BÁO CÁO KHOA HỌC: "SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐA HÌNH ADN (PCRRFLP) TRÊN VÙNG INTRON 18 ĐỂ XÁC ĐỊNH CÁ THỂ MANG GEN BỆNH MÁU KHÓ ĐÔNG HEMOPHILIA" potx

3 Viện Huyết học và truyền máu TW Tóm tắt: 9 bà mẹ của 9 bệnh nhân nam mắc bệnh Hemophilia A trong đó có trường hợp một mẹ và hai con trai mang bệnh được phân tích tính đa hình ADN của

SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐA HÌNH ADN

(PCR-RFLP) TRÊN VÙNG INTRON 18 ĐỂ XÁC ĐỊNH CÁ THỂ MANG GEN BỆNH MÁU KHÓ ĐÔNG

HEMOPHILIA A

Lê Nhật Minh 1 , Lê Thị Kim Tuyến 1 , Võ Thị Thương Lan 2 , Đỗ Trung Phấn 3

1

Phòng sinh học phân tử, Viện Vệ sinh dịch tễ TW

2

Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

3

Viện Huyết học và truyền máu TW

Tóm tắt: 9 bà mẹ của 9 bệnh nhân nam mắc bệnh

Hemophilia A (trong đó có trường hợp một mẹ và hai con trai mang bệnh) được phân tích tính đa hình ADN của vùng Intron 18 trên gen mã cho yếu tố VIII bằng enzym giới hạn Bcl I Kết quả phân tích cho thấy 4/9 bà mẹ (44.44%) mang cặp alen dị hợp tử XhX về bệnh máu khó đông và truyền bệnh cho con trai mình tạo thành dạng XhY gây bệnh

MỞ ĐẦU

Bệnh ưa chẩy máu hay còn gọi là Hemophilia là một bệnh

di truyền gen lặn, liên kết nhiễm sắc thể giới tính X thường gặp ở nước ta Bệnh Hemophilia là do thiếu các yếu tố

đông máu tham gia vào quá trình đông máu như yếu tố VIII

- hemophilia A hoặc yếu tố IX - hemophilia B [1,2] Tỉ lệ mắc bệnh ở các nước khác nhau, trung bình 1/10.000 dân Nước ta, theo thống kê của Viện Huyết học và Truyền máu

TW có khoảng 5000 bệnh nhân Hemophilia Trong số bệnh nhân mắc bệnh máu khó đông thì bệnh Hemophilia A là phổ biến hơn cả, chiếm khoảng 85%.Trên thế giới các

nghiên cứu sinh học phân tử đã chứng minh Hemophilia A

có liên quan với một số đột biến nhất định trên gen mã hoá tổng hợp yếu tố VIII Trong đó, đột biến ở vùng intron 18

liên quan với sự mất vị trí nhận biết của enzym giới hạn Bcl

I là phổ biến nhất Đề tài này, nghiên cứu mối liên quan của bệnh Hemophilia A ở Việt nam với đột biến này Trên cơ

sở đó có thể xác định được những bà mẹ mang gen dị hợp

tử XhX và chẩn đoán sớm, có thể là ngay từ giai đoạn bắt đầu mang thai, để có những biện pháp xử lý thích ứng với mỗi trường hợp

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Đối tượng: Năm ml máu được lấy từ 9 bà mẹ và 9

bệnh nhân nam (con trai của các bà mẹ đó) Máu được chống đông bằng EDTA 10mM

2 Phương pháp:

a ADN được tách từ máu theo phương pháp sử dụng nồng

độ muối cao [ ]

b Phản ứng PCR: một ống 50l gồm có: 5l ADN khuôn; 5l dNTPs 10mM; 1,5mM MgCl2; 0,5 U Taq; 0,8 nM mỗi loại mồi; 5l đệm PCR 50l mỗi ống được làm phản ứng PCR trên máy Amp Gen 9700 với chương trình 94oC- 7’;

30 chu kỳ: 94oC - 1’; 58oC-1’’; 72oC -1’; 72oC 10 phút; 40C-20’ 40nM ADN mồi với trình tự của đôi mồi là:

8.1: 5’ TAAAAGCTTTAAATGGTCTAGGC 3’

