Nghiên cứu định lượng kháng sinh erythromycin trong tôm, cá bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN PHƯỚC MINH NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH ERYTHROMYCIN TRONG TƠM, CÁ BẰNG KỸ THUẬT SĨNG VNG QT NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM VÀ KHẢ NĂNG ĐÀO THẢI Chuyên ngành: Chế Biến Thực Phẩm Đồ Uống Mã số chuyên ngành: 62.54.02.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT Tp Hồ Chí Minh năm 2012 Cơng trình hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa ĐHQG-HCM Người hướng dẫn khoa học 1: TS Trần Bích Lam Người hướng dẫn khoa học 2: TS Nguyễn Trọng Giao Phản biện độc lập 1:…………………………………………………… Phản biện độc lập 2:…………………………………………………… Phản biện 1:…………………………………………………………… Phản biện 2:…………………………………………………………… Phản biện 3:…………………………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại: …………………………………………………………… ……………………………………………………………… vào lúc ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Khoa học tổng hợp Tp HCM - Thư viện Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG-HCM DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Nguyen Phuoc Minh et al., “Simultaneous determination of erythromycin A in giant prawn and tilapia in Mekong region by stripping square wave voltammetry,” European Journal of Food Research and Review, vol 1, no 1, pp 01-14, 2011 Nguyen Phuoc Minh et al., “Accumulation and clearance of orally administered erythromycin in adult Nile tilapia (Oreochromis niloticus),” International Food Research Journal, vol 18, no 1, pp 95-100, 2011 Nguyen Phuoc Minh et al., “Tissue distribution and elimination of erythromycin in giant freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii) depletion,” African Journal of Food Science, vol 4, no 9, pp 578-584, 2010 Nguyễn Phước Minh cộng “Q trình tích tụ đào thải kháng sinh erythromycin cá rô phi (Oreochromis niloticus),” Kỷ Yếu Hội Nghị Khoa Học: Phát Triển Nơng Nghiệp Bền Vững Thích Ứng Với Sự Biến Đổi Khí Hậu, Cần Thơ, 2010, trang 430437 Nguyễn Phước Minh cộng “Chuyển hóa sinh học đào thải kháng sinh erythromycin tế bào tôm xanh trưởng thành (Macrobrachium rosenbergii),” Kỷ Yếu Hội Nghị Khoa Học: Phát Triển Nơng Nghiệp Bền Vững Thích Ứng Với Sự Biến Đổi Khí Hậu, Cần Thơ, 2010, trang 472-479 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Một vấn đề xúc vệ sinh an toàn thực phẩm nước ta dư lượng kháng sinh vật nuôi, dư lượng kháng sinh thực phẩm vượt mức cho phép ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng uy tín hàng xuất Do tính chất kháng khuẩn mạnh erythromycin từ lâu dùng để phòng trị bệnh tơm cá Do nơng dân q trình ni tơm xanh cá rơ phi có sử dụng erythromycin khơng tn thủ thời gian ngưng thuốc trước thu hoạch nên để lại sản phẩm có dư lượng vượt mức cho phép Theo quy định Codex, WHO/FAO, EU, Mỹ, Canada, Australia, v.v dư lượng erythromycin sản phẩm thủy sản nhìn chung phải nhỏ 30 ppb Theo thông tư số 15/2009/TT-BNN ngày 15/03/2009 Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thơn Việt Nam, erythromycin thuộc nhóm kháng sinh hạn chế sử dụng, với mức dư lượng tối đa cho phép 200 ppb Hiện có nhiều phương pháp xác định dư lượng kháng sinh sản phẩm