Nhìn chung, so với nấm men tự do thì nấm men cố định trên cả hai chất mang là cellulose vi khuẩn và alginate tạo ester với hàm lượng cao hơn. Theo Bardi (1997), việc cố định nấm men lên chất mang đã làm tăng hoạt tính của các enzyme acetyl- transferase, từ đó làm tăng quá trình tổng hợp ester [69]. Ngoài ra, kết quả trên bảng 3.31 còn cho thấy nấm men cố định tạo thành ít acetaldehyde, ít rượu cao phân tư và ít methanol hơn so với nấm men tự do.
Như chúng ta đã biết, ethyl ester, đặc biệt là ethyl acetate đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra hương thơm đặc trưng sản phẩm rượu vang. Ngược lại, rượu cao phân tư như propanol, butanol, iso-amylalcohol và acetaldehyde lại được coi là các yếu tố gây ảnh hưởng không tốt đến mùi vị của sản phẩm. Còn methanol là một hợp chất gây độc cho con người. Hàm lượng methanol thông thường trong rượu vang từ 100 – 200 mg/L [46], [79], [85], [123], [125], [126], [172], [223].
Như vậy, việc sư dụng nấm men cố định trong lên men rượu vang không những làm tăng năng suất lên men mà còn làm cải thiện chất lượng của rượu vang. Chính sự có mặt của chất mang đã làm thay đổi một số đặc điểm về sinh lý và sinh hóa của nấm men theo hướng tích cực trong suốt quá trình lên men và gây ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh tổng hợp các sản phẩm phụ.
Bảng 3.31 còn cho thấy khi hàm lượng đường tăng từ 200 – 280 g/L thì hàm lượng các hợp chất hương trong vang non có xu hướng tăng theo. Cần lưu ý là những thành phần có lợi như ester trong dịch lên men với nấm men cố định thì cao hơn so với dịch lên men với nấm men tự do, trong khi những thành phần acetaldehyde, rượu cao phân tư, methanol lại thấp hơn và không vượt quá những giới hạn gây bất lợi [30], [91], [165], [224]. Một lần nữa, nấm men cố định lại chứng tỏ ưu thế vượt trội của mình khi so với nấm men tự do.
Kết quả về thành phần các chất hương của chúng tôi cũng tương tự như số liệu nghiên cứu của Bardi (1997) và Mallouchos (2003) khi các tác giả này khảo sát sự hình thành các hợp chất hương trong quá trình lên men rượu vang sư dụng nấm men cố định trên chất mang cellulose đã tách lignin và viên gluten [69], [125].
3.4 Khảo sát và so sánh khả năng tái sử dụng nấm men cố định trong gelalginate và trên cellulose vi khuẩn để lên men vang theo phương pháp tĩnh, alginate và trên cellulose vi khuẩn để lên men vang theo phương pháp tĩnh, nhiều chu ky
3.4.1 Khảo sát hiệu quả của giải pháp ngâm hạt gel alginate chứa nấm men cố định trong dung dịch CaCl2 trong quá trình tái sử dụng
3.4.1.1 Thời gian lên men khi tái sử dụng nấm men cố định
Thời gian lên men trong thí nghiệm này được xác định dựa vào độ lên men 97,5%. Bảng 3.52 trình bày sự biến đổi về thời gian lên men của nấm men cố định trong gel alginate trong quá trình tái sư dụng với hai trường hợp không ngâm và có ngâm hạt gel trong dung dịch CaCl2.
Trong trường hợp không ngâm hạt, thời gian lên men từ chu kỳ 1 đến chu kỳ 6 giảm từ 130h xuống 93,4h. Ba chu kỳ 6, 7, 8 có thời gian lên men khác nhau không có nghĩa. Ở các chu kỳ sau đó thì thời gian lên men tăng dần. Còn trong trường hợp có ngâm hạt, thời gian lên men từ chu kỳ 1 đến chu kỳ 7 giảm từ 131,6h xuống 70,21h, sau đó thời gian lên men tăng dần từ chu kỳ 7 đến chu kỳ 12.
Thời gian lên men ở những chu kỳ 2 - 8 giảm so với chu kỳ đầu tiên là do sau một thời gian sư dụng, tế bào nấm men thích nghi dần với điều kiện lên men, do đó pha lag trong quá trình phát triển sinh khối sẽ ngắn hơn. Agrawal (1986) khi tái sư dụng nấm
men cố định trong gel alginate để lên men ethanol từ dịch glucose đều đã nhận thấy hiện tượng trên [104].
