Tìm hiểu các kiểu đột biến liên quan đến sự kháng fluoroquinolone ở vi khuẩn lao và xác định nhanh vi khuẩn lao kháng fluoroquinolone bằng kỹ thuật real time pcr thông qua đột biến gene gyr

Các thuốc này đều đã qua các đánh giá trên lâm sàng và là các loại thuốc được sử dụng trong phác đồ điều trị lao phổ biến nhất hiện nay 2HRZE/4HR 44.. Một số loại thuốc khác có thể có t

1.1 Bệnh lao

Bệnh lao là bệnh truyền nhiễm gây ra bởi tác nhân gây bệnh thuộc phức hợp

Mycobacterium tuberculosis, bao gồm: vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis), Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum và Mycobacterium microti (22) Để

xác định chính xác một ca lao, một trong những tác nhân trên phải được phân lập từ cơ quan hay các cơ quan bị nhiễm Tuy nhiên, việc định nghĩa một ca lao lại phụ thuộc vào mức độ chính xác của chẩn đoán và có thể khác nhau tùy theo từng quốc gia Ở Việt Nam, việc chẩn đoán bệnh lao được thực hiện theo hướng dẫn của tổ chức Y tế thế giới (WHO) và Bộ Y tế Việt Nam

1.1.1 Tình hình bệnh lao trên Thế giới và Việt Nam

Bệnh lao là bệnh phổ biến và có tỷ lệ tử vong cao trên toàn thế giới, đặc biệt là

ở Châu Á và Châu Phi WHO ước tính có 9,2 triệu ca lao mới phát hiện (incidence, 139/100.000 dân/năm) trong năm 2006, trong đó, bao gồm 4,1 triệu (44% tổng số ca lao mới phát hiện) ca smear-dương mới (new smear-positive cases) và 0,7 triệu ca

HIV-dương tính (chiếm 8% tổng số) (68) Hình 1.1 trình bày tỷ lệ các ca lao mới phát

hiện trên toàn cầu theo số liệu thu nhận từ năm 2007

Hình 1.1 Tỷ lệ các ca lao mới phát hiện trên toàn cầu năm 2007 (67)

Cũng theo số liệu năm 2006, số ca lao lưu hành trên thế giới ước tính khoảng 14,4 triệu ca và có 1,7 triệu ca tử vong do lao trên toàn cầu (68) Trong 1,7 triệu ca tử vong thì có 0,2 triệu ca là những bệnh nhân đồng nhiễm HIV Ngoài ra, có khoảng 0,5 triệu ca lao đa kháng thuốc (multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB) được ước tính dựa trên số liệu từ 202 quốc gia và các vùng lãnh thổ năm 2006 (68)

Việt Nam xếp hạng thứ 12 trong 22 nước có dịch tễ lao cao theo báo cáo của WHO năm 2008 (68) Theo đó, tỷ lệ lao mới ở Việt Nam ước tính là 173/100.000 dân/năm; tỷ lệ lao lưu hành ước tính là 225/100.000 dân/năm; tỷ lệ tử vong do lao ước tính là 23/100.000 dân/năm với dân số là 86.206.000 Tỷ lệ lao đa kháng thuốc ước tính là 2,7% trong các ca lao mới và 19% trong các ca lao tái trị

Tuy nhiên, VOVNews/VNA đưa tin rằng Thứ trưởng bộ Y tế, bác sỹ Nguyễn Thị Xuyến đã phát biểu trong một hội nghị diễn ra tại Hà Nội ngày 16/01/2009 rằng số bệnh nhân lao mới ở Việt Nam thực tế cao hơn ước tính của WHO đến 60%, nghĩa là xấp xỉ 277/100.000 dân/năm

Bên cạnh đó, lao đa kháng thuốc và bệnh lao trong các bệnh nhân HIV cũng đang gia tăng ở Việt Nam (67-69) Đây là thách thức to lớn trong lĩnh vực y tế của nước ta hiện nay

Các yếu tố có thể có ảnh hưởng đến sự biểu hiện của việc nhiễm trùng lao bao gồm: tuổi tác, tình trạng đáp ứng miễn dịch, suy dinh dưỡng, yếu tố di truyền, bệnh cùng tồn tại, chủng ngừa BCG (Bacillus of Calmette and Guérin), độc lực của vi khuẩn, tính đặc hiệu cơ quan của vi khuẩn, các vị trí bệnh (11)

Tiêm chủng với vaccine BCG ở những người có hệ miễn dịch qua tế bào bình thường có thể giúp hạn chế nguy cơ đối với bệnh lao lan tỏa sớm, đặc biệt là ở trẻ em Yếu tố độc lực hay tính hướng đến cơ quan chuyên biệt của vi khuẩn lao có thể gây ảnh hướng đến biểu hiện lâm sàng nhưng chúng chưa được xác định rõ

