nghiên cứu bệnh tay chân miệng ở trẻ em bằng áp dụng kỹ thuật real - time rt-pcr

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu) (NGHIÊN CỨU BỆNH TAY CHÂN MIỆNG Ở TRẺ EM BẰNG ÁP DỤNG KỸ THUẬT REAL TIME RT-PCR) CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 7/ 2010 ii MỤC LỤC Trang Mục lục i Danh sách các chữ viết tắt ii Danh sách các bảng iii Danh sách các hình iv Tóm tắt nội dung nghiên cứu (gồm phần tiếng Việt và tiếng Anh) v PHẦN MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 3 1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 3 CHƢƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 6 2.1. Nội dung 1 6 2.2. Nội dung 2 – 6 10 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 13 3.1. Nội dung 1: Xác định tác nhân gây BTCM do EV71 bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR 13 3.2 Nội dung 2: Đặc điểm dân số học và biểu hiện lâm sàng của BTCM ở trẻ em 17 3.2.1. Đặc điểm dân số học 17 3.2.2. Triệu chứng lâm sàng 19 3.2.3 Tỷ lệ biến chứng và các loại biến chứng 23 3.3. Nội dung 3: Yếu tố tiên lượng lâm sàng – cận lâm sàng về khả năng gây biến chứng 24 3.3.1. Mối tương quan giữa các đặc điểm dân số học với sự xuất hiện biến chứng trong BTCM 24 3.3.2. Mối tương quan giữa các triệu chứng lâm sàng với sự xuất hiện biến chứng trong BTCM 24 3.3.3 Mối tương quan giữa các dấu hiệu cận lâm sàng với sự xuất hiện biến chứng trong BTCM 28 3.4. Nội dung 4: Thực hiện xét nghiệm PCR trên các mẫu bệnh phẩm 29 3.5 Nội dung 5: Phân tích tỉ lệ bệnh nhân dương tính với EV71 theo thời gian 30 3.6 Nội dung 6: Phân tích nồng độ vi rút trong bệnh phẩm 31 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 PHỤ LỤC: Các hình và biểu đồ 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHIẾU THU THẬP DỮ LIỆU NGHIÊN CỨU DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT BVNĐ1 Bệnh Viện Nhi Đồng 1 BTCM Bệnh tay chân miệng CA16 Cosxakie A16 CSF Ceberalspino fluid (Dịch não tủy) Ct Threshold Cycle (Chu kỳ ngưỡng) CV Coefficient of Variation (Hệ số biến thiên) DNT Dịch não tủy EV Enterovirus (vi rút đường ruột) EV71 Enterovirus 71 EV non-71 Enterovirus khác 71 NĐVR Nồng độ vi rút NHRI National Health Research Institute (Viện Nghiên cứu Sức khỏe Quốc gia Đài Loan - Trung Quốc) PBN Phết bóng nước PCR Polymerase Chain Reation (Phản ứng khuếch đại chuỗi gen) PH Phết họng PTT Phết trực tràng Real-time RT- PCR Phản ứng khuếch đại chuỗi gen với men sao chép ngược thời gian thực RT-PCR Reverse Transcriptae Polymerase Chain Reation (Phản ứng khuếch đại chuỗi gen với men sao chép ngược) TPHCM Thành phố Hồ Chí Minh iv DANH SÁCH CÁC BẢNG SỐ LIỆU Bảng số Tên bảng số liệu trang 1 Độ lập lại của chu kỳ ngưỡng (Ct) ứng với các nồng độ chuẩn trong 3 lần chạy liên tiếp của phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes phát hiện và định lượng EV71 14 2 Dữ liệu của đường cong chuẩn với FAM-490 (Ct) 14 3 Sự biến thiên trong một lần phản ứng của phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes phát hiện và định lượng EV71 14 4 Sự biến thiên giữa các lần khác nhau của phản ứng Real- Time PCR Taqman phát hiện và định lượng EV71 14 5 Phân bố BTCM theo địa phương 18 6 Triệu chứng khởi phát trong BTCM 19 7 Triệu chứng được quan tâm của gia đình đưa trẻ vào viện 21 8 Đặc điểm lâm sàng BTCM do EV71 và EV non-71 22 9 