Nghiên cứu định lượng kháng sinh erythromycin trong tôm, cá bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm.

HCMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN PHƯỚC MINH NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH ERYTHROMYCIN TRONG TÔM, CÁ BẰNG KỸ THUẬT SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM VÀ KHẢ NĂNG ĐÀO THẢI Chuy

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN PHƯỚC MINH

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH ERYTHROMYCIN TRONG TÔM, CÁ BẰNG KỸ THUẬT SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM VÀ KHẢ NĂNG ĐÀO THẢI

Chuyên ngành: Chế Biến Thực Phẩm và Đồ Uống

Mã số chuyên ngành: 62.54.02.01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

Tp Hồ Chí Minh năm 2012

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa -ĐHQG-HCM

Người hướng dẫn khoa học 1: TS Trần Bích Lam

Người hướng dẫn khoa học 2: TS Nguyễn Trọng Giao

Phản biện độc lập 1:………

Phản biện độc lập 2:………

Phản biện 1:………

Phản biện 2:………

Phản biện 3:………

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại: ………

………

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- Thư viện Khoa học tổng hợp Tp HCM

- Thư viện Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG-HCM

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1 Nguyen Phuoc Minh et al., “Simultaneous determination oferythromycin A in giant prawn and tilapia in Mekong region by

stripping square wave voltammetry,” European Journal of Food Research and Review, vol 1, no 1, pp 01-14, 2011.

2 Nguyen Phuoc Minh et al., “Accumulation and clearance of orally

administered erythromycin in adult Nile tilapia (Oreochromis niloticus),” International Food Research Journal, vol 18, no 1,

pp 95-100, 2011

3 Nguyen Phuoc Minh et al., “Tissue distribution and elimination of

erythromycin in giant freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii) depletion,” African Journal of Food Science, vol 4,

TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Một trong những vấn đề bức xúc về vệ sinh an toàn thực phẩm ởnước ta hiện nay là dư lượng kháng sinh trong vật nuôi, dư lượng khángsinh trong thực phẩm vượt quá mức cho phép ảnh hưởng tới sức khỏe củangười tiêu dùng và uy tín hàng xuất khẩu của chúng ta Do tính chất khángkhuẩn mạnh của erythromycin từ lâu nó đã được dùng để phòng và trị bệnhtrên tôm cá Do nông dân trong quá trình nuôi tôm càng xanh và cá rô phi

có sử dụng erythromycin và không tuân thủ thời gian ngưng thuốc trướcthu hoạch nên để lại sản phẩm có dư lượng vượt mức cho phép

Theo quy định của Codex, WHO/FAO, EU, Mỹ, Canada, Australia,v.v thì dư lượng erythromycin trong sản phẩm thủy sản nhìn chung phảinhỏ hơn 30 ppb Theo thông tư số 15/2009/TT-BNN ngày 15/03/2009 của

Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Việt Nam, erythromycin thuộcnhóm kháng sinh hạn chế sử dụng, với mức dư lượng tối đa cho phép là

200 ppb Hiện nay đã có nhiều phương pháp xác định dư lượng kháng sinh

này trong các sản phẩm thủy sản như ELISA, LC-MS/MS Mục tiêu và nội dung thứ nhất đặt ra là phải tìm được phương pháp phân tích dư lượng

kháng sinh trong sản phẩm thủy sản với chi phí thấp, nhanh, độ tin cậy vàtính chính xác cao, có khả năng tái khẳng định erythromycin

Xét thấy chưa có bất kỳ nghiên cứu nào được công bố về quá trìnhđào thải, chuyển hóa, thời gian ngưng kháng sinh erythromycin trước thuhoạch trên đối tượng tôm càng xanh, cá rô phi Vậy nên trong đề tài này em

sẽ tiến hành nghiên cứu thời gian đào thải, chuyển hóa của erythromycintrong cơ thịt tôm càng xanh và cá rô phi nhằm rút ra quy luật và ước lượngđược thời gian ngưng thuốc trước thu hoạch an toàn

Từ hai yêu cầu trên, em đã chọn đề tài “Nghiên cứu định lượng kháng sinh Erythromycin trong tôm, cá bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm và khả năng đào thải”.