Một yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện lâm sàng của việc nhiễm trùng lao một cách rõ ràng và quan trọng là vị trí bị bệnh Trước đại dịch HIV, ở Mỹ, khoảng 85% các ca lao được giới hạn trong phổi và 15% các ca lao còn lại có liên quan đến các ca lao ngoài phổi hay kết hợp cả hai (27) Trong các bệnh nhân nhiễm HIV, sự phân bố các tỷ lệ này rất khác biệt, cụ thể là tỷ lệ mắc lao ngoài phổi và lao kết hợp trong-ngoài phổi tăng cao (22)

1.1.2.1 Diễn tiến sau khi tiếp xúc với vi khuẩn lao

Vi khuẩn lao lây chủ yếu qua đường hô hấp Tuy nhiên, chỉ khoảng 30% những người tiếp xúc với vi khuẩn lao bị nhiễm trùng, đây là điều kiện tiên quyết để bị bệnh lao khởi phát hay tiềm ẩn (50)

Sau khi vi khuẩn lao đi vào cơ thể do sự hô hấp trong môi trường có vi khuẩn lao, chúng bị các đại thực bào ở phế nang phổi bắt lấy và phân hủy Tuy nhiên, một số

vi khuẩn lao có thể tồn tại và nhân lên trong các đại thực bào này nhờ vào khả năng ngăn cản sự acid hóa các túi thực bào (phagosome) cũng như là chặn đứng sự dung hợp của phagosome và lysosome của các đại thực bào

Quá trình nhiễm sơ khởi (initial infection) kể trên có thể kéo dài khoảng 2-4 tuần Trong giai đoạn này, đáp ứng miễn dịch của cơ thể có thể không đủ mạnh nên các vi khuẩn lao có thể thoát ra khỏi các đại thực bào bị nhiễm và gây ra một giai đoạn

nhiễm trùng máu chuyển tiếp (transient bacteremia) với các vi khuẩn lao phân tán khắp cơ thể (50) Tuy vậy, bệnh nhân hoàn toàn không có triệu chứng trong cả hai giai đoạn trên

Trong hầu hết các cá thể có hệ miễn dịch bình thường, các tế bào T và đại thực bào sẽ được kêu gọi đến để tạo ra một đáp ứng miễn dịch thứ cấp nhằm kiểm soát sự nhiễm trùng Theo ước tính thì sự nhiễm trùng sẽ được kiểm soát ở khoảng 60% những người bị nhiễm trùng và chỉ khoảng 40% bệnh nhân phát bệnh do đáp ứng miễn dịch thứ cấp trong giai đoạn này không đủ để kiểm soát vi khuẩn lao xâm nhập và phân chia (50)

Những cá thể kiểm soát được nhiễm trùng thì sẽ không bị bệnh lao khởi phát dưới các hình thức lao phổi hay/và lao ngoài phổi Tuy nhiên, trong cơ thể họ thường

có những dấu vết đánh dấu sự nhiễm trùng (dấu vết trên phim Xquang) và có sự tồn tại của trí nhớ miễn dịch dưới dạng phản ứng quá mẫn đối với lao tố (purified protein derivative – PPD) Đây là những bằng chứng của bệnh lao tiềm ẩn

1.1.2.2 Lao tiềm ẩn

Bệnh lao tiềm ẩn (latent tuberculosis) được định nghĩa là một hội chứng lâm sàng xảy ra sau khi bị phơi nhiễm với vi khuẩn lao mà khi sự xâm nhiễm diễn ra thì đáp ứng miễn dịch của cơ thể kiểm soát được vi khuẩn lao và đưa chúng vào tình trạng tiềm tàng (22)

Không giống như bệnh lao đang hoạt động, bệnh lao tiềm ẩn không có các triệu chứng lâm sàng và cũng không có khả năng lây lan cho người khác Bởi vì không có triệu chứng lâm sàng nên bệnh lao tiềm ẩn chỉ được xác định bởi kết quả dương tính với lao tố tiêm dưới da hoặc có vết sẹo chỉ thị bệnh lao cũ trên phim Xquang phổi

Vi khuẩn lao tiềm ẩn trong các bệnh nhân mắc bệnh lao tiềm ẩn có thể tồn tại trong các mô của cơ thể hàng năm, thậm chí hàng thập kỷ, trước khi gây ra bệnh lao hoạt động Có vài yếu tố có thể ảnh hưởng đến thời gian tồn tại của bệnh lao tiềm ẩn

cũng như ảnh hưởng đến sự chuyển từ lao tiềm ẩn thành bệnh lao khởi phát Các yếu

tố đó bao gồm: nhiễm HIV, suy dinh dưỡng, sử dụng ma túy, bệnh ung thư, bệnh tiểu đường, suy chức năng thận mãn tính và đang điều trị với thuốc kìm miễn dịch (50)