Biến chứng của BTCM 23 10 Mối tương quan giữa các đặc điểm dân số học và biến chứng 24 11 Các yếu tố nguy cơ biến chứng chung 25 12 Các yếu tố nguy cơ biến chứng nặng 26 13 Phân tích liên quan tình trạng dinh dưỡng trẻ và biến chứng 26 14 Các yếu tố nguy cơ tử vong 27 15 Kết quả xét nghiệm EV, EV71 của các mẫu bệnh phẩm 29 16 So sánh nồng độ vi rút giữa nhóm có biến chứng và không biến chứng 31 v DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH Hình số Tên hình ảnh trang 1 Chu kỳ ngưỡng của hệ thống mẫu chuẩn pha loãng có nồng độ từ 10 2 copies cho tới 10 5 copies/ml trong phản ứng Realtime- PCR với Taqman probes trong định 13 2 Đường cong chuẩn của Real-Time PCR với Taqman Probes định lượng EV-RNA 13 3 Độ lập lại của 4 lần chạy của cùng một mẫu trong cùng một đĩa 15 4 Hình ảnh khuếch đại của EV71-RNA trong các mẫu thử khi thực hiện Realtime-PCR Taqman Probes 15 5 Đường cong chuẩn của Realtime-PCR Taqman Probe định lượng EV71-RNA 15 6 Phân bố tuổi theo tháng 17 7 Ngày khởi phát của các triệu chứng sốt, thở nhanh và biến chứng viêm màng não, viêm não 20 8 Phân bố ngày đến khám đầu tiên 21 9 Tương quan giữa tỷ lệ EV71 và BTCM, biến chứng theo thời gian 30 vi TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Đặt vấn đề: Với tình hình diễn tiến phức tạp của Bệnh tay chân miệng (BTCM) trong những năm gần đây cả về mặt dịch tễ cũng như lâm sàng, nhu cầu áp dụng một kỹ thuật giúp chẩn đoán xác định tác nhân gây bệnh nhanh hơn, giúp xử trí sớm hơn, đồng thời dự báo sớm khuynh hướng của dịch BTCM nhằm có biện pháp khống chế thích hợp là rất cấp thiết. Do đó, nhóm nghiên cứu đã áp dụng kỹ thuật Real-time RT- PCR để nghiên cứu sâu về BTCM ở trẻ em. Mục tiêu nghiên cứu: Mục tiêu tổng quát: Xác định tác nhân gây bệnh (Enterovius 71 và Enterovirus non-71) bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR, tiên lượng độ nặng và ứng dụng để dự báo dịch trong BTCM ở trẻ em. Mục tiêu chuyên biệt: 1. Xác định tác nhân gây bệnh tay chân miệng do Enterovirus 71 và Enterovirus non-71 bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR; 2. Mô tả đặc điểm dân số học và biểu hiện lâm sàng BTCM do enterovirus; 3. Xác định yếu tố tiên lượng biến chứng (lâm sàng, cận lâm sàng) Phƣơng pháp nghiên cứu: áp dụng thiết kế mô tả tiến cứu, chọn mẫu ngẫu nhiên hệ thống với đối tượng nghiên cứu là tất cả các bệnh nhi đến khám hay nhập viện tại Bệnh Viện Nhi Đồng 1 có chẩn đoán BTCM trên lâm sàng. Quy trình thực hiện xét nghiệm 3 bước kết hợp kỹ thuật RT- PCR và Realtime RT- PCR được áp dụng để định danh tác nhân gây BTCM và định lượng nồng độ vi rút trong các bệnh phẩm phết họng, phết trực tràng, dịch não tủy và bóng nước. Các đặc điểm dân số, triệu chứng lâm sàng và đặc điểm cận lâm sàng, kết quả phân tích sinh học phân tử được thu thập để tìm hiểu đặc điểm lâm sàng của BTCM và các yếu tố tiên lượng biến chứng. Kết quả: Từ 449 bệnh nhi BTCM đưa vào nhóm nghiên cứu chúng tôi có được 419 (93,3%) trường hợp chẩn đoán dương tính với EV qua thử nghiệm PCR. Trong đó, mẫu bệnh phẩm phết họng cho kết quả dương tính cao nhất với 84,5% các trường hợp. BTCM là một bệnh lưu hành ở khu vực phía Nam, thường gặp ở trẻ dưới 36 tháng. Đây là một bệnh cấp tính; biểu hiện lâm sàng điển hình với các triệu chứng sốt, phát ban dạng sẩn hay bóng nước ở các vị trí đặc hiệu, loét