8.2: 5’ TTCGAATTCTGAAATTATCTTGTTC 3’

c Cắt sản phẩm PCR với enzym giới hạn: 1l BclI; 3l

đệm enzym NBE3 (New England Biolab) và 25l sản

phẩm PCR

d Chạy điện di: sản phẩm PCR trước và sau khi cắt với BclI được chạy điện di trên gel Polyacryamid 10%, 100V trong 1h

e Phát hiện các băng ADN bằng phương pháp nhuộm bạc

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Kết quả PCR của các mẫu bệnh phẩm

ADN tách từ các bệnh nhân Hemophilia A và các bà mẹ được dùng trong phản ứng PCR

Hình 1: Kết quả PCR của các mẫu bệnh phẩm M1: Thang

ADN x 174HaeIII; M2: ADN pBR322 MspI; 1-7: Sản

phẩm PCR của bệnh nhân Hemophilia A; 8 chứng dương

người bình thường

Kết quả điện di trên Hình 1 cho thấy những mẫu bệnh

phẩm cho sản phẩm PCR là đoạn ADN trên intron 18 có độ dài 142 bp

2 Kết quả phân tích RFLP của intron 18 bằng emzym

giới hạn BclI

Đoạn ADN dài 142 bp thuộc vùng intron 18 trên nhiễm sắc thể X bình thường (không có đột biến) có một vị trí nhận

biết của enzym giới hạn BclI tại nucleotit thứ 99 Do đó nó

sẽ bị cắt thành hai đoạn ADN có chiều dài tương ứng là 99

bp và 43 bp Vạch ADN nhỏ 43bp thể hiện mờ hơn trên gel

vì độ phát sáng của phương pháp nhuộm bạc tương đương với trọng lượng phân tử ADN Sự có mặt rõ ràng của vạch 99bp đủ để xác định không có đột biến Khi xảy ra đột biến

điểm làm thay đổi trình tự tại vị trí nhận biết của BclI, đoạn

ADN không bị cắt và giữ nguyên chiều dài 142 bp Như vậy tính đa hình độ dài các đoạn ADN cắt với enzym giới

hạn BclI (PCR-RFLP) gồm các đoạn ADN có kích thước

142 bp; 99 bp và 43 bp Trên cơ sở đó có thể phân tích kết quả xét nghiệm của một số cặp mẹ con (Hình 2)

Hình 2: Kết quả điện di và phân tích RFLP M1: ADN

chuẩn X174 HaeIII; M2: ADN chuẩn pBR 322 MspI 1-2:

cặp mẹ con thứ 1; 3-4: cặp mẹ con thứ 2; 5-6: cặp mẹ con

thứ 3; 7-8: cặp mẹ con thứ 4

1 Ở cặp mẹ con thứ nhất (1: người con trai; 2: người mẹ) và thứ tư (7: người con trai; 8: người mẹ) cho thấy tính

đa hình độ dài các đoạn giới hạn với enzym Bcl I

(PCR-RFLP) ở người mẹ thể hiện ba đoạn ADN có kích thước 142bp, 99bp và 43bp Theo kết quả RFLP của hai người mẹ này thì đột biến xảy ra trên một nhiễm sắc thể giới tính X tại vùng không mã hoá intron 18, thuộc đoạn ADN dài

142bp được nhân lên bằng phản ứng PCR Đột biến này tương ứng với sự thay đổi nucleotit làm mất vị trí nhận biết

của enzym giới hạn BclI Kết quả là đoạn ADN dài 142 bp

vẫn được giữ nguyên (Hình 2) Như vậy, có thể kết luận được người mẹ này có kiểu gen XhX và là người mang gen bệnh Đồng thời phân tích RFLP trên Hình 2 ở hai người con trai của hai bà mẹ này cho thấy chỉ có duy nhất một đoạn ADN kích thước 142 bp Kết hợp với số liệu được cung cấp về tình trạng bệnh của người con trai này (người con trai này bị bệnh máu khó đông Hemophilia A) chúng tôi có thể đi đến một kết luận chính xác rằng: người con trai nhận một gen tổn thương Xh từ mẹ, có kiểu gen là XhY và biểu hiện kiểu hình bệnh máu khó đông

Tóm lại có thể nhận định chính xác về tình trạng bệnh ở hai cặp mẹ con thứ nhất và thứ tư là như sau: kiểu gen của

người mẹ là dị hợp tử XhX Người mẹ mang gen bệnh và truyền gen đó cho con trai mình tạo nên kiểu gen XhY gây nên bệnh máu khó đông