thủy sản ELISA, LC-MS/MS Mục tiêu nội dung thứ đặt phải tìm phương pháp phân tích dư lượng kháng sinh sản phẩm thủy sản với chi phí thấp, nhanh, độ tin cậy tính xác cao, có khả tái khẳng định erythromycin Xét thấy chưa có nghiên cứu cơng bố q trình đào thải, chuyển hóa, thời gian ngưng kháng sinh erythromycin trước thu hoạch đối tượng tôm xanh, cá rô phi Vậy nên đề tài em tiến hành nghiên cứu thời gian đào thải, chuyển hóa erythromycin thịt tôm xanh cá rô phi nhằm rút quy luật ước lượng thời gian ngưng thuốc trước thu hoạch an toàn Từ hai yêu cầu trên, em chọn đề tài “Nghiên cứu định lượng kháng sinh Erythromycin tôm, cá kỹ thuật sóng vng qt nhanh cực giọt chậm khả đào thải” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Một là, thiết bị ANALYZER SQF 505 Việt Nam sản xuất xây dựng phương pháp phân tích erythromycin kỹ thuật sóng vng qt nhanh cực giọt chậm đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm quốc tế đồng thời đạt yêu cầu phân tích nhanh, đơn giản giảm chi phí phân tích Hai là, nghiên cứu đào thải, chuyển hóa erythromycin thịt thủy sản (tơm xanh, cá rơ phi), từ xác định quy luật thời gian thu hoạch an toàn sử dụng erythromycin Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN  Ý nghĩa khoa học: Lần Việt nam giới tiến hành nghiên cứu sử dụng kỹ thuật sóng vng qt nhanh cực giọt chậm để phân tích định tính định lượng kháng sinh eythromycin mẫu thủy sản Sự xuất sóng khử vùng khoảng -1,4 V khử nhóm C = O thứ hai phân tử erythromycin liên kết với nhóm điện tử chứa nguyên tử oxi bên cạnh Quá trình khử khơng hồn tồn thuận nghịch với trao đổi hai điện tử Phát điều kiện thích hợp có hấp phụ erythromycin bề mặt giọt thủy ngân Có thể dùng hiệu ứng để tiến hành phân tích erythromycin nồng độ thấp kỹ thuật stripping hấp phụ cực giọt chậm hay cực ngồi, cực treo Đã nghiên cứu chọn dung dịch thích hợp, thơng số chạy máy tối ưu, quy trình chuẩn bị mẫu đo hợp lý để phân tích erythromycin mẫu tơm xanh, cá rơ phi có kết tin cậy Các số liệu so sánh với kỹ thuật phân tích truyền thống LC-MS có tương đồng Chứng minh dẫn xuất erythromycin khơng chuyển hố Sacchropolyspora erythrea đường lên men mà chứng minh erythromycin A vào thể tơm cá có chuyển hoá sinh học sang dẫn xuất erythromycin C, E, F  Ý nghĩa thực tiễn: Đã nghiên cứu xây dựng thành cơng quy trình phân tích định tính định lượng erythromycin tơm xanh cá rơ phi kỹ thuật sóng vng qt nhanh cực giọt chậm với máy ANALYZER SQF-505 Việt Nam sản xuất với chi phí phân tích rẻ hơn, thao tác dễ dàng kỹ thuật khác nước Các số liệu kiểm chứng với kết phân tích phương pháp đại khác Kết giúp nhà sản xuất kinh doanh địa phương có phương tiện để kiểm sốt kháng sinh từ gốc (thức ăn, mơi trường, hóa chất, tơm cá q trình thu mua, chế biến,…) nhằm tạo sản phẩm có uy tín quốc tế Sự thành cơng bước đầu mở hướng nghiên cứu sử dụng kỹ thuật sóng vng qt nhanh đơn giản, khơng q tốn để phân tích nhiều kháng sinh khác đối tượng thủy sản khác nhằm giúp địa phương tự giám sát tốt vấn đề Rút quy luật đào thải, chuyển hóa erythromycin thịt tơm xanh cá rô phi sau ăn thức ăn có trộn erythromycin, từ ước lượng thời gian ngưng thuốc an tồn, góp phần có cơng nghiệp chế biến thực phẩm chủ động, an