4

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Một là, trên thiết bị ANALYZER SQF 505 do Việt Nam sản xuất

xây dựng được phương pháp phân tích erythromycin bằng kỹ thuật sóngvuông quét nhanh trên cực giọt chậm đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩmquốc tế đồng thời đạt yêu cầu phân tích nhanh, đơn giản và giảm chi phíphân tích

Hai là, nghiên cứu đào thải, chuyển hóa của erythromycin trong cơ

thịt thủy sản (tôm càng xanh, cá rô phi), từ đó xác định được quy luật vềthời gian thu hoạch an toàn khi sử dụng erythromycin

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN

 Ý nghĩa khoa học:

1 Lần đầu tiên ở Việt nam và trên thế giới tiến hành nghiên cứu sử dụng

kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm để phân tích địnhtính và định lượng kháng sinh eythromycin trong mẫu thủy sản

2 Sự xuất hiện của sóng khử vùng thế khoảng -1,4 V là do sự khử củanhóm C = O thứ hai trong phân tử erythromycin liên kết với nhóm áiđiện tử chứa nguyên tử oxi bên cạnh Quá trình khử là không hoàn toànthuận nghịch với sự trao đổi hai điện tử

3 Phát hiện trong điều kiện thích hợp có sự hấp phụ của erythromycintrên bề mặt giọt thủy ngân Có thể dùng hiệu ứng này để tiến hànhphân tích erythromycin ở các nồng độ rất thấp bằng kỹ thuật strippinghấp phụ trên cực giọt chậm hay cực ngồi, cực treo

4 Đã nghiên cứu và chọn được dung dịch nền thích hợp, các thông sốchạy máy tối ưu, quy trình chuẩn bị mẫu đo hợp lý để phân tícherythromycin trong các mẫu tôm càng xanh, cá rô phi có kết quả tincậy Các số liệu đã được so sánh với kỹ thuật phân tích truyền thốngLC-MS là có sự tương đồng

5 Chứng minh rằng các dẫn xuất erythromycin không chỉ được chuyển

hoá bởi Sacchropolyspora erythrea bằng con đường lên men mà còn

chứng minh được erythromycin A khi vào cơ thể tôm cá còn có sựchuyển hoá sinh học sang các dẫn xuất erythromycin C, E, F

 Ý nghĩa thực tiễn:

1 Đã nghiên cứu xây dựng thành công quy trình phân tích định tính vàđịnh lượng erythromycin trong tôm càng xanh và cá rô phi bằng kỹthuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm với máy ANALYZERSQF-505 do Việt Nam sản xuất với chi phí phân tích rẻ hơn, thao tác

dễ dàng hơn các kỹ thuật khác của nước ngoài Các số liệu đã đượckiểm chứng với các kết quả phân tích bằng các phương pháp hiện đạikhác

2 Kết quả này có thể giúp các nhà sản xuất kinh doanh ở các địa phương

có phương tiện để kiểm soát kháng sinh từ gốc (thức ăn, môi trường,hóa chất, tôm cá trong quá trình thu mua, chế biến,…) nhằm tạo ra cácsản phẩm có uy tín quốc tế

3 Sự thành công bước đầu này có thể mở ra một hướng nghiên cứu mới

sử dụng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh đơn giản, không quá tốn kém

để phân tích nhiều kháng sinh khác trong các đối tượng thủy sản khácnhau nhằm giúp các địa phương tự giám sát tốt vấn đề này

4 Rút ra được quy luật đào thải, chuyển hóa của erythromycin trong cơthịt tôm càng xanh và cá rô phi sau khi ăn thức ăn có trộnerythromycin, từ đó ước lượng thời gian ngưng thuốc an toàn, gópphần có được một nền công nghiệp chế biến thực phẩm chủ động, antoàn và bền vững

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

Erythromycin là nhóm kháng sinh macrolide gồm erythromycin A, B,

C, D, E, F Tất cả được tạo ra từ Sacchropolyspora erythrea bằng con

đường lên men Sản phẩm chính của quá trình lên men này là erythromycin

A, còn lại là các erythromycin khác (≤ 5%) Erythromycin gồm 2 phân tửđường gồm desosamin và cladinose gắn vào Erythronolide Nó dễ dàng hút

ẩm và tan ít trong nước (0,2%) Erythromycin hoạt hóa ở pH kiềm hơn là

pH trung tính và không bền ở pH acid

Erythromycin có tác dụng diệt khuẩn tốt ở các loài vi khuẩn Gram [+]

và hiệu quả trong việc chữa trị nhiễm khuẩn Staphylococcus mà đã kháng lại Penicillin Mycoplasma, Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria, Haemophylus, Corynebacterium, Listeria, Pasteurella multocida, Brucella, Rickettsia, Treponema rất nhạy cảm với erythromycin Erythromycin được

sử dụng rộng rãi để chữa nhiễm khuẩn ở người và động vật

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của erythromycin

Nguyên lý của cực phổ sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm và stripping sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm: Nhúng

