CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Nghiên cứu tìm điều kiện thích hợp cho việc định lượng erythromycin trên thiết bị ANALYZER SQF-505
3.1.1 Nghiên cứu thăm dò định hướng, chọn vùng quét và chiều quét thế
Trong nghiên cứu sử dụng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm cho mục đích xây dựng phương pháp phân tích một chất nào đó trong những đối tượng mẫu khác nhau, công việc ban đầu mất nhiều thời gian là xác định điều kiện phân tích thích hợp cho chất đó gồm những công đoạn nghiên cứu sau:
1- Nghiên cứu tìm dung dịch nền có kết quả đo tốt nhất
2- Nghiên cứu chọn các thông số chạy máy để thu kết quả tốt nhất
3- Nghiên cứu tìm quy trình chuẩn bị mẫu đo để hạn chế sự ảnh hưởng của một số chất có mặt trong mẫu đo và cũng để tăng nồng độ chất cần đo trong dung dịch đem đo.
4- So sánh kết quả phân tích đang nghiên cứu với kết quả phân tích bằng những kỹ thuật truyền thống khác.
Trước khi bắt đầu những công việc nghiên cứu trên người ta thường tiến hành nghiên cứu thăm dò định hướng dựa trên công thức cấu tạo, tính chất hóa lý của chất cần phân tích. Việc nghiên cứu thăm dò thường là việc lựa chọn sơ bộ dung dịch nền, vùng quét thế, chiều quét thế.
Hình 3.1:Các nhóm chức trong công thức cấu tạo của erythromycin
Erythromycin khá dễ tan trong nước nên các dung dịch nền dùng cho nghiên cứu chủ yếu là dung dịch nước với các chất điện ly khác nhau. Trong công thức cấu
một số dị vòng chứa oxy được liên kết một nguyên tử oxy nữa nên có thể dự đoán sẽ xuất hiện những sóng khử trong khoảng thế từ -1,0 V đến -1,7 V. Vì thế chúng tôi sẽ tập trung nghiên cứu ở vùng thế này.
Qua thăm dò sơ bộ chúng tôi thấy có một vài sóng trong khoảng thế này, nhưng sóng ở thế vùng khoảng -1,4 V là tốt nhất đối với mục đích phân tích định lượng, nên các khảo sát tiếp theo chúng tôi tập trung để tìm điều kiện thích hợp cho sóng này.
Hình 3.2:Phổ erythromycin trong nền đệm Amoni axetat pH 8,0 (ghi 5 lần)
Do tính chất thuận nghịch của phản ứng điện hóa cũng như đặc tính hấp phụ trên mặt giọt thủy ngân của các chất hữu cơ rất khác nhau, nên chiều quét thế cũng như đặc điểm của dung dịch nền ảnh hưởng rất nhiều tới sự xuất hiện sóng của chất cần nghiên cứu.
Với erythromycin khi quét thế một chiều theo hướng tăng dần về phía âm ta sẽ thu được sóng rất rõ ở vùng lân cận -1,4 V. Nếu quét theo chiều ngược lại hầu như không có sóng. Vì vậy các nghiên cứu tiếp theo sẽ quét thế theo hướng tăng dần về thế âm.
3.1.2 Nghiên cứu tìm dung dịch nền và pH thích hợp
Khảo sát loại dung dịch nền có ý nghĩa hết sức quan trọng trong phân tích bằng kỹ thuật cực phổ sóng vuông. Dung dịch nền là các dung dịch chứa các chất điện ly trơ
thích hợp để bảo đảm cho việc di chuyển của chất phân tích tới bề mặt cực làm việc được thực hiện chủ yếu bằng sự khuyếch tán do sự chênh lệch nồng độ chứ không phải bằng sự dịch chuyển dưới tác dụng của điện trường.
Trong các phản ứng điện hóa các chất hữu cơ đều có sự tham gia của ion H+, vì vậy pH của dung dịch ảnh hưởng rất nhiều đến sự xuất hiện sóng của các chất cần nghiên cứu. pH có thể ảnh hưởng đến tính chất thuận nghịch của phản ứng, sự hấp phụ trên mặt giọt thủy ngân hay làm cho phản ứng xảy ra với những giai đoạn khác nhau. Vì vậy để nghiên cứu xây dựng một quy trình phân tích một chất hữu cơ nào đó bằng kỹ thuật cực phổ sóng vuông người ta luôn khảo sát ảnh hưởng của pH dung dịch nền.