Các khảo sát trên mẫu mô (từ phẫu thuật và sinh thiết) từ những người không

có triệu chứng nhưng có bằng chứng bị lao tiềm ẩn cho thấy rằng các mẫu mô này có chứa vi khuẩn lao (quan sát thấy nhờ cấy chuyền vào động vật) Tuy nhiên, khi nhuộm soi để tìm vi khuẩn lao bằng kính hiển vi lại không tìm thấy các trực khuẩn kháng cồn, kháng toan (acid fast bacilli, AFB) như trong trường hợp bệnh lao khởi phát (active tuberculosis) (50) Có hai giả thuyết được đưa ra để giải thích hiện tượng này Giả thuyết thứ nhất cho rằng các vi khuẩn lao dạng tiềm ẩn thu được từ bệnh nhân lao thể tiểm ẩn đã đi vào một giai đoạn phát triển đặc biệt làm cho nó không còn khả năng kháng acid nữa Giả thuyết thứ hai lại cho rằng các vi khuẩn này vẫn kháng acid nhưng hiện diện với nồng độ cực thấp, đến mức không thể phát hiện được bằng phương pháp nhuộm soi thông thường (50)

1.1.2.3 Bệnh lao phổi

Bệnh lao phổi là bệnh gây ra bởi sự nhiễm trùng lao phổ biến nhất (22) Trong

đó, triệu chứng phổ biến nhất của bệnh lao phổi chính là ho Trong giai đoạn sớm của bệnh, ho thường không nhiều nhưng khi viêm và hoại tử mô xảy ra thì ho thường nhiều hơn và kèm theo đàm Nếu bị viêm ở nhu mô phổi cạnh màng phổi thì sẽ có triệu chứng đau ở màng phổi Tràn khí lồng ngực tự phát có thể xảy ra và thường gây đau ngực, đôi khi gây khó thở Ho ra máu cũng có thể xảy ra nhưng không chuyên biệt cho bệnh lao đang hoạt động (22)

Lao phổi thường gây ra các bất thường biểu hiện trên phim Xquang chụp lồng ngực và các chuyên gia chẩn đoán hình ảnh chuyên khoa lao có thể phân biệt được lao phổi nguyên phát, tái phát hay vết thương lao đã lành Tuy nhiên, các bệnh nhân lao đồng nhiễm HIV trong giai đoạn trễ thường có biểu hiện trên phim Xquang không

chuyên biệt nên gây khó khăn cho việc chẩn đoán lao ở các bệnh nhân này nếu chỉ căn

cứ vào biểu hiện trên phim Xquang

Chẩn đoán lao phổi có thể được thực hiện thông qua nuôi cấy hay nhuộm soi trực tiếp trên mẫu đàm Các mẫu đàm đơn, thu vào sáng sớm thường cho hiệu quả cao

và giảm mức độ tạp nhiễm so với việc thu mẫu đàm vào nhiều buổi trong ngày rồi trộn các mẫu thu được với nhau để làm xét nghiệm (22)

Độ nhạy của việc kiểm tra đàm tăng lên theo số lượng mẫu bệnh phẩm thu được Tuy nhiên, độ nhạy này không tăng khi số lượng mẫu thu lớn hơn 5 và sự chênh lệch giữa 3 và 5 mẫu đàm là không nhiều Trong trường hợp bệnh nhân không thể cung cấp mẫu đàm cho chẩn đoán, việc cảm ứng tạo đàm bằng cách cho hít thở trong làn hơi từ dung dịch muối ưu trương (3-5%) có thể được áp dụng Một vài loại bệnh phẩm khác có thể được sử dụng để chẩn đoán lao là dịch dạ dày hay mẫu sinh thiết cuống phổi (22)

1.1.2.4 Bệnh lao ngoài phổi

Lao ngoài phổi là tên gọi chung của các bệnh lao biểu hiện ở các cơ quan khác phổi Các bệnh này bao gồm: lao kê (bệnh lao lan tỏa, đa cơ quan), lao hạch, lao màng phổi, lao sinh dục – niệu, lao xương, lao hệ thần kinh trung ương gồm lao màng não và

u lao não, lao ổ bụng, lao màng tim (22)

