giá trị Tdrop này thể hiện thời điểm bắt đầu ghi sóng kể từ thời điểm hình thành một giọt thủy ngân mới. Để ghi toàn phổ ta nên chọn giá trị 1.000 ÷ 5.000 ms để trong quá trình ghi giọt không bị rơi. Giá trị Tdropcàng lớn sóng càng lớn vì được ghi ở vùng giọt lớn, cường độ dòng qua cực làm việc càng cao, độ nhạy càng cao. Mode PSA-F, quét xuôi, Vstart: -400 mV, Vstep: 6 mV, Vpulse: 40 mV, Velectrolise: -700 mV, Telectrolise: 3 s, Tstabilize: 1 s. Kết quả phổ được trình bày ở hình 3.18.
Qua kết quả ở hình 3.19 ta thấy: Khi giá trị Tdrop càng cao thì dòng đo được càng lớn, độ nhạy càng tăng. Khi ghi ở chế độ Tdrop = 5.000 ms, cường độ dòng lớn gấp khoảng 4 lần khi ghi ở chế độ Tdrop= 1.000ms và các kết quả ghi rất ổn định. Nếu dùng các giá trị Tdroplớn hơn (6.000, 7.000 ms) giọt sẽ bị rơi khi đang ghi phổ nên kết quả ghi không tốt, vì vậy với điện cực này chúng tôi sẽ dùng chế độ Tdrop = 5.000 ms trong các nghiên cứu định lượng.
(a) (b) (c) (d) (e)
Hình 3.18: Phổ erythromycin 5 lần lặp lại ở Tdrop
(a: 1.000 ms; b: 2.000 ms; c: 3.000 ms; d: 4.000 ms; e: 5.000 ms) y = 0,0631x + 70,59 100 150 200 250 300 350 400 450 0 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 Tdrop (ms) C ư ờn g độ d òn g er yt hr om yc in A (n A )
3.1.5.6 Nghiên cứu chọn thời gian điện phân tích góp Telectrolise
Để tăng độ nhạy cho các phương pháp phân tích điện hóa người ta thường dùng kỹ thuật Stripping với quá trình tiền tích góp để làm tăng nồng độ chất cần phân tích trên bề mặt cực làm việc trước mỗi quy trình ghi phổ.
Nhờ kỹ thuật này mà kỹ thuật phân tích điện hóa đã trở thành một trong những phương pháp có độ nhạy cao nhất. Đôi khi người ta có thể đạt đến giới hạn phát hiện vài chục ppb chỉ với những thiết bị không quá đắt tiền.
Với các chất hữu cơ, kỹ thuật stripping dựa trên hiện tượng các chất hữu cơ bị hấp phụ trên mặt giọt thủy ngân hay cực rắn khi chọn được thế tích góp và dung dịch nền thích hợp. Người ta có thể tiến hành kỹ thuật đo này trên cực rắn quay, cực giọt thủy ngân treo hay ngồi, còn máy ANALYZER SQF-505 cho phép thực hiện kỹ thuật stripping trên cực giọt chậm.
(a) (b) (c)
Hình 3.20:Phổ erythromycin ghi 5 lần với Telectrolise
(a: 3.000 ms; b: 4.000 ms; c: 5.000 ms)
Người ta dùng một cực giọt thủy ngân càng chậm càng tốt và tiến hành tích góp chất cần phân tích trên bền mặt giọt khoảng vài giây trước khi tiến hành ghi phổ. Cực càng chậm thì càng có thể kéo dài thời gian tích góp, phép đo càng nhạy. Chúng tôi đã tiến hành ghi phổ erythromycin sau các khoảng thời gian tích góp 3 - 4 - 5 giây. Mode
PSA-F, quét xuôi, Vstart: -400 mV, Vstep: 6 mV, Vpulse: 40 mV, Tdrop: 5000 ms, Velectrolise: -700 mV, Tstabilize: 1 s. Chúng tôi thu được các phổ ở hình 3.20.
y = 181,7x + 815,2 1300 1350 1400 1450 1500 1550 1600 1650 1700 1750 1800 2 3 4 5 6 Telectrolise (s) C ư ờn g độ d òn g er yt hr om yc in A (n A )
Hình 3.21:Ảnh hưởng của Telectroliseđến cường độ dòng của erythromycin A
Các kết quả ghi được có cường độ dòng cao gấp khoảng 4 lần so với cách đo không có quá trình tích góp với độ lặp lại của kết quả đo rất tốt. Độ lệch chuẩn khi sử dụng thời gian tích góp 5.000 ms là 0,3%.
Nếu dùng cực thủy ngân treo hay ngồi chúng ta có thể tiến hành tích góp trong vài trăm giây và nếu kết hợp thêm quá trình khuấy dung dịch để tăng cường hiệu quả tích góp hy vọng có thể phân tích erythromycin ở vùng nồng độ dưới 1 ppb. Vì thời gian và thiết bị có hạn nên chúng tôi chưa tiến hành được thí nghiệm này.
Trong kỹ thuật stripping trên cực rắn hay cực giọt thủy ngân tĩnh thời gian điện phân tích góp càng kéo dài thì dòng thu được càng lớn. Để phân tích siêu vết đôi khi thời gian tích góp kéo dài vài phút kèm theo sự hỗ trợ khuấy để tăng hiệu quả tích góp.