Trong các thí nghiệm dưới đây chúng tôi tiến hành nghiên cứu phổ erythromycin trong các dung dịch đệm thường dùng có các giá trị pH khác nhau, từ đó có thể tìm được dung dịch nền và pH thích hợp cho việc định lượng.
a) Nền Natri axetat 0,1M
Tiến hành ghi phổ của dung dịch erythromycin nồng độ 100 ppb trong dung dịch Natri axetat 0,1 M với các pH : 5,0 – 6,0 – 7,0 – 8,0 – 9,0 – 10,0. Mode PSA-F, quét xuôi, Vstart: -400 mV, Vstep: 4 mV, Vpulse: 30 mV, Tdrop: 3000 ms, Velectrolise: -700 mV, Telectrolise: 3 s, Tstabilize: 1 s.
Kết quả phổ thu được được thể hiện ở hình 3.3 (a, b, c, d, e, f) tương ứng với các pH : 5,0 – 6,0 – 7,0 – 8,0 – 9,0 – 10,0 trong dung dịch Natri axetat 0,1 M thì thấy rằng pH 8,0 cho sóng rõ và cường độ dòng phù hợp nhất (I = 333,4 ± 4,7 nA, E1/2 = - 1.430 mV).
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
Hình 3.3:Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Natri axetat 0,1M (a: pH 5,0; b: pH 6,0; c: pH 7,0; d: pH 8,0; e: pH 9,0; f: pH 10,0)
b) Nền Amoni axetat 0,1M
Tiến hành ghi phổ của dung dịch erythromycin nồng độ 100 ppb trong dung dịch Amoni axetat 0,1 M với các pH : 7,0 - 8,0 - 9,0 - 10,0. V : -400 mV, V : 4
mV, Vpulse: 30 mV, Tdrop: 3000 ms, Velectrolise: -700 mV, Telectrolise: 3 s, Tstabilize: 1 s. Chúng tôi thu được các kết quả sau:
(a) (b) (c) (d)
Hình 3.4:Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Amoni axetat 0,1M (a: pH 7,0; b: pH 8,0; c: pH 9,0; d: pH 10,0)
Qua các kết quả trên ta thấy ở tất cả các dung dịch nền trên đều thu được sóng của erythromycin, nhưng ở pH 8,0- 9,0-10,0 thu được sóng rất rõ và ổn định, đặc biệt ở pH 8,0 là pH thích hợp nhất (I = 351,7 ± 5,7 nA, E1/2= -1.430 mV)
c) Nền Citrat-Phosphat 0,1M
Chúng tôi tiến hành ghi phổ của dung dịch erythromycin nồng độ 100 ppb trong dung dịch đệm Citrat - Phosphat 0,1 M với các pH : 6,0 - 7,0 - 8,0 - 9,0. Vstart: -400 mV, Vstep: 4 mV, Vpulse: 30 mV, Tdrop: 3000 ms, Velectrolise: -700 mV, Telectrolise: 3 s, Tstabilize: 1 s.
(a) (b) (c) (d) Hình 3.5:Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Citrat – Phosphat 0,1M
(a: pH 6,0; b: pH 7,0; c: pH 8,0; d: pH 9,0)
Các kết quả trên tất cả các dung dịch nền trên đều thu được sóng của erythromycin, nhưng ở pH 7,0 - 8,0 - 9,0 thu được sóng rất rõ và ổn định. Từ đó ta thấy có thể dùng dung dịch đệm Citrat – Phosphat trong vùng trung tính và kiềm với khoảng pH khá rộng để định lượng erythromycin.
d) Nền Borax 0,1 M
Chúng tôi tiến hành ghi phổ của dung dịch erythromycin nồng độ 100 ppb trong dung dịch đệm borax 0,1 M với các pH : 8,0 – 9,0 – 10,0. Thông số chạy máy Vstart: - 400 mV, Vstep: 4 mV, Vpulse: 30 mV, Tdrop: 3000 ms, Velectrolise: -700 mV, Telectrolise: 3 s, Tstabilize: 1 s.