Theo số liệu của Hoa Kỳ, lao ngoài phổi chỉ chiếm khoảng 15% trong các bệnh nhân lao nhưng lại gây ra nhiều vấn đề phức tạp trong chẩn đoán và trị liệu hơn so với lao phổi (11) Một phần của những vấn đề này là do tính kém phổ biến của bệnh nên các bác sĩ ít quen thuộc với bệnh Ngoài ra, lao ngoài phổi thường liên quan đến những

vị trí khó tiếp cận như não, màng não, tim, thận, … Bên cạnh đó, do đặc thù cơ quan

mà ít vi khuẩn hơn lại gây tổn thương lớn hơn so với lao phổi Sự kết hợp của hai yếu

tố này làm cho việc chẩn đoán cận lâm sàng của bệnh trở nên khó khăn và đòi hỏi

nhiều thủ thuật xâm nhập để thu nhận mẫu bệnh phẩm (ví dụ như cần chọc dịch não

tủy để chẩn đoán lao màng não)

1.1.3 Quy trình chẩn đoán bệnh lao phổi

Quy trình chẩn đoán lao phổi trong những bệnh nhân không nhiễm HIV và soi

đàm ban đầu không phát hiện AFB được trình bày trong Hình 1.2

Hình 1.2: Quy trình chẩn đoán lao phổi có AFB (-) trong những bệnh nhân

không nhiễm HIV

Quy trình chẩn đoán lao phổi bắt đầu bằng việc xác định người nghi lao phổi

Có thể xác định được những đối tượng này thông qua các triệu chứng như:

‚ Ho khạc đàm kéo dài trên 2 tuần Đây là triệu chứng nghi lao quan trọng nhất

‚ Gầy sút, kém ăn, mệt mỏi

Lao phổi AFB(+)

Xquang phổi và Hội chẩn bác sĩ Chuyên khoa, các xét nghiệm hỗ trợ

Tất cả các bệnh nhân nghi laoXét nghiệm đàm tìm AFBKết quả âm tính cả 3 mẫu đàm, chụp Xquang phổi

Có triệu chứng nghi lao Æ điều trị kháng sinh phổ rộng,

(không dùng thuốc chống lao và nhóm Quinolone)

Triệu chứng

không thuyên giảm

Triệu chứng thuyên giảm

Xét nghiệm lại 3 mẫu

‚ Sốt nhẹ về chiều

‚ Ra mồ hôi “trộm” ban đêm

‚ Đau ngực, đôi khi khó thở

‚ Ho ra máu, v.v…

Người nghi lao cần được xét nghiệm đàm tìm AFB Đặc biệt, cần đặc biệt chú ý

để phát hiện sớm khi có các triệu chứng nghi lao trong các nhóm nguy cơ cao như: người tiếp xúc trực tiếp với nguồn lây, đặc biệt là trẻ em, người nhiễm HIV/AIDS, người suy dinh dưỡng, mắc các bệnh mãn tính (loét dạ dày, đái tháo đường, …), người nghiện ma túy, rượu, tiếp xúc với các chất độc, người sử dụng các thuốc giảm miễn dịch kéo dài, người vô gia cư, và các cán bộ quản giáo, tù nhân, học viên trong các trung tâm cai nghiện

Nếu xét nghiệm đàm cho kết quả AFB dương tính với tối thiểu 2 mẫu đàm khác nhau; hoặc 1 tiêu bản đàm AFB (+) và có hình ảnh trên phim Xquang phổi nghĩ đến lao tiến triển; hoặc 1 tiêu bản đàm AFB (+) và nuôi cấy dương tính thì kết luận bệnh nhân bị lao phổi AFB (+) và cần đưa vào chương trình điều trị bệnh lao ngay

Trong trường hợp xét nghiệm đàm và cho kết quả âm tính với AFB thì tiến hành điều trị thử với kháng sinh phổ rộng, không dùng các thuốc có tác dụng trên vi khuẩn lao như kháng sinh thuộc họ fluoroquinolone Nếu triệu chứng nghi lao thuyên giảm thì kết luận là bệnh đường hô hấp nhưng không phải do lao Nếu các triệu chứng này vẫn kéo dài thì cần xét nghiệm lại các mẫu đàm và thực hiện tiếp các đánh giá khác để chẩn đoán bệnh một cách chính xác nhằm điều trị có hiệu quả

1.2 Vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis

Vi khuẩn lao được phân lập và phát hiện bởi bác sĩ và đồng thời là một nhà khoa học lỗi lạc người Đức, Robert Koch, vào năm 1882 từ những bệnh nhân lao Robert Koch đã chứng minh được nguyên nhân của bệnh lao là do vi khuẩn lao và đặt

nền tảng quan trọng trong vi khuẩn học nói chung và các nghiên cứu về bệnh lao nói

riêng (14)

1.2.1 Khóa phân loại của vi khuẩn lao

Giới (superkingdom) Vi khuẩn (bacteria)