toàn bền vững CHƯƠNG I TỔNG QUAN Erythromycin nhóm kháng sinh macrolide gồm erythromycin A, B, C, D, E, F Tất tạo từ Sacchropolyspora erythrea đường lên men Sản phẩm q trình lên men erythromycin A, lại erythromycin khác (≤ 5%) Erythromycin gồm phân tử đường gồm desosamin cladinose gắn vào Erythronolide Nó dễ dàng hút ẩm tan nước (0,2%) Erythromycin hoạt hóa pH kiềm pH trung tính khơng bền pH acid Erythromycin có tác dụng diệt khuẩn tốt loài vi khuẩn Gram [+] hiệu việc chữa trị nhiễm khuẩn Staphylococcus mà kháng lại Penicillin Mycoplasma, Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria, Haemophylus, Corynebacterium, Listeria, Pasteurella multocida, Brucella, Rickettsia, Treponema nhạy cảm với erythromycin Erythromycin sử dụng rộng rãi để chữa nhiễm khuẩn người động vật Hình 1.1: Cơng thức cấu tạo erythromycin Nguyên lý cực phổ sóng vng qt nhanh cực giọt chậm stripping sóng vuông quét nhanh cực giọt chậm: Nhúng vào dung dịch có chứa chất cần phân tích điện cực: Cực làm việc: cực giọt thủy ngân có tốc độ chảy ổn định khoảng giây giọt Nếu áp dụng kỹ thuật stripping nhanh ta dùng cực giọt thủy ngân có tốc độ chảy 10 giây giọt Cực so sánh: Ag/AgCl/KCl bão hòa không đổi Cực hỗ trợ: dùng cực Platin Đặt lên cực làm việc thành phần: Thế chiều tăng dần theo thời gian dạng hình bậc thang với bước 2, 4, 6, 8, 10 mV Thế xoay chiều xung vng góc có giá trị biên độ xung: 10, 20, 30, 40 mV tần số vài trăm Hz Để triệt tiêu dòng tụ điện gây nhiễu cho tín hiệu cần đo, ta tiến hành ghi cường độ dòng Faraday xoay chiều đầu xung cuối xung Phần mềm SQF-505 cho phép hiển thị biến đổi cường độ dòng Faraday xoay chiều theo chiều Đường thu gọi phổ sóng vuông quét nhanh Phổ thường chứa nhiều đỉnh Mỗi đỉnh ứng với chất hay giai đoạn phản ứng điện hóa chất Thế bán sóng (E1/2) với dung dịch giá trị đặc trưng cho chất thường dùng cho mục đích phân tích định tính Chiều cao đỉnh (cường độ dòng Faraday xoay chiều) hay diện tích đỉnh (cơng suất tạo sóng) tỷ lệ với nồng độ chất tham gia phản ứng điện hóa cực làm việc nên dùng cho mục đích định lượng Stripping sóng vng quét nhanh cực giọt chậm: Dùng cực giọt thủy ngân chạy chậm, khoảng 10 giây giọt, làm cực làm việc Phần mềm PSA-F cho phép đặt giá trị chiều tùy ý để tích góp chất cần phân tích lên bề mặt giọt thủy ngân lớn dần lên Sau trình này, máy tự động tiến hành quét phổ theo chế độ sóng vng qt nhanh Các nghiên cứu định lượng erythromycin: Nghiên cứu nước, chưa thấy có nghiên cứu trình định lượng erythromycin, nghiên cứu nước ngồi có nghiên cứu phương pháp Von-ampe để định lượng erythromycin mà chủ yếu phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ Đặc biệt chưa thấy công trình nghiên cứu dùng kỹ thuật sóng vng qt nhanh cực giọt chậm dùng để định lượng erythromycin mẫu tôm xanh cá rô phi Một số cơng trình nghiên cứu khả đào thải, chuyển hóa erythromycin số lồi thủy sản như: Esposito cộng (2006) nghiên cứu trình đào thải erythromycin cá hồi vân dòng Oncorhynchus mykiss Moffitt cộng (1988) nghiên cứu tích lũy đào thải erythromycin thiocyanate cá hồi Oncorhynchus tshawytscha Moffitt cộng (1999) tiến hành nghiên cứu độc tính, khả gây đột biến hiệu việc tiêm 10, 20, 40 mg erythromycin/kg