Bảng 3.40 Thời gian lên men (h) của nấm men cố định trong gel alginate trong quá trình tái sư dụng
Chu kỳ Nấm men cố định Nấm men tự do
Không ngâm hạt sau mỗi
chu kỳ Có ngâm hạt sau mỗichu kỳ
1 130,00s ± 0,69 130,60s ± 1,10 140,00t ± 1,12 2 118,27r ± 0,46 115,60q ± 0,40 3 107,20m ± 0,69 102,13k ± 1,22 4 100,87i ± 0,75 93,93f ± 0,81 5 95,60g ± 0,69 85,20d ± 0,00 6 93,40f ± 0,69 76,00b ± 0,69 7 94,13f ± 0,61 70,27a ± 1,10 8 94,40f ± 0,40 75,13b ± 0,70 9 96,07g ± 0,70 83,93c ± 0,31 10 98,93h ± 0,11 91,60e ± 0,60 11 105,60m ± 0,69 98,00h ± 1,06 12 113,93p ± 1,01 107,87n ± 0,61
Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P < 0,05)
Thêm vào đó, số lượng tế bào nấm men tích lũy trong hạt gel ngày càng cao, làm cho tỷ lệ giống cấy sẽ tăng dần trong các chu kỳ đầu của quá trình tái sư dụng, từ đó làm tăng tốc độ sư dụng cơ chất của nấm men cố định, rút ngắn thời gian lên men.
Ở những chu kỳ 9 -12, thời gian lên men tăng dần trong cả hai trường hợp không ngâm hạt và có ngâm hạt là do các tế bào nấm men cố định sau một khoảng thời gian lên men sẽ bị giảm dần hoạt tính. Thời gian lên men của nấm men cố định ở chu kỳ 12 đã xấp xỉ với chu kỳ 2. Kourkoutas (2001, 2006) nghiên cứu lên men dịch nho với nấm men cố định trên những miếng táo và cũng ghi nhận được là thời gian lên men giảm từ chu kỳ 1 đến chu kỳ 15 rồi tăng rất nhanh từ chu kỳ 16 đến chu kỳ 30 [27], [78].
Khi so sánh với quá trình lên men tĩnh bằng nấm men tự do, thời gian lên men của nấm men cố định luôn ngắn hơn ở cả hai trường hợp không ngâm và có ngâm hạt. Ngay cả ở chu kỳ 12, khi hoạt tính nấm men cố định đã giảm, thời gian lên men là 107,9h đối với trường hợp có ngâm và 113,9h đối với trường hợp không ngâm, vẫn thấp hơn so với mẫu sư dụng nấm men tự do có thời gian lên men là 140h. Đó là do các tế bào cố định có hoạt tính cao hơn tế bào tự do, hoạt tính được duy trì ổn định qua các thế hệ nhờ chất mang bảo vệ tế bào khỏi những điều kiện bất lợi từ môi trường.
Khi so sánh từng chu kỳ giữa hai trường hợp không ngâm và có ngâm hạt, thời gian lên men của trường hợp có ngâm hạt luôn ngắn hơn trường hợp không ngâm và
Ở trường hợp có ngâm, do hạt gel có trải qua quá trình làm bền hạt trong dung dịch CaCl2 nên nồng độ ion Ca2+ trong hạt gel ổn định, từ đó làm ổn định cấu trúc cũng như đường kính mao quản trong hạt gel. Điều này ngăn cản tế bào nấm men thoát ra cấu trúc gel và chất mang đã bảo vệ tế bào khỏi các điều kiện bất lợi từ môi trường xung quanh tốt hơn.
Ở trường hợp không ngâm, đường kính mao quản của hạt gel sẽ tăng dần trong quá trình tái sư dụng sẽ làm cho tế bào thoát ra khỏi cấu trúc gel và phát triển như những tế bào tự do trong canh trường. Các tác giả như Galazzo (1990), Ciani (1995), Balli (2003) cho rằng tế bào nấm men phát triển ở bên ngoài chất mang có khả năng chống chịu những điều kiện bất lợi kém hơn cũng như hiệu quả lên men sẽ thấp hơn so với các tế bào được bảo vệ bên trong chất mang, từ đó làm cho thời gian lên men kéo dài [67], [104], [225]. Việc tế bào bị thoát ra ngoài cấu trúc gel sẽ làm cho mật độ giống cấy thấp hơn trong quá trình tái sư dụng nấm men cố định khi so sánh với trường hợp có ngâm hạt gel trong dung dịch CaCl2. Cấu trúc hạt gel lỏng lẻo làm cho khả năng bảo vệ tế bào bên trong chất mang không còn tốt nữa, hoạt tính nấm men giảm, thời gian lên men kéo dài.
Đã có rất nhiều nghiên cứu tái sư dụng nấm men trong gel alginate, tuy nhiên, chưa có tác giả nào thực hiện giải pháp ngâm hạt gel trong dung dịch CaCl2 sau mỗi chu kỳ tái sư dụng khi lên men tĩnh.