Chi (genus) Mycobacterium

Nhóm (species group) Mycobacterium tuberculosis complex

Loài (species) Vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis)

1.2.2 Đặc điểm cơ bản của vi khuẩn lao

Vi khuẩn lao hiếu khí, có hình que nên còn gọi là trực khuẩn lao hay trực khuẩn Koch để ghi công của người phát hiện Vi khuẩn lao không di động, có chiều dài

khoảng 1-4µm Hình 1.3 thể hiện hình dạng của vi khuẩn lao dưới kính hiển vi điện

tử

a

Hình 1.3 Vi khuẩn lao dưới kính hiển vi điện tử quét

Về mặt phân loại, vi khuẩn lao được xếp vào nhóm vi khuẩn Gram dương (vì không có lớp vỏ ngoài trong cấu trúc vách) Tuy nhiên, vách tế bào của vi khuẩn lao lại đặc biệt giàu lipid, chủ yếu là các mycolic acid, khác hẳn với cấu trúc vách của vi khuẩn Gram âm và Gram dương

Ngoài ra, vi khuẩn lao có tốc độ tăng trưởng rất chậm, thông thường, cần tới khoảng 20 giờ cho mỗi chu kỳ nhân đôi Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng tương ứng với nhiệt độ cơ thể người bình thường: 37oC

1.2.3 Bộ gene của vi khuẩn lao

Năm 1998 Cole và cộng sự đã giải mã và công bố trình tự bộ gene của vi khuẩn lao chủng H37Rv (NC 000962) (34) Chủng vi khuẩn lao H37Rv được phân lập lần đầu tiên vào năm 1905 và được sử dụng rộng rãi nhất trong các nghiên cứu về bệnh lao (17)

Hình 1.4 Ảnh minh họa bộ gene của chủng vi khuẩn lao H37Rv

Một số đặc điểm cơ bản của bộ gene của chủng H37Rv (34):

- Chiều dài bộ gene: 4.411.532 nucleotide

- Dạng tồn tại: DNA mạch kép, dạng vòng

- Tổng hàm lượng GC của bộ gene: 65,6% Một số vùng trong bộ gene còn có hàm lượng GC cao hơn, dao động từ 46,6% đến 85,8%

- Chỉ khoảng 59% các gene của vi khuẩn lao được phiên mã theo cùng chiều

tiến của chẻ ba sao chép và vị trí của operon rRNA, rrn, cách oriC đến 1.500 kilobase

(kb) góp phần giải thích sự phát triển chậm của vi khuẩn lao Trong khi đó, vi khuẩn

Bacillus subtilis có 75% các gene nằm trên mạch tiến trong sao chép, điều này được cho là giúp tăng cường mức độ biểu hiện của gene ở B subtilis

- Bộ gene của vi khuẩn lao cũng có mật độ gene đặc trưng của giới vi khuẩn: cứ mỗi 1,1 kb thì có khoảng 1 gene Hơn 91% các vùng mã hóa tiềm năng trong bộ gene

đã được sử dụng

- Các gene mã hóa cho protein đã được xác định bằng nhiều hướng khác nhau bao gồm sử dụng codon, việc lựa chọn base ưa thích theo vị trí (positional base preference) và dò tìm trên ngân hàng dữ liệu (57) Tất cả các trình tự mã hóa đều được đặt tên theo Rv (ví dụ: Rv0001) và có tên chuyên biệt khi có thể (ví dụ: dnaA) Sơ khởi, 3924 gene có thể mã hóa cho protein đã được dự đoán và thêm 13 gene nhỏ (mã hóa cho protein <80 amino acid) nhờ proteomics và so sánh bộ gene (34)

1.3 Điều trị bệnh lao và sự kháng thuốc ở vi khuẩn lao

Bảng 1.1 Một số loại thuốc kháng lao hiện nay (33)

Diệt khuẩn (đối với vi khuẩn lao đang phân chia)

Diệt khuẩn +

Ciprofloxacin 500-1000mg Diệt khuẩn yếu +

Levofloxacin 500-1000mg Diệt khuẩn + Gatifloxacin 400mg Diệt khuẩn Đang tiến hành

Moxifloxacin 400mg Diệt khuẩn Đang tiến hành

Co-amoxiclav 3000/750mg Diệt khuẩn (đối với vi

khuẩn lao đang phân chia)

+/-

Các thuốc kháng lao hàng thứ nhất bao gồm isoniazid (INH hay H), rifampicin (RMP hay R), pyrazinamide (PZA hay Z), ethambutol (EMB hay E) và streptomycin (STM hay S) Các thuốc này đều đã qua các đánh giá trên lâm sàng và là các loại thuốc được sử dụng trong phác đồ điều trị lao phổ biến nhất hiện nay ( 2HRZE/4HR) (44)