2 Kết quả phân tích đa hình trên Hình 2 ở cặp mẹ con bệnh nhân thứ 3 (5: con trai; 6: người mẹ) cho thấy vị trí

của enzym giới hạn BclI là đặc hiệu thể hiện qua tính đa

hình ở người con có hai đoạn ADN 99 bp và 43 bp Kết quả này chỉ ra rằng nhiễm sắc thể X là bình thường với chỉ thị

enzym giới hạn BclI Tuy nhiên kết hợp thông tin lâm sàng,

người con trai bị bệnh máu khó đông Hemophilia A như vậy là nhiễm sắc thể X của người con trai này phải là

không bình thường Kiểu gen XhY biểu hiện bệnh là do nhận một nhiễm sắc thể X tổn thương từ mẹ nhưng đột biến

không xẩy ra ở vị trí của BclI mà ở vị trí khác Điều này

cũng phù hợp khi phân tích tính đa hình của người mẹ chỉ

có hai đoạn ADN là 99 bp và 43 bp Như vậy cả hai nhiễm

sắc thể X của người mẹ này là bình thường ở vị trí BclI

Muốn có những kết luận chính xác về tình trạng bệnh máu khó đông của cặp mẹ con này cần tiến hành thêm ở những chỉ thị khác làm thêm một số chỉ thị khác như enzym giới

hạn XbaI trên vùng không mã hoá intron 22, enzym giới hạn HindIII trên vùng không má hoá intron 19, enzym giới hạn BglI trên intron 25… Nếu kết quả phân tích tính đa

hình trên cặp mẹ con này cũng cho những kết quả tương tự

như khi phân tích với BclI có thể đưa đến một kết luận

khác: nhiễm sắc thể X của mẹ là hoàn toàn bình thường, bệnh máu khó đông ở người con trai này có thể là do đột biến tự phát xảy ra trong quá trình hình thành tế bào sinh dục (ở người mẹ) như các đột biến mất đoạn hay đột biến điểm Tuy nhiên tỷ lệ của các đột biến tự phát thường

không cao

3 Kết quả phân tích đa hình trên Hình 2 của cặp mẹ con bệnh nhân thứ hai (3: con trai và 4: người mẹ) chỉ có một đoạn ADN 142bp Có thể kết luận người mẹ có kiểu gen đồng hợp tử XhXh, đột biến xảy ra trên cả hai nhiễm sắc thể

giới tính làm mất vị trí nhận biết của enzym giới hạn BclI

Những trường hợp phụ nữ mang gen đồng hợp tử XhXh có biểu hiện bệnh rất nặng và hiếm gặp Trên thế giới hiện nay chỉ ghi nhận 10 trường hợp phụ nữ bị bệnh máu khó đông

và những người này thường chết từ độ tuổi rất sớm do mất

máu nhiều lần trong đời sống sinh lý bình thường có ở bất

kỳ người phụ nữ nào Tuy nhiên những thông tin về lâm sàng chỉ ra rằng ở người mẹ này là không phải như vậy

Kết quả với bà mẹ thứ hai có thể được giải thích như sau: Đoạn ADN dài 142 bp ở đây không bị cắt có thể do nhiều

lý do như enzym giới hạn không hoạt động, có chất ức chế trong phản ứng…Do đó chưa thể kết luận được vị trí của

enzym giới hạn BclI tạo nên sự đa hình ADN trên vùng

không mã hoá intron 18 Mặc dù người con trai bị bệnh máu khó đông nhưng trường hợp này cần phải lặp lại thí

nghiệm phân tích sự đa hình của ADN bằng BclI và làm

thêm một số chỉ thị khác tương tự như đã nếu trong trường hợp thứ 2 Điều này hoàn toàn có thể giải thích được vì tần

số đa hình cho mỗi chỉ thị không phải hoàn toàn là 100% Trong những trường hợp như vậy một trong những hướng suy nghĩ tiếp theo mà chúng tôi mong muốn được tiến hành

là xác định trình tự đoạn ADN này

Tổng hợp lại có 4/9 (44,44%) bà mẹ xác định được rõ ràng

sự di hợp tử về bệnh Hemophilia A (XhX) và truyền gen

bệnh đột biến trên vùng intron 18 liên quan với enzym giới

hạn BclI sang cho con của mình Tỉ lệ này cũng tương

đương với các quần thể dân cư khác trong khu vực như Trung Quốc, Nhật Bản 3/9 trường hợp (33.33%) đột biến không xẩy ra trên intron 18 làm mất vị trí nhận biết của