vào dung dịch nền có chứa chất cần phân tích 3 điện cực: Cực làm việc: là

cực giọt thủy ngân có tốc độ chảy ổn định khoảng 7 giây một giọt Nếu ápdụng kỹ thuật stripping nhanh ta dùng cực giọt thủy ngân có tốc độ chảy

trên 10 giây một giọt Cực so sánh: Ag/AgCl/KCl bão hòa có thế không đổi Cực hỗ trợ: dùng cực Platin Đặt lên cực làm việc 2 thành phần: Thế

một chiều tăng dần theo thời gian dạng hình bậc thang với các bước thế 2,

4, 6, 8, 10 mV Thế xoay chiều là các xung vuông góc có giá trị biên độxung: 10, 20, 30, 40 mV và tần số vài trăm Hz Để triệt tiêu dòng tụ điệngây nhiễu cho tín hiệu cần đo, ta tiến hành ghi cường độ dòng Faraday xoaychiều ở đầu xung và cuối xung Phần mềm SQF-505 cho phép hiển thị sựbiến đổi của cường độ dòng Faraday xoay chiều theo thế một chiều Đườngthu được gọi là phổ sóng vuông quét nhanh Phổ thường chứa nhiều đỉnh.Mỗi đỉnh ứng với một chất hay một giai đoạn phản ứng điện hóa của mộtchất Thế bán sóng (E1/2) với một dung dịch nền nào đó là một giá trị đặctrưng cho mỗi chất và thường dùng cho mục đích phân tích định tính.Chiều cao của đỉnh (cường độ dòng Faraday xoay chiều) hay diện tích đỉnh(công suất tạo sóng) tỷ lệ với nồng độ chất tham gia phản ứng điện hóa trêncực làm việc nên được dùng cho mục đích định lượng.

Stripping sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm: Dùng một

cực giọt thủy ngân chạy rất chậm, khoảng 10 giây một giọt, làm cực làmviệc Phần mềm PSA-F cho phép đặt một giá trị thế một chiều tùy ý để tíchgóp chất cần phân tích lên bề mặt của một giọt thủy ngân đang lớn dần lên.Sau quá trình này, máy sẽ tự động tiến hành quét phổ theo chế độ sóngvuông quét nhanh

Các nghiên cứu định lượng erythromycin: Nghiên cứu ở trong

nước, chưa thấy có nghiên cứu nào về quá trình định lượng erythromycin,ngay cả các nghiên cứu ở nước ngoài cũng có rất ít nghiên cứu về phươngpháp Von-ampe để định lượng erythromycin mà chủ yếu là các phươngpháp sắc ký lỏng ghép khối phổ Đặc biệt chưa thấy một công trình nghiêncứu nào dùng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm dùng đểđịnh lượng erythromycin trên nền mẫu tôm càng xanh và cá rô phi

Một số công trình nghiên cứu về khả năng đào thải, chuyển hóa erythromycin trên một số loài thủy sản như: Esposito cùng cộng sự

(2006) nghiên cứu quá trình đào thải erythromycin trên cá hồi vân dòng

Oncorhynchus mykiss Moffitt cùng cộng sự (1988) đã nghiên cứu sự tích

lũy và đào thải của erythromycin thiocyanate trên cá hồi Oncorhynchus tshawytscha Moffitt cùng cộng sự (1999) tiến hành nghiên cứu độc tính,

khả năng gây đột biến và hiệu quả của việc tiêm 10, 20, hoặc 40 mg

erythromycin/kg thể trọng cá hồi Oncorhynchus tshawytscha, cách 20 ngày

tiêm 1 lần và tiêm 6 lần, trước khi cá hồi phát dục Moffitt và cộng sự(2001) kiểm tra tính độc cấp tính và độc mãn tính của erythromycin trên cá

hồi Oncorhynchus tshawytscha ở 2 nhiệt độ nước khác nhau Haukenes và cộng sự (2002) tiêm erythromycin phosphate vào cá hồi cái Oncorhynchus tshawytscha trước khi đẻ trứng Fairgrieve và cộng sự (2005) cho cá hồi Oncorhynchus tshawytscha ăn thức ăn có chứa azithromycin (30 mg/kg cá

trong 14 ngày) hoặc erythromycin (100 mg/kg cá trong 28 ngày)

Tóm lại, những nghiên cứu trước về biến đổi của erythromycin trên

cơ thể thủy sản chủ yếu mới tập trung trên đối tượng cá hồi, là cá nước lạnh

và cũng chỉ mới dừng lại ở việc theo dõi sự đào thải erythromycin ở cá.Chưa có báo cáo về erythromycin trên thủy sản nhiệt đới và cũng chưa cóbáo cáo nào cho biết trong cơ thể thủy sản erythromycin sẽ chuyển hóa thếnào, vì vậy đây sẽ là những nội dung mà đề tài này nghiên cứu