3.4.1.2 Tỷ lệ nấm men thoát ra khỏi hạt gel alginate khi tái sử dụng nấm men cố định
Khi không ngâm hạt gel, tỷ lệ tế bào nấm men thoát ra khỏi hạt gel luôn lớn hơn khoảng 20% so với tổng số tế bào trong dịch lên men. Khi có ngâm hạt gel, tỷ lệ trên có giá trị từ 9,1% (chu kỳ 4) đến 18,8 % (chu kỳ 1 và 10) (Hình 3.42). Tế bào nấm men cố định sinh khí CO2 và đây là nguyên nhân chính làm tăng đường kính mao quản của hạt gel, gây nên hiện tượng thoát bào. Khi hạt gel được ngâm trong dung dịch CaCl2 sau mỗi chu kỳ lên men thì số tế bào thoát ra ngoài hạt gel sẽ ít hơn hẳn.
Hình 3.23. Tỷ lệ nấm men thoát ra khỏi hạt gel alginate so với tổng số nấm men trong dịch lên men qua các chu kỳ tái sư dụng
Một lượng nhỏ tế bào tự do (vài triệu tb/mL) còn lại trong canh trường vào cuối quá trình lên men là cần thiết cho quá trình ủ rượu vang sau khi đã tách các tế bào cố định để tái sư dụng cho chu kỳ lên men tiếp theo. Tuy nhiên nếu lượng nấm men thoát ra ngoài chất mang quá nhiều sẽ ảnh hưởng đến chi phí tách nấm men, thời gian và hiệu quả kinh tế của quy trình sản xuất. Bên cạnh đó, khi ứng dụng vào quy trình liên tục, việc tế bào bị thoát ra khỏi chất mang quá nhiều sẽ làm cho năng suất thiết bị giảm do làm giảm đi mật độ tế bào cố định bên trong hệ thống lên men.
Hình 3.24. Hình chụp SEM hạt gel alginate chứa nấm men cố định trước khi lên men chu kỳ 1
(trái-bề mặt hạt gel alginate; phải-mặt cắt hạt gel alginate) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.25. Hình chụp SEM hạt gel alginate chứa nấm men cố định trong trường hợp không ngâm hạt trong dung dịch CaCl2 trước khi lên men chu kỳ 7
Hình 3.26. Hình chụp SEM hạt gel alginate chứa nấm men cố định trong trường hợp có ngâm trong dung dịch CaCl2 trước khi lên men chu kỳ 7
(trái-bề mặt hạt gel alginate; phải-mặt cắt hạt gel alginate)
Các hình 3.43, 3.44 và 3.45 cho thấy mật độ tế bào trên và trong hạt gel vào đầu chu kỳ 7 cao hơn rất nhiều so với đầu chu kỳ 1 do sự tăng sinh khối của nấm men qua các chu kỳ. Ngoài ra, mật độ nấm men trong trường hợp có ngâm hạt dày đặc hơn trường hợp không ngâm hạt. Ở cả hai trường hợp, một số tế bào cả ở trên bề mặt lẫn bên trong hạt gel bị móp méo.
Melzoch (1994) khảo sát sự thay đổi hình thái tế bào nấm men cố định trong gel alginate dưới kính hiển vi điện tư và cũng nhận thấy rằng hình dạng và kích thước tế bào nấm men là không đồng đều [103]. Điều đó chứng tỏ sự phát triển của các tế bào bị nhốt trong hạt gel phụ thuộc vào độ xốp và cấu trúc của mạng gel cũng như khả năng chiếm chỗ trống trong hạt gel nấm men. Ở bên trong chất mang, các tế bào nấm men có xu hướng kết tụ lại với nhau.
3.4.1.3 Khả năng sinh tổng hợp ethanol của nấm men cố định trong gel alginate khi tái sử dụng
Với trường hợp có ngâm hạt, tốc độ trung bình sinh tổng hợp ethanol của nấm men cố định cao hơn 15% so với trường hợp không ngâm hạt (Bảng 3.33 và Hình 3.22). Điều này phù hợp với bảng 3.52, nấm men cố định trong trường hợp có ngâm hạt sẽ có thời gian lên men ngắn hơn.