enzym giới hạn Bcl I Còn lại 2/9 (22,22%) chưa có những

kết luận chính xác và cần phải tiến hành các thí nghiệm khẳng định khác Ở đây chúng tôi mới bước đầu xây dựng

và triển khai một phương pháp sinh học phân tử để chẩn đoán bệnh Hemophilia A Bệnh nhân mắc bệnh máu khó đông nếu được phát hiện sớm, điều trị kịp thời và đầy đủ sẽ tham gia sinh hoạt và hoạt động xã hội như những thành viên bình thường.Trên cơ sở phương pháp này có thể áp dụng để xác định sớm, xác định những cá thể mang gen bệnh (người mẹ) cũng như các cá thể mang các đột biến tự phát sinh có khả năng lan truyền trong quần thể đối với bệnh máu khó đông hemophilia A Qua đó cung cấp những thông tin chính xác cho công tác chăm sóc và điều trị bệnh nhân được tốt hơn Đồng thời có thể đóng góp cho việc điều tra chất lượng dân số và đề ra những chính sách thích hợp

KẾT LUẬN

1 Xây dựng được phương pháp đa hình ADN

(PCR-RFLP) sử dụng enzym giới hạn BclI trên vùng intron 18 để

xác định được những cá thể là các bà mẹ mang gen bệnh truyền cho con

2 Bốn trong 9 gia đình có đột biến bệnh máu khó đông hemophilia A liên qua tới vùng intron 18 và do các bà mẹ mang gen bệnh truyền cho con trai của mình gây nên tình trạng bệnh lý

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Bạch Quốc Tuyên (1991), Bệnh ưa chẩy máu, Bách khoa thư bệnh học

2 Đỗ Trung Phấn (2001), Tổ chức quản lý và chăm sóc bệnh nhân hemophilia, Thông tin hemophilia Việt nam, Viện Huyết học và truyền máu TW

3 Cung Thị Tý (2001) Tình hình bệnh hemophilia ở các

Tỉnh phía bắc Việt Nam, Thông tin Hemophilia Việt Nam, Viện huyết học và truyền máu

4 D J Bowen (2001) “Hemophilai A and hemophilai B: molecular insight”,

J Clin Pathol: Mol Pathol 2002; 55:1-18

5 Young Min Choi (2000), “Carrrier detection and

prenatal diagnosis of hemophilia A in A Korean population

By PCR- based analysis of the BclI/ intron 18 and St14 VNTR polymorphisms.” Human Genet 45: 218-223

CARRIER DETECTION OF HEMOPHILIA A BY PCR-RFLP ANALYSIS OF THE Bcl 1 / INTRON 18 DNA POLYMORPHISMS

Le Nhat Minh 1 , Le Thi Kim Tuyen 1 , Vo Thi Thuong Lan 2 , Đo Trung Phan 3

1

National Institute of Hygien and Epidemiology

2

Hanoi National University

3

National Insitute of Hematology and Blood Transefer

The hemophilia are inherited, life-long,sex-linked disorders

occurring predominantly in males The incidence is about 1: 5.000 male births and all races and socioeconomic

groups are affected Haemophilia is allelic X linked

recesive disease caused by mutations in the human Factor VIII gene Haemophilia is the classical example of sex

linked recessive disorder As males have only one X

chromosome, the synthesis of FVIII of FIX wil be deficient

if the relevant gene is defective A commonly used strategy for DNA based carrier detection and prenatal diagnosis is

to study the inheritance of DNA polymorphism either

within the FVIII of FIX gene (intragenic) of closely linked

to them (extragenic) Such polymorphisms (RFLP) or

variable number tandem repeats (VNTR) result in up to 95% of families being informative using intragenic

polymorphism where a degree of certainty > 99% can be expected Where only linked polymorphisms are useful this figure is reduced to 95% certainy These are being

identified with increasing frequency using technology

based on Southern blotting of polymerase chain reaction (PCR) amplification of specific sequences of DNA to give adequate quantities for analysis

In this study we’re applying a new method “use DNA

polymorphism with marker Bcl 1 restriction enzyme on

intron 18” for detecting these mothers who carriers a

abnormal X chromosome with hemophilia and transfer to her sons make hamophilia patient The results show that 4/9 (44.45%) mothers is heterozygote with hemophilia A and is the carriers We need to determine those mothers in

associate and combine with prenatal, pregnancy diagnosis

to restrict transmission in social

Người thẩm định nội dung khoa học: TS Hồ Thị Minh Lý