Vì sao chọn đối tượng thủy sản trong nghiên cứu này là tôm càng xanh và cá rô phi: Đây là hai loại thủy sản được nuôi rất phổ biến ở

Việt Nam và có sử dụng erythromycin Rất nhiều vi sinh vật gây bệnh trên

tôm càng xanh bao gồm protozoans như Epistylis, Zoothamnium, và Vorticella; các vi khuẩn gây bệnh như Vibrio, Aeromonas, Pseudomonas, Edwardsiella Trong khi đó các bệnh chủ yếu trên cá rô phi khi nuôi thường là Streptococcus iniae, Aeromonas hydrophila, Trichodina, Flexibacter Columnaris, Edwardsiella Phổ biến nhất là do Streptococcosis, vi khuẩn gram dương, đã gây thiệt nặng nề mà không có

vacccine nào phòng được, thậm chí trên cá trưởng thành và khỏe mạnh Vìvậy, erythromycin cũng là kháng sinh từ lâu được dùng để phòng và trị

bệnh trên cá rô phi do Streptococcus.

9

CHƯƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ DỤNG CỤ, HÓA CHẤT

2.1.1 Nguyên vật liệu

- Tôm càng xanh (≈ 50 g/con), cá rô phi (500÷550 g/con)

- Erythromycin base 96,5% từ cty Cổ Phần Dược Hậu Giang

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

- Thiết bị Analyzer SQF-505 của Trung Tâm Nhiệt Đới Việt Nga

- Bộ chiết pha rắn SPE của Phenomenex, cột HLB của Waters

- Các dụng cụ phân tích thông thường khác

2.1.3 Hóa chất

- Erythromycin A, chloramphenicol, florfenicol, furazolidone, ciprofloxacin,enrofloxacin, danofloxacin chuẩn có độ tinh khiết > 98% của hãng SigmaAldrich, Fluka Chemical

- Các dung môi, hóa chất phân tích khác

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thuyết minh nghiên cứu

Nội dung thứ I: Nghiên cứu các điều kiện cơ bản của kỹ thuật

stripping sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm để định lượngerythromycin Sau đó tiến hành đánh giá thẩm định hiệu năng phươngpháp Cuối cùng là lấy mẫu tôm càng xanh, cá rô phi thực tế tại 10 tỉnhĐBSCL để đánh giá bức tranh thực trạng nhiễm erythromycin

Nội dung thứ II: Theo dõi quá trình đào thải và chuyển hoá

erythromycin theo thời gian khi kháng sinh này đi vào cơ thể tôm càngxanh và cá rô phi bằng con đường thức ăn Từ đó rút ra quy luật thời gianngưng thuốc an toàn trước thu hoạch

2.2.2 Phương pháp thực nghiệm

2.2.2.1 Khảo sát các điều kiện tối ưu cho việc định lượng erythromycin trên

thiết bị Analyzer SQF - 505

10

Khảo sát và lựa chọn các loại dung dịch nền: Amoni axetat, Natriaxetat, Borax, Tris, Citrat - phosphat

Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố gây nhiễu: các ion vô cơ

Xây dựng đường chuẩn trong khoảng 50 ÷ 900 ppb

Lựa chọn quy trình trích ly mẫu: sử dụng cột chiết pha rắn để tách loại tạp

và làm giàu erythromycin

Độ chính xác, độ đúng, hiệu suất thu hồi

Khả năng nhận danh erythromycin A với các kháng sinh khác: Khảo sát

sự hiện diện của lần lượt các kháng sinh chloramphenicol, florfenicol,furazolidone, ciprofloxacin, enrofloxacin, danofloxacin xem có tách biệt vànhận danh rõ so với erythromycin A

So sánh đối chứng kết quả Stripping SWV với LC-MS/MS: Tôm càng xanh(cá rô phi) được nuôi đến trọng lượng thương phẩm, được lấy 3 mẫu vàphân tích tại trung tâm kiểm định Intertek Việt Nam để dùng làm mẫutrắng “blank” Sau đó tôm (cá) nuôi được gây nhiễm erythromycin bằngcon đường thức ăn; liều gây nhiễm 100 mg erythromycin/kg thể trọng/ngày; thời gian gây nhiễm 7 ngày liên tiếp và tiến hành lấy mẫu sau ngàythứ 7, 8 và 9 kể từ thời điểm ngưng thuốc Lúc này ta sẽ có 3 nhóm mẫunhiễm erythromycin (cao, trung bình, thấp) Ở mỗi nhóm nồng độ gâynhiễm (6 mẫu), chia làm 2 phần bằng nhau:

- Phần I: Phân tích bằng Stripping SWV (3 mẫu nồng độ thấp, 3 mẫu nồng

độ trung bình, 3 mẫu nồng độ cao).