miệng và giật mình; giúp chẩn đoán chính xác trên 90%. Biến chứng có thể xuất hiện rất sớm ngay từ ngày đầu tiên, vii mức độ biến chứng thay đổi từ nhẹ đến rất nặng nhưng tỉ lệ biến chứng rất cao đến 47,7%. Những biến chứng thường gặp là viêm màng não vô trùng (36,8%), viêm não (9,1%), yếu liệt chi (8,4%), co giật (6%). Các trường hợp biến chứng nặng như viêm não, phù phổi, viêm cơ tim chiếm 10%. Tử vong chung chiếm 1,4% trong toàn lô nghiên cứu; 3% trong các ca có biến chứng và 10,9 % trong các ca có biến chứng nặng. Dựa trên các đặc điểm dân số học, các trẻ tử vong đều dưới 24 tháng. Tuổi của trẻ tử vong nhỏ hơn trẻ mắc bệnh có biến chứng chung. Các yếu tố: sốt, sốt ≥ 38 o 5C, phát ban ít, giật mình, nôn ói, thở nhanh, nhịp tim nhanh > 150 lần/phút, bạch cầu tăng > 13.000/mm 3 , neutrophile > 7.000/mm 3 , nhiễm EV71 có liên quan có ý nghĩa thống kê với sự xuất hiện biến chứng. Các yếu tố như sốt trên 38 o 5C, phát ban ít, thở nhanh, nhịp tim nhanh > 150 lần / phút, bạch cầu tăng > 16.000 /mm 3 có giá trị trong tiên lượng biến chứng nặng (viêm não, phù phổi cấp, viêm cơ tim). Các yếu tố: nhịp tim nhanh > 150 lần / phút, lactate trong DNT > 2,5 mmol/L, hôn mê, sốc, phù phổi hoặc biến chứng viêm não có giá trị trong tiên lượng tử vong. Phân tích về sinh học phân tử, nồng độ vi rút trong mẫu bệnh phẩm phết họng, phết trực tràng, DNT được lấy ở từ ngày 2-4 của bệnh chưa thấy có mối tương quan rõ ràng với khả năng gây biến chứng của EV71. Sự gia tăng tỉ lệ EV71/EV theo thời gian tương ứng với những cao điểm của BTCM, nhưng chưa thấy tương quan rõ rệt với biến chứng. Kết luận: Nghiên cứu cho thấy kỹ thuật định lượng EV71 bằng phương pháp Realtime-PCR Taqman Probes trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm có có tính đồng nhất, ổn định cao. Dựa vào kết quả vi sinh được xác định bằng phương pháp RT-PCR và Realtime RT-PCR, nhóm nghiên cứu đã nhận định được đặc điểm lâm sàng – cận lâm sàng của các bệnh nhi BTCM do EV71 và do nhóm EV khác EV71. Nhóm nghiên cứu cũng đã đưa ra được những yếu tố tiên lượng về dân số học, lâm sàng và cận lâm sàng trong BTCM ở trẻ em. viii SUMMARY OF RESEARCH CONTENT Background: Because of the complicated progress of the epidemic of hand foot mouth disease (HFMD) in recent years, in both clinical and epidemiological area, it is vital to find a technology which can help identify accurately the etiology of the disease and based on that the patients may have timing effective treatment as well as the potential outbreak may be detected and controlled at the early stage. For this reason, the study group has focused on applying Real-time RT-PCR to study in-depth the hand foot mouth disease in children. Research objectives: Overall objective: Identify the etiology of the disease (Enterovius 71 versus Enterovirus non-71) with the application of Real-time RT-PCR; study risk factors of the disease for prognosis purposes; and learn the factors which can anticipate the outbreak of the disease. Specific objectives: 1. Identify the etiology of the disease (Enterovius 71 versus Enterovirus non-71) with the application of Real-time RT-PCR; 2. Describe the demographic characters and clinical manifestations of HFMD induced by enterovirus; 3. Study the risk factors for prognosis of complications. Study methods: the