Có 6 nhóm thuốc kháng lao hàng thứ hai được WHO công nhận là: (1) aminoglycoside (ví dụ như amikacin, kanamycin), (2) polypeptide (ví dụ như capreomycin, viomycin, enviomycin), (3) fluoroquinolone (ví dụ như ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin), (4) thioamide (ví dụ như ethionamide, prothionamide), (5) cycloserine và (6) para-aminosalicylic acid

Các thuốc được xếp vào nhóm kháng lao hàng thứ hai vì một trong các lý do sau: kém hiệu quả hơn so với thuốc hàng thứ nhất (trường hợp của para-aminosalicylic acid), hay có những tác dụng phụ nguy hiểm hơn (trường hợp của cycloserine), hay chưa có ở nhiều nước đang phát triển (trường hợp của một số loại fluoroquinolone)

Một số loại thuốc khác có thể có tác dụng trong điều trị lao nhưng không nằm trong danh sách thuốc kháng lao hàng hai của WHO như rifabutin, macrolide (như clarithromycin), linezolid, thioridazine … Các thuốc này thường kém hiệu quả hơn (trường hợp clarithromycin) hay tính hiệu quả chưa được chứng minh (trường hợp linezolid) hay có hiệu quả nhưng cực kỳ đắt trong trường hợp của rifabutin Ngoài ra, hiện nay cũng có một số thuốc mới đang được nghiên cứu về hiệu quả kháng lao như diarylquinoline TMC207 (trước đây được biết dưới tên R207910), nitroimidazopyran PA-824, pyrrole LL-3858

Hiện nay, các nghiên cứu lâm sàng đang được triển khai trên một số thuốc kháng lao hàng thứ hai như moxifloxacin, gatifloxacin và linezolid …Tham khảo thêm thông tin về các nghiên cứu lâm sàng này trên website http://clinicaltrials.gov/ Các nghiên cứu này rất cần thiết để xác định hiệu quả, mức độ an toàn cũng như liều dùng

và phác đồ phối hợp của chúng với các thuốc kháng lao khác

1.3.1.2 Phác đồ điều trị lao

Phác đồ điều trị và chỉ định điều trị của chương trình chống lao Việt Nam (NTP – national tuberculosis control program) hiện nay tuân theo chương trình chống lao của WHO với chiến lược hóa trị liệu ngắn hạn có giám sát (directly observed therapy, short-course, DOTS)

Phác đồ điều trị lao chuẩn theo NTP Việt Nam hiện nay là 2 tháng đầu với 4 loại thuốc kháng lao hàng thứ nhất (isoniazid, rifampicin, pyrazinamide, streptomycin

(hoặc ethambutol)) và 6 tháng với isoniazid và ethambutol dùng hàng ngày (2HRZS (E)/6HE) đối với các bệnh nhân lao mới (mới phát hiện lao và chưa từng được điều trị lao) Ngoài ra, phác đồ 2HRZS (E)/4HR cũng được sử dụng cho các bệnh nhân này

khi Việt Nam đủ nguồn lực để thực hiện việc giám sát toàn bộ quá trình hóa trị liệu

Cả hai phác đồ này được xếp là phác đồ I, chỉ định cho tất cả các trường hợp người

bệnh lao mới Nếu sau 2 tháng tấn công xét nghiệm đàm AFB vẫn dương tính thì kéo

dài thời gian tấn công thêm 1 tháng bằng H,R,Z sau đó chuyển điều trị duy trì Nếu tháng thứ 5 xét nghiệm đàm AFB âm tính thì tiếp tục điều trị duy trì, nếu dương tính coi là thất bại phải chuyển sang công thức tái trị (phác đồ II)

Trong trường hợp bệnh nhân được tái trị (do thất bại điều trị hay tái phát) thì phác đồ II (2SHREZ/HREZ/5R 3 H 3 E 3) được áp dụng Nghĩa là sẽ sử dụng 5 loại thuốc liên tục trong 2 tháng đầu, tháng thứ 3 dùng 4 loại H,R,Z,E hàng ngày; 5 tháng tiếp theo dùng 3 lần một tuần với 3 loại H,R,E Cần lưu ý rằng chỉ tấn công thêm 1 tháng bằng RHZE sau đó chuyển sang giai đoạn điều trị duy trì dù kết quả xét nghiệm đàm AFB âm hay dương Tổng thời gian điều trị vẫn là 8 tháng Nếu hết 8 tháng điều

trị mà xét nghiệm đàm AFB(+), chuyển người bệnh đến cơ sở lao kháng thuốc (1)