Chúng tôi thu được các phổ (hình 3.6). Qua kết quả thu được này chúng ta thấy có thể dùng dung dịch đệm này ở pH 8,0 cho mục đích định lượng.
(a) (b) (c) Hình 3.6:Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Borax 0,1M
(a: pH 8,0; b: pH 9,0; c: pH 10,0)
e) Nền đệm Tris
(a) (b)
Chúng tôi cũng đã tiến hành ghi phổ của dung dịch erythromycin nồng độ 100 ppb trong dung dịch đệm Tris với các pH: 7,0-8,0-9,0. Thông số chạy máy Vstart: -400 mV, Vstep: 4 mV, Vpulse: 30 mV, Tdrop: 3000 ms, Velectrolise: -700 mV, Telectrolise: 3 s, Tstabilize: 1 s.
Các phổ thu được được trình bày ở hình 3.7 không thật thích hợp cho việc định lượng.
Bảng 3.1:Sự biến đổi cường độ dòng (nA)của erythromycin A theo loại, pH dung dịch nền
Ph 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 Dung dịch nền TB ±SD TB ±SD TB ±SD TB ±SD TB ±SD TB ±SD Natri axetat 56,67 ±1,1b 35,5 ± 2,3a 255,5 ± 7,3d 333,4 ± 4,7e 236,2 ± 7,7c 254,0 ± 4,7d Amoni axetat 210,3 ±5,4a 351,7 ± 5,7d 216,5 ± 2,7b 263,1 ± 1,6c Citrat- Phosphat 207,7 ± 6,0d 168,2 ± 2,3a 194,4 ± 2,6b 229,4 ± 2,1e 200,9 ± 2,0c Borax 168,1 ±1,6a 255,5 ± 6,5c 173,9 ± 1,8b Tris 180.0 ±13,1d 27,5 ± 0,3a 53,4 ± 3,6b 126,4 ± 9,7c
*Mỗi giá trị là trung bình của 5 lần đo (n = 5)
Cường độ dòng của erythromycin bị ảnh hưởng mạnh bởi loại dung dịch nền. Trong số các dung dịch nền khảo sát như Natri axetat, Amoni axetat, Citrat-Phosphat, Borax, đệm Tris thì dung dịch nền Amoni axetat cho giá trị cường độ dòng erythromycin cao nhất và hình dạng đỉnh peak đẹp nhất (bảng 3.1).
Khoảng pH của dung dịch Amoni axetat được khảo sát trong khoảng 7,0 đến 10,0. Erythromycin có cường độ dòng cao nhất ở pH 8,0 (E1/2= -1.430 mV, I = 351,7 ± 5,7 nA). Vì thế dung dịch nền Amoni axetat (pH 8,0) được chọn.
Bảng 3.2:Giá trị thế bán sóng E1/2và cường độ dòng của erythromycin trong dung dịch đệm Amoni axetat pH 8,0
Ghi Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5
Thế bán sóng (mV) -1430 -1430 -1430 -1430 -1430
Wang và cộng sự (2000) đã dùng kỹ thuật stripping hấp phụ để định lượng erythromycin trên cực rắn carbon, có so sánh với kỹ thuật von-ampe tuần hoàn. Nghiên cứu này đã khảo sát ảnh hưởng của các loại dung dịch nền khác nhau như HAc-NaAc, NaH2PO4–Na2HPO4, NH3-NH4Cl, Na2B4O7-NaOH, Britton Robinson thì NH3-NH4Cl (pH 9,0) cho cường độ dòng thích hợp. Phổ von-ampe tuần hoàn của 1,0 x 10-4mol/l của erythromycin trên cực rắn carbon tiền xử lý, peak oxi hóa xuất hiện ở lần quét đầu tiên khoảng 0,86 V. Các lần quét sau đó, không khuấy, cường độ peak giảm đáng kể tới một giá trị không đổi, cho thấy rằng erythromycin đã hấp phụ trên điện cực thủy tinh carbon, oxi hóa erythromycin là bất thuận nghịch. Peak oxi hóa biến mất khi thêm chất hoạt động bề mặt cationic, chỉ ra rằng erythromycin có tính chất hấp phụ ở điện cực thủy tinh carbon. Độ nhạy cao hơn khi dùng phương pháp anod stripping. Cường độ peak được đo bằng cách xác định các giá trị giữa peak dương và peak âm. Peak ở thế 0,35 V là do dòng tụ điện [26].