11

- Phần II: Gửi phân tích đối chứng bằng LC-MS/MS tại trung tâm kiểm định Intertek Việt Nam (3 mẫu nồng độ thấp, 3 mẫu nồng độ trung bình, 3 mẫu nồng độ cao).

Ứng dụng phân tích erythromycin trên các mẫu thực tế tôm, cá tại các địaphương: Lấy các mẫu tôm càng xanh, mẫu cá rô phi đại diện ở 10 tỉnh(mỗi tỉnh lấy mẫu ở 3 huyện) ở đồng bằng sông Cửu Long về phân tích và

xử lý thống kê để đánh giá thực trạng nhiễm erythromycin Mỗi mẫu đượcphân tích 5 lần (n=5) trên máy Analyzer SQF - 505 Kết quả thể hiện: trungbình ± SD, % RSD

2.2.2.2 Xác định quy luật chuyển hóa sinh học, đào thải của erythromycin

trong cơ thể thủy sản khi nuôi

Kiểm soát từ giai đoạn thả giống đến khi đạt kích cỡ thương phẩmnhư: mật độ thả giống, kích cỡ thả giống nhiệt độ, pH, độ kiềm, hàm lượngoxy, khí độc, lượng thức ăn cho ăn, kích cỡ tôm khi xử lý kháng sinh,kháng sinh nguyên liệu, sàng lọc các dạng erythromycin B, C, D, E, F cótrong nguyên liệu erythromycin base này Thời gian xử lý kháng sinh, conđường đưa kháng sinh vào cơ thể, liều kháng sinh xử lý, số lần cho ăn thức

ăn trong ngày cũng được giám sát hết sức chặt chẽ Mẫu được phân tíchkhẳng định dư lượng erythromycin A, phân tích sàng lọc các dạng chuyểnhóa của erythromycin như erythromycin B, C, D, E, F theo phương phápLC-MS/MS thông qua Cty kiểm nghiệm TUV Rheinland Aimex Vietnam

2.2.3 Xử lý số liệu

Tất cả số liệu phân tích đều được xử lý thống kê bằng phần mềmStatgraphics và WT14

12

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CHO VIỆC ĐỊNH LƯỢNG ERYTHROMYCIN

3.1.1 Nghiên cứu thăm dò định hướng, chọn vùng quét thế và chiều quét thế

Erythromycin khá dễ tan trong nước nên các dung dịch nền dùngcho người cứu chủ yếu là dung dịch nước với các chất điện ly khác nhau.Trong công thức cấu tạo của erythromycin có nhóm C=O liên kết với mộtnguyên tử oxy khác, ngoài ra có một số dị vòng chứa oxy được liên kết mộtnguyên tử oxy nữa nên có thể dự đoán sẽ xuất hiện những sóng khử trongkhoảng thế từ -1,0 V đến -1,7 V Vì thế em sẽ tập trung nghiên cứu ở vùngthế này

Qua thăm dò sơ bộ em thấy có một vài sóng trong khoảng thế này,nhưng sóng ở thế vùng khoảng -1,4 V là tốt nhất đối với mục đích phân tíchđịnh lượng, nên các khảo sát tiếp theo em tập trung để tìm điều kiện tối ưucho sóng này

3.1.2 Nghiên cứu tìm dung dịch nền và pH phù hợp

Cường độ dòng của erythromycin bị ảnh hưởng bởi loại dung dịchnền Trong số các dung dịch nền khảo sát như Natri axetat, Amoni axetat,Citrat-Phosphat, Borax, đệm Tris thì dung dịch nền amoni axetat cho giá trịcường độ dòng erythromycin cao nhất và hình dạng đỉnh peak đẹp nhất

Khoảng pH của dung dịch amoni axetat được khảo sát trongkhoảng 7,0 đến 10,0 Erythromycin có cường độ dòng cao nhất ở pH 8,0(E1/2 = -1.430 mV, I = 351,7 ± 5,7 nA) Vì thế dung dịch nền amoni axetat(pH 8,0) được chọn để khảo sát tiếp theo

3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nền

Nồng độ dung dịch nền amoni axetat pH 8,0 được khảo sát trongkhoảng 0,05 ÷ 0,25 M Erythromycin có cường độ dòng cao nhất ởamoni axetat 0,1 M (E1/2 = -1.430 mV, I = 254,8 ± 10,2 nA)

13