Trẻ em khi bị mắc lao sẽ được điều trị theo phác đồ III: 2HRZ/4HR Đối với

những thể lao nặng ở trẻ em như lao màng não, lao kê, lao xương khớp, có thể bổ xung streptomycin trong 2 tháng tấn công

Hiện tại, để điều trị lao đa kháng thuốc (MDR-TB), chương trình chống lao sử dụng hai phác đồ chuẩn cho 2 nhóm đối tượng bệnh nhân: bệnh nhân thất bại phác đồ I

và II (dùng phác đồ IV-a) và bệnh nhân lao mạn tính (dùng phác đồ IV-b)

Phác đồ IV-a: 6 ZE Km Ofx Pto Cs / 12 ZE Ofx Pto Cs Phác đồ này dùng 6

loại thuốc bao gồm pyrazinamide (Z), ethambutol (E), kanamycin (Km), ofloxacin (Ofx), prothionamide (Pto) và cysloserine (Cs) trong 6 tháng đầu (giai đoạn tấn công) Sang giai đoạn duy trì kéo dài 12 tháng, bệnh nhân được điều trị với 5 loại thuốc trên (loại trừ thuốc tiêm)

Phác đồ IV-b: 6 ZE Cm (Km) Mfx (Ofx) Pto Cs / 12 ZE Mfx (Ofx) Pto Cs

Phác đồ này cũng tương tự phác đồ IV-a nhưng dùng capreomycin thay cho kanamycin và dùng moxifloxacin (Mfx) thay cho ofloxacin

Tuy nhiên, việc áp dụng chương trình điều trị bệnh nhân lao MDR-TB còn nhiều phức tạp nên chưa triển khai (1)

1.3.2 Sự kháng thuốc ở vi khuẩn lao

1.3.2.1 Lao đa kháng thuốc

Sự kháng thuốc ở vi khuẩn lao đã và đang ngày càng tăng kể từ sau khi loại thuốc điều trị lao đầu tiên được sử dụng vào năm 1943 (25) Các chủng lao đa kháng thuốc (MDR-TB), được định nghĩa là kháng với ít nhất 2 loại thuốc chống lao hữu hiệu nhất là isoniazid và rifampicin, đã xuất hiện ngay sau khi rifampicin được đưa vào sử dụng rộng rãi vào những năm 1970 (33)

WHO ước tính số ca lao đa kháng thuốc mới mắc trong năm 2003 bao gồm cả các bệnh nhân lao mới và lao đã qua điều trị là 458000 ca (khoảng tin cậy 95%: 321000-689000) (70) Số ca lao đa kháng thuốc hiện mắc trên toàn thế giới có thể cao hơn số ca lao đa kháng thuốc mới mắc từ 2 đến 3 lần (12)

Cuộc khảo sát về sự kháng thuốc ở vi khuẩn lao toàn cầu lần thứ 3 đã hoàn tất

và công bố vào năm 2004 (66) Dữ liệu được thu thập từ 109 vùng lãnh thổ và quốc gia trên toàn cầu cho thấy: Tỷ lệ hiện mắc lao đa kháng thuốc trung bình là 1,2% (khoảng 0-14,2%), trong đó, 11 nơi có tỷ lệ vượt quá chỉ số ngưỡng 6,5% (chỉ số báo động) Trong những bệnh nhân đã được điều trị lao thì tỷ lệ lao kháng thuốc là rất cao: trung bình 23,3% (khoảng 0-82.1%) ca kháng với bất kỳ loại thuốc kháng lao hàng thứ nhất nào (H, R, E, S) và 7,7% (khoảng 0-58,3%) ca lao đa kháng thuốc

Tuy nhiên, mức độ kháng thuốc ở một số khu vực có tình hình dịch tễ lao cao như nhiều vùng của Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Nigeria và các quốc gia thuộc Liên Bang Xô-viết cũ vẫn chưa được biết đến qua cuộc khảo sát trên Dù vậy, kết quả

từ cuộc khảo sát đã khẳng định sự kháng thuốc ở vi khuẩn lao đang là một vấn đề nghiêm trọng toàn cầu Trong đó, nhiều nơi đang đối diện với dịch lao đa kháng thuốc, đặc biệt, nhiều vùng có tỷ lệ lao đa kháng thuốc cao đến mức báo động (25)

Trên bình diện vi sinh học, sự kháng gây ra bởi các đột biến di truyền của vi khuẩn lao làm mất tính hiệu quả của thuốc kháng lao Sau đó, một phác đồ điều trị không đầy đủ, phân phát kém sẽ cho phép một dòng vi khuẩn lao kháng trở thành dòng