Xue và cộng sự (2008) nghiên cứu erythromycin khi tham gia điện hóa trên điện cực thủy tinh carbon bằng phương pháp von-ampe tuần hoàn. Peak khử được xác định rõ tại – 0,420 V; và peak tuần hoàn oxi hóa (reoxidation) xuất hiện ở - 0,055 V. Nhưng khi thêm erythromycin vào trong dung dịch NaOH có chứa oxy hòa tan thì peak oxi hóa ở - 0,055 V không còn rõ nữa mà xuất hiện 1 peak oxi hóa khác 0,200 V. Điều này đã thể hiện có sự tương tác giữa erythromycin và oxy trong quá trình điện hóa [53].
Xét về mặt lý thuyết, trong dung dịch nước phản ứng khử đầu tiên của oxy hoà tan có thể là quá trình trao đổi 2- điện tử hoặc 4-điện tử, tuỳ thuộc vào hoạt tính xúc tác của vật liệu làm điện cực và thành phần dung dịch nền.
Quá trình 2-điện tử: O2+ 2H++ 2e-H2O2
(O2+ 2e-O22-trong dung dịch kiềm mạnh) Quá trình 4-điện tử: O2+ 4e-+ 4H+2H2O
Tuy nhiên trong dung môi “aprotic”, bước đầu tiên là quá trình khử 1-điện tử, tạo ra một ion superoxide O2-
O2+ 1e-O2-
Nếu muối tetraalkylammonium được dùng làm dung dịch nền, quá trình này là thuận nghịch và quanh quẩn ở -0,8V. Nếu một dung dịch acid Bronsted được thêm vào, quá trình đầu tiên là quá trình trao đổi 2-điện tử: O -được tạo ra từ quá trình đầu
tiên sẽ bị proton hoá để thành O2H, dễ dàng bị khử hơn O2. Vì vậy O2Hsau đó bị khử thành O2H-.
Trong dung môi “aprotic lưỡng cực”, bước thứ hai của quá trình khử oxy là O2- O22-. Tuy nhiên nếu có hiện diện của H+thì O22-sẽ tương tác với H+để hình thành O2H-hoặc O2H2. Đôi khi O2H-hoặc O2H2tiếp tục bị khử ở thế âm hơn để cho sản phẩm cuối cùng là H2O.
Một nghiên cứu khác của Avramovivic và cộng sự (2010) cho thấy tương tác của erythromycin với hydrogen ở điện cực vàng trong dung dịch NaHCO3 0,05 M bằng phương pháp Von-ampe tuần hoàn. Minh chứng cho sự tương tác đó chính là sự thay đổi pH của dung dịch nền từ 8,4 đến 8,77 khi có mặt của erythromycin A trong vòng 4 giờ giữ ở thế -1,2 V [54].
Theo nghiên cứu của luận án này, chúng tôi chọn thế bắt đầu quét Vstart= -400 mV (xem phần 3.1.5) mà không tiến sát đến 0 V để tránh phản ứng oxi hoá khử giữa erythromycin và oxi hoà tan trong dung dịch, do đó cũng không nhất thiết loại trừ oxi hoà tan.
Điểm qua các công trình nghiên cứu trên thế giới, ta thấy rằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm để định lượng erythromycin là nghiên cứu đầu tiên, điều kiện loại dung dịch nền và pH có khác biệt hơn chính là do khác biệt ở bản chất phương pháp von-ampe (von-ampe sóng vuông/ von-ampe tuần hoàn) và bản chất điện cực (cực giọt thuỷ ngân/ cực rắn cacbon, cực vàng).
