xác định nồng độ thấp nhất có thể phát hiện được khi sử dụng phương pháp sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm để phân tích clenbuterol trong thức ăn gia súc

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ðOÀN TP. HỒ CHÍ MINH TP. HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ  *  B B Á Á O O C C Á Á O O N N G G H H I I Ệ Ệ M M T T H H U U (ðã ñược chỉnh sửa theo góp ý của Hội ñồng nghiệm thu ngày 29/01/2010) XÁC ðỊNH NỒNG ðỘ THẤP NHẤT CÓ THỂ PHÁT HIỆN KHI SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM ðỂ PHÂN TÍCH CLENBUTEROL TRONG THỨC ĂN GIA SÚC Chủ nhiệm ñề tài: CN. NGUYỄN THỊ VÂN CNCð. NGÔ HỮU THẮNG Cơ quan chủ trì: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ TP. Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2010 I TÓM TẮT ðỀ TÀI Clenbuterol là một chất thuộc nhóm β - agonist ñược sử dụng bất hợp pháp trong các sản phẩm thịt ñộng vật. Clenbuterol ñược bổ sung vào thức ăn gia súc nhằm tạo ra những con thú có tỷ lệ nạc hơn, tăng trọng nhanh hơn. Ngoài ra clenbuterol có tác dụng làm giãn phế quản, ñây là một dược phẩm ñược ñiều chế ñể ñiều trị giãn phế quản trên người. Vì vậy, clenbuterol có trong sản phẩm thịt ñộng vật có thể gây ngộ ñộc cho người sử dụng. Clenbuterol bị cấm sử dụng trong thực phẩm, theo tổ chức FDA và WHO hàm lượng Clenbuterol tối ña cho phép là 0,2 ppb có trong bắp thịt và béo, 0,6 ppb trong gan và cật. Clenbuterol ñược xác ñịnh hàm lượng bằng các phương pháp HPLC, GC – MS, ELISA, . . . Các phương pháp phân tích truyền thống thường chi phí phân tích mẫu cao. Phương pháp sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm bước ñầu nghiên cứu cho thấy có khả năng phân tích nhanh, ñơn giản, giá thành thấp, thiết bị do Việt Nam sản xuất. Trong ñiều kiện phân tích tốt nhất với dung dịch nền là Natri Borat 0.1M, pH 9,5. ðường chuẩn xây dựng trên mẫu có giới hạn phát hiện từ 28,2 ppb – 32,6 ppb. II SUMMARY Clenbuterol is one of major β - agonist illegally used in livestock production. It can improve the meat/fat ratio in fattened animals and accelarate livestock growth. It also has relaxing effect on non – striated musculature and can be used as an antiasthmatic and a tocolytic agent in human beings. Therefore, excess clenbuterol residues in livestock products may lead to health risks for consumers. This has led to a prohibition of clenbuterol use in food production. According to the US FDA and WHO, a maximum residue limit clenbuterol is 0.2 ppb (ppb) in muscle and fat, and 0.6 ppb (ppb) in liver and kidney. The amount of clenbuterol can be determined by methods such as HPLC or GC – MS, ELISA, etc. However, these traditional methods usually require very expensive preparation procedures. Alternatively, a square wave fast scanning polarography method (SQF) was primarily developed and validated to quantify these clenbuterol, which is simple, rapid, low – cost reagent, equipment made in Vietnam. Under optimum conditions, Clenbuterol could be baseline separated within a running natri borat buffer 0.1M, pH 9.5. Highly linear response was obtained for above compound over three oders of magnitude with detection limits ranging from 28.2 ppb to 32.6 ppb. III MỤC LỤC Trang TÓM TẮT ðỀ TÀI I SUMMARY II MỤC LỤC III DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT V DANH SÁCH BẢNG VI DANH SÁCH ðỒ THỊ VII DANH SÁCH HÌNH VIII PHẦN MỞ ðẦU 1 ðẶT VẤN ðỀ 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Tổng quan về CLENBUTEROL 5 1.1.1. Cấu trúc khung của các β 2 – agonist: 5 1.1.2 Công thức cấu tạo Clenbuterol: 6 1.1.3. Tính chất lý hoá: 6 1.1.4. Công dụng: 6 1.1.5. Dược ñộng học: 7 1.1.6. Ảnh hưởng của sự tồn dư Clenbuterol trong thịt gia súc, gia cầm lên người sử dụng 10 1.