study applied prospective case-series design and systematically random sampling method upon the study objects including all children clinically diagnosed with HFMD in both outpatient and inpatient of Children’s Hospital 1. Three – step RT-PCR process, including both conventional PCR and real-time PCR, was employed to identify the presence of EV, EV71 and its viral concentration in collected specimens such as throat swab, rectal swab, cerebrospinal fluid (CSF), and vesicles. Demographic characters, clinical signs and symptoms, investigational signs, and molecular analysis results were collected to learn the complications in HFMD in children. Results: Among 449 children will HFMD enrolled in the study, 419 (93.3%) were positive on RT-PCR with EV presence in at least one specimen (throat swab, rectal swab, CSF, or vesicle). Among them, throat swab was most sensitive (84.5%). HFMD ix is endemic in the South of Vietnam, mostly among children less than 36 months of age. It is an acute disease, typically manifesting with fever, site-specific rashes, mouth ulcers, sleep disturbance and myoclonic jerks. These typical signs and symptoms help diagnose accurately HFMD in 90% of the cases. Complications may appear very early since the first day of the disease course. Complications vary from mild to very severe with the overall prevalence of 47.7%. Common complications include aseptic meningitis (36.8%), encephalitis (9.1%), acute paralysis (8.4%) and convulsion (6%). Severe complications such as encephalitis, pulmonary edema and myocarditis are present in 10% of the cases. The overall mortality rate is 1.4% in total, 3% among the cases with complications and 10.9 % among the cases with severe complications. In the study, all deaths were under 24 months of age. The average age among deaths is less than that among children with complications. The factors such as fever, fever ≥ 38 o 5C, myoclonic jerks, a few rashs, vomiting, tachycardia, tachypnea, white blood count above 13,000 per cubic milimetre, neutrophile above 7,000 per cubic milimetre, EV71 infection are significantly associated with the presence of complications; factors such as fever ≥ 38 o 5C, a few rashes, myoclonic jerk, tachycardia, tachypnea, white blood count above 16,000 per cubic milimetre among the cases with severe complications such as encephalitis, pulmonary edema and myocarditis; while factors including coma, shock, tachycardia, tachypnea, encephalitis, acute pulmonary oedema and lactate in CSF above 2.5 mmol/l are significantly associated with death. In biomolecular analysis, there is no evidence that show the association between the viral concentration in study specimens such as throat swab, rectal swab, CSF and vesicle, which were collected from day 2 to day 4 of the disease course, and EV71-induced complications. The rate of EV71/EV was increased in accordance with the peak of the diseases during the years but not significantly associated with the increase of complication rate. Conclusion: The study had shown the application of Realtime-PCR Taqman Probes directly on collecyed specimens to indentify EV71 and quantify its concentration was sensitive and stable. Based on the microbiological analysis from RT-PCR and Realtime RT-PCR, the study had determined the clinical manifestations of EV71 and non-EV71 – induced HFMD in children. The study had also indentified the potential risk factors asssocitaed with the presence of complications in HFMD in children. 