Bảng 3.41. Hàm lượng ethanol trong vang non (%v/v) sau mỗi chu kì lên men của nấm men cố định trong gel alginate
Chu kỳ Nấm men cố định Nấm men tự do
Không ngâm hạt sau mỗi
chu kỳ Có ngâm hạt sau mỗi chukỳ
2 9,76c ± 0,03 9,92ef ± 0,033 9,86cde ± 0,03 9,96f ± 0,03 3 9,86cde ± 0,03 9,96f ± 0,03 4 10,05fg ± 0,04 10,35ij ± 0,04 5 10,11fg ± 0,02 10,46l ± 0,01 6 10,39jkl ± 0,23 10,74mn ± 0,19 7 10,31ij ± 0,01 10,76mn ± 0,04 8 10,21i ± 0,03 10,65m ± 0,03 9 10,41jkl ± 0,04 10,74mn ± 0,04 10 10,45kl ± 0,03 10,81n ± 0,02 11 9,24b ± 0,05 10,12gh ± 0,03 12 9,12a ± 0,03 10,04fg ± 0,09
Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P < 0,05)
Hình 3.27. Tốc độ sinh tổng hợp ethanol trung bình của nấm men cố định trong gel alginate qua các chu kỳ tái sư dụng
Khi so sánh giữa các chu kỳ tái sư dụng, hàm lượng ethanol trong vang non không thay đổi nhiều; hàm lượng ethanol dao động trong khoảng 9,86 đến 10,81%v/v khi có ngâm hạt và từ 9,12 đến 10,45%v/v khi không có ngâm hạt. Nhìn chung, lượng ethanol trong vang non trong trường hợp có ngâm hạt là tương đương hoặc cao hơn trường hợp không ngâm hạt và mẫu đối chứng.
Kết quả này một lần nữa khẳng định là quá trình ngâm trong dung dịch CaCl2 giúp cho hạt gel có cấu trúc chặt chẽ hơn, bảo vệ tế bào nấm men tốt hơn khỏi những điều kiện bất lợi xung quanh, từ đó ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào qua các chu kì tái sư dụng.
Theo kết quả nghiên cứu của Regina (1988), sự có mặt của ion Ca2+ không chỉ làm ảnh hưởng đến cấu trúc của hạt gel mà còn làm tăng khả năng chịu đựng của nấm men
Saccharomyces cerevisiae đối với ethanol. Ca2+ bảo vệ các phospholipid tích điện âm trong cấu trúc của màng tế bào chất, đồng thời điều hòa sự tương tác giữa lipid- protein. Ca2+ cũng có khả năng hình thành phức chất với phosphate mannan của thành tế bào nấm men, tăng cường sự rắn chắc của thành tế bào, bảo vệ tế bào trước tác động của ethanol cũng như áp suất thẩm thấu từ môi trường xung quanh [226].
3.4.1.4 Sự thay đổi pH của dịch lên men khi tái sử dụng
Trong quá trình tái sư dụng nấm men cố định trong gel alginate, pH của vang non ở cả hai trường hợp có ngâm và không ngâm CaCl2 không chênh lệch nhau nhiều và nằm trong khoảng 3,5 – 4,1. Tuy vậy, trong tất cả chu kỳ tái sư dụng thì pH của vang non ở trường hợp không ngâm là cao hơn trường hợp có ngâm hạt (Hình 3.47). Đó là do mật độ nấm men thoát ra khỏi hạt gel trong trường hợp không ngâm là cao hơn và tỷ lệ tế bào tự do bị chết cũng nhiều hơn, hiện tượng tự phân xảy ra mạnh hơn đã làm tăng pH của vang non.
Lương Đức Phẩm (2005) khi nghiên cứu về nấm men công nghiệp [227]; Kourkoutas (2002) khi lên men vang bằng nấm men cố định trên miếng táo đã khẳng định là khi quá trình tự phân nấm men xảy ra mạnh hơn thì vang non sẽ có pH cao hơn [74]. pH thấp hơn sẽ có tác dụng tích cực trong việc ổn định độ bền vi sinh, độ bền màu đồng thời tạo giá trị cảm quan tốt hơn cho rượu vang thành phẩm.
Kết luận: Giải pháp ngâm hạt gel alginate trong dung dịch CaCl2 sau mỗi chu kỳ lên men sẽ ổn định cấu trúc hạt gel, bảo vệ các tế bào cố định tốt hơn, làm tăng khả năng lên men của nấm men và cải thiện chất lượng vang non thu được.
3.4.2 So sánh khả năng tái sử dụng của nấm men cố định trong gel alginate và trên cellulose vi khuẩn trong quá trình lên men vang theo phương pháp tĩnh, nhiều chu ky
3.4.2.1 Khả năng sinh trưởng của nấm men cố định trong quá trình lên men vang qua các chu kỳ tái sử dụng
Hình 3.29. Sự thay đổi mật độ tế bào trong canh trường sư dụng nấm men cố định ở các chu kỳ tái sư dụng thứ 1, 3, 5, 7, 10
Mật độ nấm men cực đại trong cả hai trường hợp đều tăng dần từ chu kỳ 1 đến chu kỳ 10 (Hình 3.24). Nguyên nhân là sau mỗi chu kỳ lên men, mật độ tế bào cố định trên chất mang tăng lên do sự sinh trưởng của nấm men, từ đó làm cho mật độ nấm men