thể trọng cá hồi Oncorhynchus tshawytscha, cách 20 ngày tiêm lần tiêm lần, trước cá hồi phát dục Moffitt cộng (2001) kiểm tra tính độc cấp tính độc mãn tính erythromycin cá hồi Oncorhynchus tshawytscha nhiệt độ nước khác Haukenes cộng (2002) tiêm erythromycin phosphate vào cá hồi Oncorhynchus tshawytscha trước đẻ trứng Fairgrieve cộng (2005) cho cá hồi Oncorhynchus tshawytscha ăn thức ăn có chứa azithromycin (30 mg/kg cá 14 ngày) erythromycin (100 mg/kg cá 28 ngày) Tóm lại, nghiên cứu trước biến đổi erythromycin thể thủy sản chủ yếu tập trung đối tượng cá hồi, cá nước lạnh dừng lại việc theo dõi đào thải erythromycin cá Chưa có báo cáo erythromycin thủy sản nhiệt đới chưa có báo cáo cho biết thể thủy sản erythromycin chuyển hóa nào, nội dung mà đề tài nghiên cứu Vì chọn đối tượng thủy sản nghiên cứu tôm xanh cá rô phi: Đây hai loại thủy sản nuôi phổ biến Việt Nam có sử dụng erythromycin Rất nhiều vi sinh vật gây bệnh tôm xanh bao gồm protozoans Epistylis, Zoothamnium, Vorticella; vi khuẩn gây bệnh Vibrio, Aeromonas, Pseudomonas, Edwardsiella Trong bệnh chủ yếu cá rơ phi nuôi thường Streptococcus iniae, Aeromonas hydrophila, Trichodina, Flexibacter Columnaris, Edwardsiella Phổ biến Streptococcosis, vi khuẩn gram dương, gây thiệt nặng nề mà khơng có vacccine phòng được, chí cá trưởng thành khỏe mạnh Vì vậy, erythromycin kháng sinh từ lâu dùng để phòng trị bệnh cá rô phi Streptococcus CHƯƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 2.1.1 Nguyên vật liệu - Tôm xanh (≈ 50 g/con), cá rô phi (500÷550 g/con) - Erythromycin base 96,5% từ cty Cổ Phần Dược Hậu Giang 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ - Thiết bị Analyzer SQF-505 Trung Tâm Nhiệt Đới Việt Nga - Bộ chiết pha rắn SPE Phenomenex, cột HLB Waters - Các dụng cụ phân tích thơng thường khác 2.1.3 Hóa chất - Erythromycin A, chloramphenicol, florfenicol, furazolidone, ciprofloxacin, enrofloxacin, danofloxacin chuẩn có độ tinh khiết > 98% hãng Sigma Aldrich, Fluka Chemical - Các dung môi, hóa chất phân tích khác 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Thuyết minh nghiên cứu Nội dung thứ I: Nghiên cứu điều kiện kỹ thuật stripping sóng vng qt nhanh cực giọt chậm để định lượng erythromycin Sau tiến hành đánh giá thẩm định hiệu phương pháp Cuối lấy mẫu tôm xanh, cá rô phi thực tế 10 tỉnh ĐBSCL để đánh giá tranh thực trạng nhiễm erythromycin Nội dung thứ II: Theo dõi trình đào thải chuyển hoá erythromycin theo thời gian kháng sinh vào thể tôm xanh cá rơ phi đường thức ăn Từ rút quy luật thời gian ngưng thuốc an toàn trước thu hoạch 2.2.2 Phương pháp thực nghiệm 2.2.2.1 Khảo sát điều kiện tối ưu cho việc định lượng erythromycin thiết bị Analyzer SQF - 505 13 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CHO VIỆC ĐỊNH LƯỢNG ERYTHROMYCIN 3.1.1 Nghiên cứu thăm dò định hướng, chọn vùng quét chiều quét Erythromycin dễ tan nước nên dung dịch dùng cho người cứu chủ yếu dung dịch nước với chất điện ly khác Trong cơng thức cấu tạo erythromycin có nhóm C=O liên kết với nguyên tử oxy khác, có số dị vòng chứa oxy liên kết nguyên tử oxy nên dự đốn xuất sóng khử khoảng từ -1,0 V đến -1,7 V Vì em tập trung nghiên cứu vùng Qua thăm dò sơ em thấy có vài sóng khoảng này, sóng vùng khoảng -1,4 V tốt mục đích phân tích định lượng, nên khảo sát em tập trung để tìm điều kiện tối ưu cho sóng 3.1.2 Nghiên cứu tìm dung dịch pH phù hợp Cường độ dòng erythromycin bị ảnh hưởng loại dung dịch Trong số dung dịch khảo sát Natri axetat, Amoni axetat, Citrat-Phosphat, Borax, đệm Tris dung dịch amoni axetat cho giá trị cường độ dòng erythromycin cao hình dạng đỉnh peak đẹp Khoảng pH dung dịch amoni axetat khảo sát khoảng 7,0 đến 10,0 Erythromycin có cường độ dòng cao pH 8,0 (E1/2 = -1.430 mV, I = 351,7 ± 5,7 nA) Vì dung dịch amoni axetat (pH 8,0) chọn để khảo sát 3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ dung dịch Nồng độ dung dịch amoni axetat pH 8,0 khảo sát khoảng 0,05 ÷ 0,25 M Erythromycin có cường độ dòng cao amoni axetat 0,1 M (E1/2 = -1.430 mV, I = 254,8 ± 10,2 nA) dòng 270,0 eryt hro 250,0 myci n A 230,0 (nA) 210,0 190,0 170,0 150,0 0,000,050,100,150,200,250,30 Nồng độ dung dịch ammonium acetate (M) Hình 3.9: Ảnh hưởng nồng độ dung dịch amoni axetat đến cường độ dòng erythromycin A 3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng dung mơi hòa tan erythromycin Tiến hành ghi phổ erythromycin dung dịch amoni axetate 0,1 M pH 8,0 với có mặt ba dung mơi methanol, acetonitril, ethyl axetate để hòa tan chuẩn erythromycin Kết thu thấy có mặt dung môi không ảnh hưởng nhiều tới tính chất phổ eythromycin, ghi phổ rõ ràng vùng cũ Qua đó, ta thấy q trình chuẩn bị mẫu đo dùng dung mơi 3.1.5 Nghiên cứu điều kiện chạy máy thích hợp 3.1.5.1 Nghiên cứu chiều quét Chiều quét xuôi (0 đến -1.800 mV) chiều quét ngược (-1.800 mV đến 0) lên tín hiệu cường độ dòng khảo sát Chiều quét xuôi (0 đến -1.800 mV) cho đỉnh peak cao đẹp Trong đó, chiều quét ngược (-1.800 mV đến 0) đỉnh peak Chiều quét xuôi (0 đến -1.800 mV) chọn để khảo sát thơng số Điều nói lên tính chất không thuận nghịch erythromycin quét 3.1.5.2 Nghiên cứu chọn bắt đầu ghi phổ Vstart Tiến hành ghi phổ erythromycin nồng độ 100 ppb dung dịch amoni axetat 0,1 M; pH 8,0 với giá trị bắt đầu ghi phổ Vstart khác thu kết sau: dòng eryth rom ycin A (nA) 120,0 100,0 y = 0,1332x + 162,8 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 -200 -300 -400 -500 -600 -700 -800 -900 -1000 -1100 -1200 Vstart (mV) Hình 3.13: Ảnh hưởng Vstart đến cường độ dòng erythromycin A 3.1.5.3 Nghiên cứu chọn bước chiều Vstep Tiến hành ghi phổ dung dịch erythromycin nồng độ 100 ppb dung dịch amoni axetat 0,1 M; pH 8,0 số tốc độ quét chiều tương ứng với bước Vstep = , , 10 mV/ bước thu được: 220 dòng eryt 210 hro 200 myci n A 190 (nA) 180 y = -12,395x + 284,64 170 160 150 10 12 Vstep (mV) Hình 3.15: Ảnh hưởng Vstep đến cường độ dòng erythromycin A 3.1.5.4 Nghiên cứu chọn biên độ xung vuông Vpulse Tiến hành ghi phổ erythromycin nồng độ 100 ppb amoni axetat 0,1 M; pH 8,0 với biên độ khác 10, 20, 30, 40 mV 800 dòng eryth 700 romy 600 cin A 500 (nA) 400 y = 15,258x + 78,47 300 200 100 10 20 30 40 50 Vpulse (mV) Hình 3.17: Ảnh hưởng Vpulse đến cường độ dòng erythromycin A 3.1.5.5 Nghiên cứu chọn thời điểm quét đời sống giọt thủy ngân Tdrop Giá trị Tdrop thể thời điểm bắt đầu ghi sóng kể từ thời điểm hình thành giọt thủy ngân Để ghi