1 PHẦN MỞ ĐẦU 1. Tên đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu bệnh tay chân miệng ở trẻ em bằng áp dụng kỹ thuật Real-time RT-PCR” Chủ nhiệm đề tài: Ths BS Tăng Chí Thượng Cơ quan chủ trì: Bệnh viện Nhi Đồng 1 Thời gian thực hiện: từ tháng 10/2007 đến tháng 4/2009 (đã được chấp thuận gia hạn đến tháng 12/2009) Kinh phí được duyệt: 450.000.000 đồng Kinh phí đã cấp: 280 triệu theo TB 158/TB-SKHCN ngày 25/9/2007 và 125 triệu theo TB 182/TB-SKHCN ngày 12/10/2009 2. Mục tiêu nghiên cứu: Mục tiêu tổng quát: Xác định tác nhân gây bệnh (Enterovius 71 và Enterovirus non-71) bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR, tiên lượng độ nặng và ứng dụng để dự báo dịch trong BTCM ở trẻ em. Mục tiêu chuyên biệt: Xác định tác nhân gây BTCM do Enterovirus 71 và Enterovirus non-71 bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR; Mô tả đặc điểm dân số học và biểu hiện lâm sàng BTCM do enterovirus; Xác định yếu tố tiên lượng biến chứng (lâm sàng, cận lâm sàng) 3. Nội dung nghiên cứu: Chẩn đoán xác định nhiễm Enterovirus bằng qui trình kỹ thuật PCR qua 3 bước: Xác định Enterovirus, xác định EV71 (bằng RT-PCR), định lượng nồng độ siêu vi EV71 bằng Real-time RT-PCR với đoạn mồi (primer) EV. Mô tả đặc điểm dân số học và biểu hiện lâm sàng của BTCM ở trẻ em. So sánh giữa nhóm có và không có biến chứng để tìm yếu tố tiên lượng lâm sàng – cận lâm sàng về khả năng gây biến chứng, nhờ đó có thể chẩn đoán và điều trị đặc hiệu sớm. Phân tích tỉ lệ dương tính đối với từng loại mẫu bệnh phẩm nhằm đưa ra các khuyến cáo phục vụ công tác chẩn đoán bệnh và điều trị. [...]... thực hiện Real- time RT-PCR (sử dụng đoạn mồi Enterovirus chung, không sử dụng đoạn mồi đặc hiệu EV 71 để có độ nhạy cảm cao hơn) 12 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Nội dung 1: Xác định tác nhân gây BTCM do EV71 bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR Định chuẩn xét nghiệm Real- time RT-PCR Qui trình chẩn đoán EV71 ba bước gồm 2 phản ứng RT-PCR kết hợp với 1 phản ứng Real- time PCR đã được nghiên cứu chứng... chuẩn loại trừ: o Gia đình bệnh nhi không đồng ý tham gia nghiên cứu o Tổn thương da do vi trùng Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu mô tả tiến cứu Điểm nghiên cứu: tại BVNĐ1 - TP HCM Thời gian chọn ca bệnh vào nhóm nghiên cứu: tháng 4/2007 đến tháng 3/2008 Ƣớc tính cỡ mẫu: - Dựa trên kết quả nghiên cứu thử nghiệm tại BVNĐ1, tỉ lệ phát hiện EV bằng RT-PCR là 67% - Kết quả nghiên cứu hợp tác giữa BVNĐ1 và... triển của kỹ thuật Real- time RT-PCR có thể rút ngắn thời gian trả kết quả nhanh hơn nữa so với RT-PCR cổ điển (2 giờ so với 10 giờ) Các nghiên cứu tại Đài loan và Singapore [12], [17] cho thấy Real- time RT-PCR có độ nhạy cảm và đặc hiệu 4 cao hơn rất nhiều so với RT-PCR nên áp ứng cả nhu cầu điều trị và nghiên cứu khi so sánh với phân lập siêu vi và định danh bằng phản ứng trung hòa Trên cơ sở đó, chúng... xác định EV bằng RT-PCR với đoạn mồi EV (bước 1), nếu dương tính sẽ thực hiện tiếp bước 2 bằng phản ứng RT-PCR với đoạn mồi EV71, trường hợp bước 2 có phản ứng dương tính sẽ thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR với đoạn mồi EV để xác định nồng độ vi rút trong mẫu bệnh phẩm Định tính EV-RNA và EV71-RNA bằng kỹ thuật RT-PCR: Hai cặp mồi đặc hiệu cho EV (EV-F và EV-R) và EV71 (F-primer1705 và R-primer 2036)... và 331bp do NHRI cung cấp Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong các phản ứng PCR như sau: EV-F: 5'-CCCCTGAATGCGGCTAATC-3' EV-R: 5'-GATTGTCACCATAAGCAGC-3' F-primer1705: 5'-GTGGCAGATGTGATTGAGAG-3' R-primer 2036: 5'-GTTATGTCTATGTCCCAGTT-3' Sử dụng cặp mồi EV-F và EV-R trong phản ứng RT-PCR đầu tiên bằng bộ thuốc thử One-Step RT-PCT (Qiagen, USA) Phương pháp khuếch đại định tính EV được thực hiện trong những... CV (%) 7,79 x 10 7 0,25 3,1 Phản ứng Real- time RT-PCR được xem là chính xác khi có sự tương đồng với kết quả của phản ứng RT-PCR định tính đối với EV71 Phản ứng Real- time RT-PCR sử dụng đoạn mồi EV có độ chính xác tốt bắt buột phải dương tính nếu phản ứng RT-PCR trên mẫu thử trước đó dương tính với EV71 và ngược lại Để nghiên cứu độ chính xác của phản ứng Realtime-PCR Taqman Hình 3: Độ lập lại của 4... = 125 x n (bệnh tay chân miệng) = 400 Các bệnh phẩm đƣợc thu thập trong nghiên cứu để thực hiện xét nghiệm PCR: - Phết trực tràng : bằng 1-2 que và cho ngay vào môi trường chuyên chở vi rút - Phết họng : 1- 2 que rồi cho vào môi trường chuyên chở vi rút - Phết bóng nước còn tươi và cho vào môi trường chuyên chở vi rút - DNT: 1-2 ml DNT được cho vào môi trường chuyên chở vi rút 11 Tất cả bệnh nhân được... chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mong muốn bằng kỷ thuật Real- time RT-PCR sẽ giúp chẩn đoán xác định tác nhân gây BTCM sớm, giúp xử trí bệnh sớm hơn, đồng thời dự báo dịch sớm để có biện pháp khống chế dịch bệnh kịp thời Nghiên cứu này nhằm giải áp 2 giả thuyết chính : - Sự gia tăng tỉ lệ bệnh nhân dương tính với EV71 có liên quan với cao điểm dịch BTCM, nhờ đó có thể ứng dụng tỉ lệ này để dự... Realtime-PCR Taqman Probes với hệ thống mẫu chuẩn này pha loãng có nồng độ EV-RNA từ 102 copies cho tới 105 copies/ml Hình 1: Chu kỳ ngưỡng của hệ thống mẫu chuẩn pha loãng có nồng độ từ 102 copies cho tới 105 copies/phản ứng trong phản ứng Realtime-PCR với Taqman probes trong định lượng EV-RNA Hình 2: Đường cong chuẩn của Real- Time PCR với Taqman Probes định lượng EV-RNA Từ kết quả phản ứng Real- time. .. dung thứ 2 đến nội dung 6: Đối tƣợng nghiên cứu: - Tất cả bệnh đến khám hay nhập viện tại bệnh viện nhi đồng 1 có chẩn đoán lâm sàng BTCM Định nghĩa ca bệnh: - BTCM: có một trong các dấu hiệu sau o Sang thương điển hình ở miệng: vết loét đỏ hay bóng nước đường kính 2-3 mm ở vòm khẩu cái, niêm mạc má, nướu, lưỡi o Bóng nước có kích thước 2-1 0 mm ở lòng bàn tay, bàn chân, gối, mông có tính chất: hình bầu . PHẦN MỞ ĐẦU 1. Tên đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu bệnh tay chân miệng ở trẻ em bằng áp dụng kỹ thuật Real- time RT-PCR Chủ nhiệm đề tài: Ths BS Tăng Chí Thượng Cơ quan chủ trì: Bệnh viện. Real- time RT- PCR để nghiên cứu sâu về BTCM ở trẻ em. Mục tiêu nghiên cứu: Mục tiêu tổng quát: Xác định tác nhân gây bệnh (Enterovius 71 và Enterovirus non-71) bằng kỹ thuật Real- time RT-PCR, . và ứng dụng để dự báo dịch trong BTCM ở trẻ em. Mục tiêu chuyên biệt: 1. Xác định tác nhân gây bệnh tay chân miệng do Enterovirus 71 và Enterovirus non-71 bằng kỹ thuật Real- time RT-PCR; 2.