Khi dùng kỹ thuật stripping trên cực giọt chậm thời gian điện phân tích góp chỉ có thể kéo dài trong vài giây. Nếu kéo dài thời gian tích góp giọt sẽ bị rơi và không thu được phổ mong muốn.
Wang và cộng sự (2000) đã dùng kỹ thuật stripping hấp phụ để định lượng erythromycin trên cực rắn carbon thấy được thời gian điện phân tích góp chỉ tuyến tính trong khoảng 90 s đến 120 s [22].
3.1.5.7 Nghiên cứu chọn thế điện phân tích góp Velectrolise
Việc chọn thế một chiều để tiến hành tích góp cũng rất quan trọng, nhất là khi phân tích các chất vô cơ. Khi phân tích siêu vết các kim loại nặng người ta phải chọn
ion kim loại bị khử về dạng kim loại và được tích góp trên mặt cực thủy ngân dưới dạng hỗn hống. Với các kháng sinh, quá trình tích góp thường xảy ra theo cơ chế hấp phụ điện hóa, việc chọn thế tích góp thường qua thực nghiệm.
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với các thế tích góp: -400, -900, -1100 mV. Mode PSA-F, quét xuôi, Vstart: -400 mV, Vstep: 6 mV, Vpulse: 40 mV, Tdrop: 5000 ms, Telectrolise: 5 s, Tstabilize: 1 s. Chúng tôi thu được các phổ dưới đây.
(a) (b) (c)
Hình 3.22: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở Velectrolise
(a: -400 mV ; b: -900 mV; c: -1.100 mV) y = -0,2187x + 1620,8 1650 1700 1750 1800 1850 1900 -1200 -1100 -1000 -900 -800 -700 -600 -500 -400 -300 Velectrolise (mV) C ư ờn g độ d òn g er yt hr om yc in A (n A )
Hình 3.23:Ảnh hưởng của Velectroliseđến cường độ dòng của erythromycin A
Trong khoảng thế trên hiệu ứng tích góp không khác nhau đáng kể, thế -1100 mV có kết quả phù hợp hơn, nên chúng tôi chọn thế này cho các phép đo bằng kỹ thuật
stripping. Velectrolise-1100 mV cũng là điều kiện biên mà vẫn được chọn, đó chính là do chiều quét là chiều quét xuôi (0 đến -1800 mV), mà thế bán sóng E1/2= -1430 mV nên thế tích góp không thể tiến sát E1/2mà phải dừng lại ít nhất cách E1/2khoảng |300 mV|, tức là dừng lại ở -1100 mV để đảm bảo -1100 mV|300 mV|-1400 mV.
Wang và cộng sự (2000) đã dùng kỹ thuật stripping hấp phụ để định lượng erythromycin trên cực rắn carbon khảo sát thế điện phân tích góp trong khoảng 0 mV đến + 500 mV thì thấy rằng thích hợp tại + 200 mV [22].
3.1.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của các ion vô cơ Na+, K+, Ca++, Mg++, Fe3+, Cl-, SO42-, HPO42-tới phổ erythromycin
Các ion trên thường có mặt trong các mẫu phân tích từ tôm, cá. Về mặt lý thuyết, các ion trên không cho phản ứng điện hóa ở vùng thế của sóng erythromycin (lân cận -1,4 V). Ngoài ra, trong quá trình chiết tách thì các ion này bị tách loại và nếu còn lại thì cũng ở mức hàm lượng rất thấp (ở mức ppb). Nhưng để bảo đảm chắn chắn sự có mặt của các ion trên không ảnh hưởng tới phổ của erythromycin chúng tôi đã tiến hành ghi phổ của erythromycin nồng độ 100 µg/kg trong dung dịch nền ammonium axetat 0,1 M pH 8,0 với nồng độ của các ion trên ở hàm lượng ppm. Kết quả thấy rằng ở dù ở nồng độ 05 ppm rất cao như vậy thì các ion K+, Na+, Ca2+, Mg2+, Fe3+, Cl-, SO42-, HPO42- ảnh hưởng không đáng kể đến cường độ dòng của erythromycin (xem hình 3.1 đến hình 3.8 tại phụ lục).
3.1.7 Nghiên cứu xây dựng đường chuẩn
Dùng micropipette hút 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 L dung dịch gốc 250 ppm erythromycin được chuẩn bị bằng acetonitril cho lần lượt vào 10 bình định mức 25 mL, thêm dung dịch nền Amoni axetat 0,1 M; pH 8,0 cho đến vạch định mức 25 mL. Nồng độ erythromycin trong các bình định mức lúc này là 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ppb. Chuyển lần lượt 25 mL các dung dịch vừa chuẩn bị vào cốc đo. Các thông số đo: Vstart= -400 mV, Vstep= 6 mV, Vpulse= 40 mV, Tdrop= 5.000 ms, Telectrolise= 5 s, Velectrolise= -1.100 mV. Mỗi phổ tiến hành ghi 5 lần và dùng
giá trị cường độ dòng trung bình của 5 lần đó để xây dựng đường chuẩn nhằm để bảo đảm kết quả có độ tin cậy cao.
Giới hạn phát hiện LoD đo được là 0,52 ppb. Đường chuẩn tuyến tính trong