Chương 2.NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Nấm men

Nấm men Saccharomyces cerevisiae TSV09 được cung cấp bởi phòng thí

nghiệm Vi sinh thực phẩm, bộ môn Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học

Bách Khoa.

Đặc điểm hình thái

- Tế bào hình cầu

- Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi, hoặc bằng bào tư - Bào tư hình tròn hoặc ellipse.

Khả năng lên men trong điều kiện không có oxy

D-Glucose + D-Galatose + Maltose + Sucrose + α,α-Trehalose + Melibose + Raffinose + Lactose - Cellobiose - Inulin - Starch - D-Xylose -

(+) lên men được (-) không lên men được

Độ lên men cuối cùng trên môi trường dịch nho (nồng độ đường khư 240g/L) là 98%.

Khả năng sinh trưởng:

D-Glucose + D-Galactose + Maltose + α,α-Trehalose + Sucrose + Melibiose + Raffinose + L-Sorbose - D-Ribose - D-Xylose - Arabinose - L-Rhamnose - Cellobiose - Lactose - Melezitose - Inuline - Starch - Glycerol - Erythritol - Ribitol - L-Arabinitol - D-Glucitol - D-Manitol - Galactitol - myo-Inositol - D-Gluconate - D-Glucuronate - D-Galacturonate - DL-Lactate - Succinate - Citrate - Methanol - Ethanol - Propane 1,2 diol - Butane 2,3 diol - Nitrate - Nitrite - Ethylamine - L-Lysine - Creatine - Creatinine - Glucosamine - Imidazole - w/o vitamins + w/o myo-Inositol -

w/o Biotin + w/o Thiamin + w/o Biotin/Thiamin + w/o Pyridoxine + w/o Niacin + 25oC + 30oC + 35oC + 37oC + 40oC + 0.01% Cycloheximide - 0.1% Cyclohexamide - 1% Acid Acetic - 50% D-Glucose - 60% D-Glucose -

(+) có thể sinh trưởng (-) không thể sinh trưởng

2.1.2 Alginate

Chất mang alginate được tách chiết từ rong mơ, thuộc giống Sargassummeclurei,

sư dụng trong luận án có dạng vẩy rắn, màu nâu nhạt, độ ẩm 20,4%, độ nhớt của dung dịch alginate 2% ở 25oC là 436Cp, tỷ lệ M/G là 1,2 [188].

2.1.3 Cellulose vi khuẩn

Cellulose vi khuẩn được thu nhận từ quá trình lên men nước dừa già theo phương pháp lên men bề mặt, sư dụng vi khuẩn Acetobacter xylinum BC12 do bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đại học Bách Khoa cung cấp. Quy trình thu nhận chất mang được trình bày ở phụ lục 1.1. Chất mang cellulose vi khuẩn có dạng tấm màu trắng ngà, độ ẩm 93%, độ dày 7mm, được cắt thành những khối hình hộp chữ nhật có kích thước khác nhau theo hoạch định thí nghiệm.

2.1.4 Nho

Nho Shiraz và Red Cardinal được mua từ các vườn nho ở Ninh Thuận. Nho được đem ép lấy dịch rồi trữ đông ở -40oC để dùng trong suốt quá trình thí nghiệm. Quy trình thu nhận dịch nho được trình bày trong phụ lục 1.2. Thành phần của các dịch nho sau khi ép được trình bày trong bảng 2.1.

Bảng 2.4. Thành phần của các dịch nho sau khi ép

Thông số Đơn vị Giống nho

Red Cardinal Shiraz

pH 3,71 3,45 Độ chua g a.tartaric/100mL 0,65 1,45 Đường khư g/L 115 152 Hàm lượng chất khô oBx 12 16 Nitơ amin tự do ppm 172 225 Nitơ ammonium ppm 45 215 Tannin g/L 1,8 5,8 SO2 tổng ppm 12 45 2.1.5 Các loại hóa chất khác

2.1.5.1 Hóa chất bổ sung vào dịch lên men

Đường glucose, (NH4)2HPO4, Na2S2O5, tannic acid, tartaric acid để bổ sung vào dịch lên men là các loại hóa chất tinh khiết có xuất xứ từ công ty Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd và Guangdong Xilong Chemical Co., Ltd, Trung Quốc.

2.1.5.2 Hóa chất phân tích

Các hóa chất dùng để thực hiện phân tích định lượng có xuất xứ từ hãng Merck & Co., Inc, Đức và Sigma Chemical Co., Hoa Kỳ.

2.2 Nội dung nghiên cứu

− Xác định các thông số thích hợp cho quá trình cố định tế bào nấm men trong gel alginate và trên cellulose vi khuẩn bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm. − Khảo sát và so sánh hoạt tính lên men của nấm men cố định trong gel alginate, nấm

men cố định trên cellulose vi khuẩn và nấm men tự do trong quá trình lên men chính rượu vang nho.