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 10 1.3. Các phương pháp xác ñịnh Clenbuterol 11 1.3.1. Phương pháp miễn dịch enzym (ELISA) 11 1.3.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC – MS) 12 1.3.3. Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC – MS) 13 1.3.4. Phương pháp cực phổ sóng vuông 13 1.4. Tính cấp thiết của ñề tài 14 1.5. Giới thiệu máy phân tích Analyzer SQF – 505 16 1.5.1. Giới thiệu máy phân tích Analyzer SQF – 505 16 1.5.2. Cấu tạo máy 16 1.5.3. Nguyên tắc hoạt ñộng 17 1.5.4. Cách cài ñặt các thông số chạy máy 17 CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 2.1. Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu 19 2.2. Vật liệu, hoá chất thí nghiệm 19 2.2.1. ðối tượng nghiên cứu 19 2.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ 19 2.2.3. Hóa chất và thuốc thử 20 2.2.4. Chuẩn bị các dung dịch và mẫu giả ñịnh 20 2.3. Phương pháp nghiên cứu ñịnh lượng Clenbuterol 21 2.3.1 Nguyên tắc 21 2.3.2. Khảo sát ñiều kiện ñịnh lượng Clenbuterol bằng kỹ thuật cực phổ sóng vuông quét nhanh 21 2.4. Xây dựng quy trình xử lý mẫu thức ăn chăn nuôi 23 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30 3.1. Kết quả thực nghiệm 30 3.1.1. ðịnh lượng CLEN bằng kỹ thuật cực phổ sóng vuông quét nhanh 30 3.1.2. Xây dựng quy trình ñịnh lượng CLEN trong mẫu thức ăn gia súc 43 3.1.3 Khảo sát hiệu suất thu hồi CLEN trong 3 mẫu thức ăn gia súc 54 IV 3.2. Nghiên cứu phân tích CLEN trên máy ANALYZER SQF – 505 với Mode PSA – F: 56 3.2.1. Khảo sát trên Mode PSA – F: 56 3.2.2. Kết quả khảo sát trên Mode PSA – F: 56 3.3. Bàn luận 56 CHƯƠNG IV : KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 58 4.1. KẾT LUẬN 58 4.2. ðỀ NGHỊ 59 PHỤ LỤC 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 V DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT CLEN: Clenbuterol HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (high perfomance liquid chromatography) LC/MS: Sắc ký lỏng ghép khối phổ LOD: Giới hạn phát hiện (limit of detection ) LOQ: Giới hạn ñịnh lượng (limit of quantization) SQW – F: Sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm Tdrop: Thời ñiểm bắt ñầu quét thế trong ñời sống một giọt Vstar: Thế bắt ñầu ghi phổ Vstep: Bước thế quét một chiều Vpulse: Biên ñộ xung Vstop: Thế kết thúc quá trình ghi phổ VI DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1.1: Họ β 2 – agonist 5 Bảng 1.2: Thời gian ñào thải CLEN trong nước tiểu và phân ñộng vật 9 Bảng 1.3: ðộ phản ứng chéo của các chất trong họ β 2 – agonist 12 Bảng 3.1: Khảo sát dung dịch nền Na 2 B 4 O 7 – H 3 BO 3 0,2M 30 Bảng 3.2: Khảo sát dung dịch nền Natriacetat 0,2 M 30 Bảng 3.3: Khảo sát dung dịch nền Amoni acetat 0,2 M 30 Bảng 3.4: Khảo sát dung dịch nền Natrihydrophosphat 0,2 M 31 Bảng 3.5: Sự phụ thuộc cường ñộ dòng vào nồng ñộ ñệm Natriborat của CLEN 300 ppb 32 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát chế ñộ quét xuôi và quét ngược 32 Bảng 3.7: Kết quả khảo sát V star 34 Bảng 3.8: Kết quả khảo sát Vstep: 34 Bảng 3.9: Kết quả khảo sát Vpulse 35 Bảng 3.10: Kết quả khảo sát Time drop 35 Bảng 3.11: Cường ñộ dòng I (nA) của CLEN ñể xây dựng ñường chuẩn trong dung dich nước 41 Bảng 3.12 : Kết quả khảo sát ñộ lặp lại của phép ño 42 Bảng 3.13 : Hiệu suất chiết của các quy trình 48 Bảng 3.14: Kết quả cường ñộ dòng I (nA) ño ñược khi dựng ñường chuẩn trên mẫu 1 48 Bảng 3.15: Kết quả cường ñộ dòng I (nA) khi dựng ñường chuẩn trên mẫu 2 50 Bảng 3.16: Kết quả cường ñộ dòng I (nA) ño ñược khi dựng ñường chuẩn trên mẫu 3 51 Bảng 3.17: Kết quả cường ñộ dòng I (nA) khi dựng ñường chuẩn trên mẫu 4 53 Bảng 3.18: Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi 3 mẫu thức ăn gia súc bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm 55 VII DANH SÁCH ðỒ THỊ Trang ðồ thị 3.1: So sánh cường ñộ dòng CLEN của 4 dung dịch nền khác nhau 31 ðồ thị 3.2: Cực phổ ñồ của CLEN 300 ppb khi tiến hành quét xuôi trong dung dịch nền Natriborat 0,1 M; pH = 9,5 33 ðồ thị 3.3: Phổ sóng Cl - trong dung dịch nền KNO 3 0.1M 37 ðồ thị 3.4: Phổ sóng Fe 3+ 4ppb trong dung dịch nền Pyrophosphat 38 ðồ thị 3.5: Phổ sóng Cu 2+ nồng ñộ 4ppb trong dung dịch nền Natri borat 39 ðồ thị 3.6: Phổ sóng Vitamin C nồng ñộ 4ppb trong dung dịch nền Amoni acetat 40 ðồ thị 3.7: Xây dựng ñường chuẩn CLEN trong dung dịch nước 41 ðồ thị 3.8: Cực phổ ñồ sóng vuông của CLEN xây dựng trên mẫu 1 49 ðồ thị 3.9: ðường chuẩn của CLEN xây dựng trên mẫu 1 49 ðồ thị 3.10: Cực phổ ñồ sóng vuông của CLEN xây dựng trên mẫu 2 50 ðồ thị 3.11: ðường chuẩn của CLEN xây dựng trên mẫu 2 51 ðồ thị 3.12: Cực phổ ñồ sóng vuông của CLEN xây dựng trên mẫu 3 52 ðồ thị 3.13: ðường chuẩn của CLEN xây dựng trên mẫu 3 52 ðồ thị 3.14: Cực phổ ñồ sóng vuông của CLEN xây dựng trên mẫu 4 53 ðồ thị 3.15: ðường chuẩn của CLEN xây dựng trên mẫu 4 54 VIII DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1.1: Công thức cấu tạo của CLENBUTEROL 6 Hình 1.2: Quá trình chuyển hóa CLEN trong cơ thể 7 Hình 1.3: Quá trình chuyển hóa Clenbuterol trong nước tiểu chó 8 IX DANH SÁCH PHỤ LỤC HÌNH Hình 1.1: Phổ khảo sát dung dịch nền amoni acetat pH 9.5 60 Hình 1.2: Phổ khảo sát dung dịch nền amoni acetat pH 10.5 60 Hình 1.3: Phổ khảo sát dung dịch nền amoni acetat pH 8.5 61 Hình 1.4: Phổ khảo sát dung dịch nền amoni acetat pH 7.5 61 Hình 1.5: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri hydrophosphat pH 10.5 62 Hình 1.6: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri hydrophosphat pH 9.5 62 Hình 1.7: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri hydrophosphat pH 8.5 63 Hình 1.8: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri hydrophosphat pH 7.5 63 Hình 1.9: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri acetat pH 10.5 64 Hình 1.10: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri acetat pH 9.5 64 Hình 1.11: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri acetat pH 8.5 65 Hình 1.12: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri acetat pH 7.5 65 Hình 1.13: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri borat pH 9.5 66 Hình 1.14: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri borat pH 10.5 66 Hình 1.15: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri borat pH 8.5 67 Hình 1.16: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri borat pH 7.5 67 Hình 1.17: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri borat pH 6.5 68 Hình 1.18: Phổ khảo sát V Start trong dung dịch nền Natri borat, V Start = 0 mV 68 Hình 1.19: Phổ khảo sát V Start trong dung dịch nền Natri borat, V Start = -100 mV 69 Hình 1.20: Phổ khảo sát V Start trong dung dịch nền Natri borat, V Start = -200mV 69 Hình 1.21: Phổ khảo sát V Start trong dung dịch nền Natri borat, V Start = -300mV 70 Hình 1.22: Phổ khảo sát V step trong dung dịch nền Natri borat với V Step = 4 mV 70 Hình 1.23: Phổ khảo sát V step trong dung dịch nền Natri borat với V Step = 6 mV 71 Hình 1.24: Phổ khảo sát V step trong dung dịch nền Natri borat với V Step = 8 mV 71 Hình 1.25: Phổ khảo sát V step trong dung dịch nền Natri borat với V Step = 10 mV 72 Hình 1.26: Phổ khảo sát V Pulse trong dung dịch nền Natri borat với V Pulse = 10mV 72 Hình 1.27: Phổ khảo sát V Pulse trong dung dịch nền Natri borat với V Pulse = 20mV 73 Hình 1.28: Phổ khảo sát V Pulse trong dung dịch nền Natri borat với V Pulse = 30mV 73 Hình 1.29: Phổ khảo sát V Pulse trong dung dịch nền Natri borat với V Pulse = 40mV 74 Hình 1.30: Phổ kết quả khảo sát V stop = - 2000mV 74 Hình 1.31: Phổ khảo sát nồng ñộ dung dịch nền Natri borat 0.05M, pH 9.5 75 Hình 1.32: Phổ khảo sát nồng ñộ dung dịch nền Natri borat 0.1M, pH 9.5 75 Hình 1.33: Phổ khảo sát nồng ñộ dung dịch nền Natri borat 0.2M, pH 9.5 76 [...]... 6,2% Các phương pháp này có ngưỡng phát hiện thấp nhưng quy trình xử lý mẫu phức tạp, thời gian dài Clenbuterol có chứa nhóm chức amino vì vậy phương pháp sắc ký lỏng sử dụng đầu dò điện hoá cũng tỏ ra hiệu quả với điện cực glassy cacbon, điện cực so sánh Ag/AgCl hoặc Calomel với độ phát hiện mẫu thấp nhưng có nhược điểm là điện cực phải được làm sạch mài nhẵn sau mỗi lần phân tích Để tiện dụng, người... vụ Phân tích thí nghiệm và gửi mẫu đi Singapore phân tích theo phương pháp sắc ký để so sánh kết quả, đã công bố 2 doanh nghiệp sản xuất thức ăn gia súc sử dụng Clenbuterol bổ sung trong thức ăn gia súc Trước thực trạng các hoá chất bổ sung trong thức ăn chăn nuôi được sử dụng ở tất cả các công đoạn từ nguồn nguyên liệu đến chế biến, nhu cầu xét nghiệm nhanh rất cần thiết đối với các cơ quan quản lý... c tiêu c a đ tài: Xác đ nh n ng đ th p nh t có th phát hi n khi s d ng 2 phương pháp sóng vng qt nhanh trên c c gi t ch m đ Clenbuterol trong th c ăn gia súc N i dung (Theo đ cương đã duy t) 3 - Nghiên c u l a ch n dung d ch n n - Nghiên c u ch n ch đ ch y máy thích h p - Nghiên c u phương pháp chu n b m u - Nghiên c u phương pháp phân tích đ nh tính - Nghiên c u phương pháp phân tích đ nh lư ng -... Nghiên c u phương pháp chu n b m u ðã nghiên c u đư c quy trình x lý m u Nghiên c u phương pháp phân tích Phát hi n đư c Clenbuterol trong m u đo đ nh tính Nghiên c u phương ðã xây d ng đư ng chu n và đư ng thêm chu n, xác đ nh pháp phân tích đ nh ngư ng phát hi n, sai s và đ thu h i lư ng So sánh k t qu v i ðã g i m u 04 n n m u