toàn phổ ta nên chọn giá trị 1.000 ÷ 5.000 ms để q trình ghi giọt khơng bị rơi Giá trị Tdrop lớn sóng lớn ghi vùng giọt lớn, cường độ dòng qua cực làm việc cao, độ nhạy cao 450 dòng eryth 400 romy 350 cin A 300 (nA) 250 y = 0,0631x + 70,59 200 150 100 1.000 2.000 Tdrop (ms) 3.000 4.000 5.000 6.000 Hình 3.19: Ảnh hưởng Tdrop đến cường độ dòng erythromycin A 3.1.5.6 Nghiên cứu chọn thời gian điện phân tích góp Telectrolise Tiến hành ghi phổ erythromycin sau khoảng thời gian tích góp - - giây thu được: 1800 dòng 1750 eryth1700 romy cin 1650 1600 A 1550 (nA) 1500 1450 1400 1350 1300 y = 181,7x + 815,2 Telectrolise (s) Hình 3.21: Ảnh hưởng Telectrolise đến cường độ dòng erythromycin A 3.1.5.7 Nghiên cứu chọn điện phân tích góp Velectrolise Tiến hành thí nghiệm với tích góp: -400, -900, -1100 mV thu được: 1900 dòng eryt 1850 hro myci 1800 n A (nA) y = -0,2187x + 1620,8 1750 1700 1650 -1200 -1100 -1000 -900 -800 -700 -600 -500 -400 -300 Velectrolise (mV) Hình 3.23: Ảnh hưởng Velectrolise đến cường độ dòng erythromycin A + + ++ ++ 3+ - 3.1.6 Nghiên cứu ảnh hưởng ion vô Na , K , Ca , Mg , Fe , Cl , -2 2- SO4 , HPO4 tới phổ erythromycin + + 2+ 2+ 2+ 3+ Ở nồng độ 0÷5 ppm ion K , Na , Ca , Mg , Mn , Fe , 2+ - - 2- 2- Cu , Cl , I , SO4 , HPO4 ảnh hưởng không đáng kể ( -0,2 V; CH2=CH-CH2Cl có E1/2: -1,95 V - Nhóm C=O tham gia phản ứng khử - Nhóm nitro có trị số E1/2 dao động khoảng -0,2 V đến -1,0 V phụ thuộc vào giá trị pH, nhóm liên kết với nhóm NO2 dung mơi sử dụng Tuỳ thuộc pH dung dịch nền, nhóm cho sóng hay sóng khử b) Họ Nitrofuran: Trong họ kháng sinh nitrofuran có nhóm chức điện hố: - Nhóm NO2 có E1/2 khoảng - 0,2 V đến - 1,0 V - Nhóm C=N có E1/2 khoảng -1,0 V đến - 1,8 V - Ngồi có nhân dị vòng 2-oxo-1,3-oxolidin tham gia phản ứng khử c) Họ Fluoroquinolon: Nhóm fluoroquinolon cơng thức cấu tạo có khung quinolon, nhân quinon, nhóm có phản ứng khử điện cực giọt thuỷ ngân 3.2.5 So sánh đối chứng kết SSWV với LC-MS/MS 3.2.5.1 Trên mẫu tôm xanh -1 Hiệu suất thu hồi: > 90,92 %, MDL: 0,57 µg.kg ; R_adjust: 0,99999; RSD: 0,91 ÷ 1,58 % (Hình 3.29) Hình 3.29: Đường chuẩn erythromycin mẫu tôm xanh 3.2.5.2 Trên mẫu cá rô phi -1 Hiệu suất thu hồi: > 85,07%; MDL: 0,80 àg.kg ; R_adjust: 1,0; RSD: 0,80 ữ 2,10 % (Hình 3.30) Hình 3.30: Đường chuẩn erythromycin mẫu cá rơ phi 3.2.5.3 So sánh kết phân tích SSWV LC-MS/MS a) Tôm xanh 23 Bảng 3.4: So sánh kết phân tích mẫu tơm xanh phương pháp Số nhận diện GP – Blank GP – Blank GP – Blank GP – I GP – I GP – I GP – II GP – II GP – II GP – III GP – III GP – III SSWV (LOD=0,57 µg*kg-1) TB ± SD Dư lượng RSD (µg*kg-1) (µg*kg-1) (%) KPH KPH KPH 51,37 50,19 1,17 50,75 ± 0,59a 50,68 65,45 64,97 65,48 ± 0,53b 0,80 66,02 80,61 79,16 80,00 ± 0,75c 0,94 80,22 LC-MS/MS (LOD=10 µg*kg-1) TB ± SD Dư lượng RSD (µg*kg-1) (µg*kg-1) (%) KPH KPH KPH 50,73 56,89 52,61 ± 3,72a 7,06 50,21 72,82 68,00 70,49 ± 2,41b 3,42 70,65 74,60 85,12 80,23 ± 5,30c 6,61 80,98 * LOD: Giới hạn phát hiện, ** KPH: Không phát b) Cá rô phi Bảng 3.5: So sánh kết phân tích mẫu cá rô phi phương pháp Số nhận diện TL – Blank TL – Blank TL – Blank TL – I TL – I TL – I TL – II TL – II TL – II TL – III TL – III TL – III SSWV (LOD=0,80 µg*kg-1) TB ± SD Dư lượng RSD (mg*kg-1) (mg*kg-1) (%) KPH KPH KPH 1,31 1,27 1,29 ± 0,02a 1,61 1,30 1,95 2,09 2,02 ± 0,07b 3,47 2,02 2,80 2,80 2,78 ± 0,03c 1,25 2,74 LC-MS/MS (LOD=10 µg*kg-1) TB ± SD Dư lượng RSD (mg*kg-1) (mg*kg-1) (%) KPH KPH KPH 1,23 1,28 1,26 ± 0,03a 2,10 1,27 3,14 2,72 2,72 ± 0,43a 15,64 2,29 2,80 2,80 2,80 ± 0,01b 0,21 2,81 * LOD: Giới hạn phát hiện, ** KPH: Không phát Qua bảng 3.4 3.5, kết phân tích ANOVA bảng 3.28-3.31 (phần phụ lục) ta thấy có tương đồng chặt chẽ kết phân tích phương pháp SSWV LC-MS/MS Xét độ lặp lại phương pháp phương pháp sóng vng qt nhanh có độ lặp lại tốt phương pháp LC-MS/MS dựa số % R.S.D đối tượng mẫu tôm xanh cá rơ phi 3.3 ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH ERYTHROMYCIN TRÊN CÁC MẪU THỰC TẾ TÔM, CÁ TẠI CÁC ĐỊA PHƯƠNG 700 600 500 Dư lượng erythromycin A (ppb) 400 300 200 100 Dong Kien An Vinh Ben Cao Lanh Tam Nong Thap Muoi Go Quao Giong Rieng Vinh Thuan Thoai Son Long Xuyen Phu Tan Tam Binh Binh Minh Long Ho Mo Cay Chau Thanh Giong Trom Duyen Hai Tra Cu Cang Long Phung Hiep Long My Vi Thuy My Tu My Xuyen Ke Sach Tra Hau Soc Can Bac thap Giang Giang Long Tre Vinh Giang Trang Tho Lieu Địa phương Hình 3.31: Tình hình nhiễm erythromycin tôm xanh tỉnh ĐBSCL 800 700 600 500 Dư lượng erythromycin A 400 (ppb) 300 Thoai Son Long Xuyen Phu Tan Tam Binh Binh Dong Kien An Vinh thap Giang Giang Long Ben Tre Co Do Cao Lanh Tam Nong Thap Muoi Go Quao Giong Rieng Giong Trom Duyen Hai Tra Cu Cang Long Phung Hiep Long My Vi Thuy My Tu My Xuyen Ke Sach Vinh Thanh O Mon Tra Hau Soc Vinh Giang Trang Can Tho Gia Rai Vinh Thuan 100 Mo Long Cay Ho Chau Thanh 200 Bac Lieu Địa phương Hình 3.32: Tình hình nhiễm erythromycin cá rơ phi tỉnh ĐBSCL Tỷ lệ nhiễm tôm xanh (45/150 mẫu) cao so với cá rô phi (30/150 mẫu) Người nông dân bắt đầu sử dụng loại kháng sinh này, chí nồng độ cao để điều trị bệnh cho thủy sản nuôi không tuân thủ thời gian ngưng thuốc cần thiết (hình 3.31 & 3.32) 3.4 XÁC ĐỊNH QUY LUẬT CHUYỂN HÓA SINH HỌC, ĐÀO THẢI KHÁNG SINH ERYTHROMYCIN TRÊN CƠ THỂ THỦY SẢN KHI NUÔI 25 3.4.1 Đào thải erythromycin thịt 700.0 Er yt hr o m yc in A (µ g/ 600.0 500.0 400.0 300.0 200.0 100.0 0.0 100 200 300 400 500 600 700 o Thời gian ( C - ngày) 50 mg erythromycin/kg thể trọng/ngày 100 mg erythromycin/kg thể trọng/ngày Hình 3.33: Khả đào thải erythromycin A thịt tôm xanh -1 -1 cho ăn 50 100 mg.kg thể trọng.ngày ngày 50,000 45,000 E yr th ro m yc in A (µ g/ 40,000 35,000 30,000 25,000 20,000 15,000 10,000 5,000 0 100 200 300 400 500 600 o 700 Thời gian ( C - ngày) 50 mg ery thromy cin/kg thể t rọng/ngày 100 mg ery t hromy cin/kg thể t rọng/ngày Hình 3.34: Khả đào thải erythromycin A thịt cá rô phi cho -1 -1 ăn 50 100 mg.kg thể trọng.ngày ngày  Bằng phương pháp thống kê, rút thời gian ngưng thuốc 976 o °C_ngày (tương đương 34,86 ngày; nhiệt độ 28 C) tôm -1 -1 -1 -1 xanh cho ăn erythromycin 100 mg.kg thể trọng.ngày thời gian ngày Riêng với mức nồng độ 50 mg.kg thể trọng.ngày thời gian ngày dư lượng để lại khơng đáng kể mức an tồn  Cũng phương pháp thống kê này, rút thời gian ngưng thuốc o 908 °C-ngày (tương đương 32,42 ngày, 28 C) cá rô phi -1 -1 cho ăn erythromycin 50 mg.kg thể trọng.ngày