− Khảo sát quá trình lên men rượu vang qua các chu kỳ tái sư dụng và so sánh khả năng tái sư dụng của nấm men cố định trong gel alginate và nấm men cố định trên cellulose vi khuẩn.

− Xác định phương trình cân bằng vật chất của quá trình lên men chính trong sản xuất rượu vang nho cho nấm men cố định trong gel alginate, nấm men cố định trên cellulose vi khuẩn và nấm men tự do, từ đó so sánh một cách toàn diện về hiệu suất sinh tổng hợp các sản phẩm lên men của chúng.

2.3 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

2.3.1 Phương pháp cổ điển

Chúng tôi thay đổi giá trị một thông số cần khảo sát, cố định giá trị các thông số còn lại, từ đó xác định quy luật biến đổi của hàm mục tiêu theo thông số khảo sát.

2.3.2 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao hai yếu tố

Chúng tôi thay đổi đồng thời hai thông số cần khảo sát theo ma trận quy hoạch thực nghiệm nhằm đánh giá sự ảnh hưởng đồng thời của hai yếu tố đến hàm mục tiêu và xác định giá trị của hai yếu tố để hàm mục tiêu đạt giá trị cực đại.

Xác định các điều kiện thích hợp để cố định nấm men vang trong gel alginateXác định các điều kiện thích hợp để cố định nấm men vang trên cellulose vi khuẩn

Xác định các điều kiện thích hợp để cố định nấm men bằng quy hoạch cổ điển

Xác định các điều kiện thích hợp để cố định nấm men vang trong gel alginate bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

Xác định các điều kiện thích hợp để cố định nấm men theo phương pháp hấp phụ Xác định thời gian ủ để cố định nấm men theo phương pháp hấp phụ-ủ

So sánh hoạt tính lên men của nấm men cố định trên cellulose vi khuẩn theo hai phương pháp hấp phụ và hấp phụ-ủ

Khảo sát và so sánh khả năng lên men của nấm men tự do, nấm men cố định trong gel alginate và trên cellulose vi khuẩn trong quá trình lên men rượu vang

Khảo sát khả năng sinh trưởng của nấm men cố định và nấm men tự do

Khảo sát khả năng chuyển hóa cơ chất của nấm men cố định và nấm men tự do Khảo sát khả năng sinh tổng hợp sản phẩm của nấm men cố định và nấm men tự do

Khảo sát và so sánh khả năng tái sử dụng của nấm men cố định trong gel alginate và trên cellulose vi khuẩn

Thiết lập phương trình cân bằng vật chất cho quá trình lên men vang sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do

Khảo sát hiệu quả quá trình ngâm hạt gel alginate trong dung dịch CaCl2 sau mỗi chu kỳ tái sư dụng So sánh khả năng tái sư dụng của nấm men cố định trong gel alginate và trên cellulose vi khuẩn

2.5 Bố trí thí nghiệm

2.5.1 Xác định các điều kiện thích hợp để cố định nấm men vang trong gel alginate

Mục đích: xác định các điều kiện thích hợp để cố định nấm men vang trong gel Ca alginate. Nấm men cố định thu được sẽ được dùng cho các thí nghiệm khảo sát hoạt tính lên men và khả năng tái sư dụng theo phương pháp lên men tĩnh - nhiều chu kỳ trong quá trình lên men rượu vang.

2.5.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố trong quá trình cố định nấm men vang trong gel alginate bằng quy hoạch cổ điển

Bên cạnh yếu tố mật độ tế bào trong huyền phù giống, các yếu tố nồng độ dung dịch alginate và nồng độ dung dịch CaCl2 đều có ảnh hưởng đến hiệu suất cố định nấm men trong hạt gel và khả năng lên men của nấm men cố định. Khoảng khảo sát của các yếu tố này được chọn dựa trên kết quả của những công bố khoa học của các tác giả trong và ngoài nước [21], [177], [182].

Yếu tố thay đổi: tiến hành 3 loạt thí nghiệm để thay đổi lần lượt 3 yếu tố của quá trình cố định nấm men trong gel Ca alginate (bảng 2.2).

Thông số khảo sát: hiệu suất cố định tế bào nấm men trong gel Ca alginate, hoạt tính lên men của tế bào cố định (thời gian lên men, hàm lượng ethanol trong rượu vang non), độ bền hạt gel (độ cứng hạt gel, tỷ lệ thoát bào, tỷ lệ hạt vỡ).

Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng các yếu tố đến hiệu quả cố định nấm men trong gel Ca alginate

TN Yếu tố thay đổi Yếu tố cố định