th c ăn gia súc đ phân tích b ng phương pháp khác T ng h p, phương pháp s... 13/01/2005 Máy phân tích ANALYZER đã được Bộ trưởng Bộ Khoa học Công nghệ tặng bằng khen tại Hội chợ Công nghệ và Thiết bò Việt Nam (Techmark 2005, 2007) Đây là một thiết bò phân tích điện hóa hiện đại được hoạt động theo nguyên lý sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm, cực tónh, cực rắn, … với phần mềm chuyên dụng tương thích với hệ điều hành Windows XP, có thể phân tích nhiều chất hữu cơ và vô cơ trong. .. Sử dụng Test-kit tiện lợi do không cần sử dụng máy móc phức tạp, không cần có 10 lượng mẫu lớn, đạt hiệu quả phát hiện, đạt tốc độ trả lời kết quả rất nhanh, tốn ít hóa chất Tuy nhiên ở một số trường hợp có thể gặp dương tính giả nếu nhân viên phân tích không có kinh nghiệm,… và có thể phải kiểm tra lại bằng phương pháp phân tích khác [8, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 19, 21, 22, 23] 1.3 Các phương pháp xác. .. bày trên, mặt khác xu hướng toàn cầu hoá kinh tế và gia nhập vào Tổ chức Thương mại thế giới (WTO) của nước ta thì việc tồn dư lượng thuốc trong thực phẩm sẽ là rào cản đối với các doanh nghiệp xuất khẩu thòt và sản phẩm động vật Vì vậy, chúng tôi đề xuất đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu xây dựng qui trình phân tích Clenbuterol trong thức ăn gia súc bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm ... lo i thu c có tác d ng tương t Năm 2006, cơ quan thu c và th c ph m M c m s d ng k c trong đi u tr cho ngư i [11, 12, 18 ] 1.2 Tình hình nghiên c u ngồi nư c Để kiểm tra phát hiện Clenbuterol trong thức ăn gia súc, sản phẩm thòt gia súc, các nước EU đang sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng (HPLC) hoặc sắc ký khí khối phổ (GC-MS) với giới hạn phát hiện 1,02 ppb, đònh lượng được 85% Clenbuterol, độ lệch chuẩn... c c ph d ng sóng, trong đó chi u cao c a sóng ph và di n tích sóng ph tương ng v i th bán sóng trong c c ph DC Th i gian phân tích nhanh nên có th l p l i phép phân tích nhi u l n Theo tính tốn, v i xung sóng vng có chu kỳ 5ms và bư c th 10 mV, đ thu đư c c c ph hồn ch nh trong ph m vi th qt là 0 – 1V ch trong 0.5s Trong cùng đi u ki n trên v i c c ph xung vi phân ph i c n 50 s Lo i tr nh hư ng c a... t n dư nh ng ch t có h i cho s c 3 kh e bao g m kháng sinh và các ch t kích thích tăng trư ng trong đó có Clenbuterol ð có đư c nh ng s n ph m an tòan, khơng ch có bi n pháp qu n lý khâu chun ch , gi t m , ch bi n mà c n có bi n pháp qu n lý t khâu chăn ni, ngun li u ch bi n th c ăn cũng như thành ph m t i các cơ s ch bi n th c ăn trư c khi xu t bán đ n ngư i chăn ni Vi c phân tích phát hi n ra dư lư . Mục tiêu của ñề tài: Xác ñịnh nồng ñộ thấp nhất có thể phát hiện khi sử dụng phương pháp sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm ñể phân tích Clenbuterol trong thức ăn gia súc 3. Nội dung (Theo. chỉnh sửa theo góp ý của Hội ñồng nghiệm thu ngày 29/01/2010) XÁC ðỊNH NỒNG ðỘ THẤP NHẤT CÓ THỂ PHÁT HIỆN KHI SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM ðỂ PHÂN TÍCH CLENBUTEROL. Xác ñịnh nồng ñộ thấp nhất có thể phát hiện khi sử dụng phương pháp sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm ñể phân tích Clenbuterol trong thức ăn gia súc . Chủ nhiệm ñề tài: - CN. Nguyễn