thời gian ngày Trong cần đến 1.150 °C-ngày ngưng thuốc (tương đương 41,07 o ngày, 28 C) cá rô phi được cho ăn 100 mg.kg -1 thể -1 trọng.ngày thời gian ngày 3.4.2 Chuyển hoá sinh học kháng sinh gốc 3.4.2.1 Tôm xanh -1 -1 Khi cho ăn liều 100 mg.kg thể trọng.ngày ngày đường thức ăn, erythromycin A dần chuyển hóa sang erythromycin E (2,09 µg/kg) ngày thứ sau ngưng thuốc Ở ngày thứ 23 sau ngưng thuốc, erythromycin E (5,81 µg/kg) erythromycin F (3,52 µg/kg) phát mức nồng độ không đáng kể 3.4.2.2 Cá rô phi Khi cá rô phi cho ăn erythromycin base liều thấp (nhóm A), ngày thứ sau ngưng thuốc khơng phát dẫn xuất chuyển hóa erythromycin Tuy nhiên đến ngày thứ 23 phát có dẫn xuất erythromycin E (2,30 µg/kg) erythromycin F (2,37 µg/kg) thịt cá Trong trường hợp cá rô phi cho ăn erythromycin base liều cao (nhóm B) ngày thứ sau ngưng thuốc, phát thấy dẫn xuất chuyển hóa erythromycin C (131,5 µg/kg) erythromycin E (258,3 µg/kg) Ở ngày thứ 23 sau ngưng thuốc, erythromycin E (6,94 µg/kg) erythromycin F (5,90 µg/kg) phát mức nồng độ khơng đáng kể Khi phân tích chế chuyển hóa, thấy rằng: Có oxy hóa vị trí R2 R3 phân tử erythromycin A làm biến đổi erythromycin A thành erythromycin E tôm xanh cá rơ phi có khử methyl R4 làm biến đổi erythromycin A thành erythromycin C cá rơ phi Như enzyme oxy hóa khử có gan mô tôm cá xúc tác phân giải erythromycin KẾT LUẬN Đề tài xây dựng phương pháp sóng vng quét nhanh cực giọt chậm việc phân tích kháng sinh erythromycin tôm, cá đạt giới hạn phát hiện, đáp ứng yêu cầu giới hạn dư lượng cho phép theo tiêu chuẩn quốc tế Phương pháp cho thấy hiệu suất thu hồi cao (85,05 ÷ 96,50 %), độ nhạy cao (giới hạn phát 0,52 µg/kg), độ xác cao (độ lệch chuẩn tương đối, RSD từ 0,80 ÷ 2,10 %), độ (sai biệt tương đối, RE từ 3,50 ÷ 4,95 %) mức độ tuyến tính cao (r ≥ 0,99999) Có tương đồng kết phân tích phương pháp với phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ Đưa chế giải thích xuất sóng erythromycin Từ khái qt hố đưa giả thuyết khả phân tích họ kháng sinh phenicol, nitrofuran, fluoroquinolon (thường gặp nuôi trồng thuỷ sản) kỹ thuật sóng vng qt nhanh cực giọt chậm Kết đề tài làm cho thấy dẫn xuất erythromycin không chuyển hoá từ Sacchropolyspora erythrea đường lên men, mà chứng minh erythromycin A vào thể tôm cá, tác dụng enzyme oxy hóa khử enzyme chuyển methyl hóa, biến thành erythromycin C, E, F, sau bị đào thải Đề tài đưa giả thuyết giải thích chế chuyển hố erythromycin tơm xanh, cá rơ phi nuôi Đã đánh giá rút quy luật thời gian ngưng kháng sinh erythromycin trước thu hoạch đối tượng tôm xanh cá rô phi ... luật ước lượng thời gian ngưng thuốc trước thu hoạch an toàn Từ hai yêu cầu trên, em chọn đề tài Nghiên cứu định lượng kháng sinh Erythromycin tôm, cá kỹ thuật sóng vng qt nhanh cực giọt chậm.. . giọt thủy ngân lớn dần lên Sau trình này, máy tự động tiến hành quét phổ theo chế độ sóng vng qt nhanh Các nghiên cứu định lượng erythromycin: Nghiên cứu nước, chưa thấy có nghiên cứu trình định. .. Các dung mơi, hóa chất phân tích khác 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Thuyết minh nghiên cứu Nội dung thứ I: Nghiên cứu điều kiện kỹ thuật stripping sóng vng qt nhanh cực giọt chậm để định lượng