3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nền
Người ta thường dùng các dung dịch nền có nồng độ các chất điện ly trơ lân cận vùng nồng độ 0,1 M. Sự thay đổi nồng độ của các chất điện ly trơ trong một khoảng nào đó không ảnh hưởng nhiều tới thế bán sóng hay chiều cao sóng.
Qua khảo sát sơ bộ về pH, chúng tôi thấy đệm Amoni axetat pH 8,0 là dung dịch phù hợp cho định lượng erythromycin. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nền, chúng tôi tiến hành khảo sát khảo sát nồng độ dung dịch nền Amoni axetat pH 8,0 trong khoảng 0,05 0,25 M. Các thông số chạy máy Vstart: -400 mV, Vstep: 4 mV, Vpulse: 30 mV, Tdrop: 5000 ms, Velectrolise: -700 mV, Telectrolise: 3 s, Tstabilize: 1
(a) (b) (c) (d) (e) Hình 3.8:Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Amoni axetat pH 8,0
(a: 0,05 M; b: 0,01M; c: 0,15M; d: 0,20 M; e: 0,25M) 150,0 170,0 190,0 210,0 230,0 250,0 270,0 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
Nồng độ dung dịch nền ammonium acetate (M)
C ư ờn g độ d òn g er yt hr om yc in A (n A )
Hình 3.9:Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nền Amoni axetat đến cường độ dòng của erythromycin A
Erythromycin có cường độ dòng cao nhất ở Amoni axetat 0,10 M (E1/2= -1.430 mV, I = 254,8 ± 10,2 nA). Vì vậy giá trị này được chọn để khảo sát các thông số tiếp theo (hình 3.9).
Nồng độ dung dịch nền (lực ion của dung dịch nền) có vai trò tạo ra môi trường điện ly, tạo nên dòng dịch chuyển các điện tích khi đặt trong điện trường, hỗ trợ quá trình truyền khối các phân tử erythromycin đến bề mặt điện cực tốt hơn. Khi lực ion của Amoni axetat vượt quá 0,10 M; các ion CH COO-và NH +trở thành yếu tố cản trở
dòng khuếch tán của các phân tử erythromycin đến tích góp tại bề mặt cực làm việc, cường độ dòng erythromycin giảm xuống.
Nourozi và cộng sự (2009) khảo sát tín hiệu điện hóa của erythromycin A bằng kỹ thuật Von-ampe tuần hoàn, trong đó đánh giá ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nền H3PO4từ 0,04 đến 0,06 M thì thấy ở 0,05 M là nồng độ nền thích hợp [39]. Wang Huaisheng và cộng sự (2000) nghiên cứu tín hiệu điện hóa của erythromycin A bằng kỹ thuật stripping sóng vuông hấp phụ trên điện cực thuỷ tinh carbon thì thấy dung dịch NH4Cl 0,025 M là phù hợp [34]. Xue Li và cộng sự (2008) nghiên cứu tín hiệu điện hóa của erythromycin A bằng kỹ thuật von-ampe tuần hoàn trên điện cực nano vàng-điều chỉnh bằng thuỷ tinh carbon thì lại thấy dung dịch NaOH 0,2 M nồng độ nền thích hợp [53].
Trở lại nghiên cứu của luận án, nếu tính theo lực ion thấy rằng khi của amoni axetat tăng dần từ 0,05 M đến 0,1 M thì cường độ dòng sẽ tăng theo, nếu tăng tiếp lực ionnày lên 0,15 M hay cao hơn nữa thì sẽ trở thành yếu tố gây cản trở dòng khuếch tán của erythromycin đến bề điện cực giọt thuỷ ngân từ đó cường độ dòng sẽ giảm.
3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi hòa tan erythromycin
Sự có mặt của một dung môi hữu cơ nào đó trong dung dịch nền có thể ảnh hưởng đến tính chất điện hóa và khả năng hấp phụ của các chất hữu cơ trên cực giọt thủy ngân và làm cho các tín hiệu điện hóa thu được thay đổi. Khi chất phân tích dễ tan trong nước, người ta thường dùng dung dịch nền là dung dịch nước chứa các chất