ưu thế trong cơ thể bệnh nhân Hóa trị lao ngắn hạn đối với bệnh nhân bị nhiễm bởi những dòng vi khuẩn lao đã kháng với một vài loại thuốc nhất định có thể làm gia tăng

sự kháng đối với những loại thuốc còn nhạy đang được sử dụng Điều này được biết đến với thuật ngữ “hiệu ứng khuếch đại” (amplifier effect) của hóa trị lao ngắn hạn Ngoài ra, sự lây truyền của các chủng kháng thuốc trong cộng đồng chính là một nguồn đáng kể gây ra lao kháng và đa kháng thuốc (70)

Như vậy, mặc dù nguyên nhân gây ra lao kháng thuốc có nguồn gốc từ chính bản thân vi khuẩn lao, thực tế lâm sàng và mang tính hệ thống nhưng bệnh lao kháng thuốc chủ yếu là một hiện tượng do con người gây ra

1.3.2.2 Lao siêu kháng thuốc

Hiểm họa từ bệnh lao kháng thuốc thật sự được nhận ra từ một trận bùng phát của lao siêu kháng thuốc (extensively drug-resistant tuberculosis – XDR-TB) xảy ra vào khoảng tháng một năm 2005 đến tháng ba năm 2006 tại một bệnh viện ở Tugela Ferry, KwaZulu-Natal, Nam Phi (49) Mẫu đàm từ 1539 bệnh nhân được thu nhận và lao đa kháng thuốc (MDR-TB) được tìm thấy trong 221 người bệnh Trong đó, 53 người được xác định là bị lao siêu kháng thuốc (XDR-TB) theo định nghĩa của CDC/WHO công bố ngày 24 tháng 3, 2006 (XDR-TB là thể lao kháng đồng thời với isoniazid, rifampicin và ít nhất 3 trong 6 lớp thuốc kháng lao hàng thứ hai (bao gồm: các aminoglycoside, các polypeptide, các fluoroquinolone, các thionamide, cycloserine

và para-aminosalicylic acid)) Điều đáng lo ngại nhất là 52/53 bệnh nhân này bị tử vong trung bình trong 16 ngày (khoảng dao động: từ 6 đến 37 ngày) Ngoài ra, 44/53 bệnh nhân này có làm xét nghiệm HIV và đều cho kết quả dương tính với HIV

Vào năm 2004-2005, WHO kết hợp với CDC đã tiến hành một cuộc khảo sát toàn cầu cho 14 phòng thí nghiệm chuẩn cấp quốc tế để kiểm tra tính kháng thuốc trong 17690 chủng từ bệnh nhân của 48 quốc gia thu nhận trong giai đoạn 2000-2004 (47) Kết quả là có khoảng 20% (3520/17690) chủng là MDR-TB và 2% (347/17690) chủng là XDR-TB theo định nghĩa vừa nêu

Vào tháng 11, 2006, định nghĩa của XDR-TB đã được thay đổi và sử dụng cho đến hiện nay: XDR-TB là bệnh lao do kháng đồng thời với isoniazid, rifampicin, bất

kỳ loại fluoroquinolone nào và với ít nhất một trong 3 loại thuốc kháng lao dạng tiêm (capreomycin, kanamycine và amikacin) Định nghĩa này được lập ra dựa trên giả định rằng các loại thuốc bị kháng là loại thuốc cần thiết để điều trị lao thành công dù các bằng chứng lâm sàng liên quan vẫn chưa được báo cáo

Năm 2007, Migliori và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu giá trị lâm sàng và thực hành của định nghĩa XDR-TB so với MDR-TB trên các bệnh nhân ở châu Âu (gồm Estonia, Đức, Ý và liên bang Nga) (29) Có 4583 mẫu cấy lao dương được phân tích

và ghi nhận 361 (7,9%) trường hợp MDR-TB và 64 (1,4%) trường hợp XDR-TB Tỷ

lệ HIV dương trong 341 ca MDR-TB có test HIV là 5% và tỷ lệ này là 3,2% (2/61) đối với XDR-TB Kết quả của nghiên cứu này cho thấy nguy cơ tương đối (relative risk)

để có kết quả không mong muốn (chết hay thất bại điều trị) của XDR-TB là 1,58 lần (95% KTC là 1,14-2,20) đối với MDR-TB kháng tất cả các loại thuốc kháng lao hàng thứ nhất (H, R, E, S và Z (nếu có kiểm tra)) và là 2,61 lần (95% KTC là 1,45-4,69) so với các loại MDR-TB khác Kết quả này cho thấy XDR-TB thực sự có ý nghĩa về mặt lâm sàng (tiên đoán kết quả xấu) và thực hành điều trị (xác nhận việc mất các loại thuốc kháng lao hàng thứ nhất và các thuốc kháng lao hàng thứ hai quan trọng)

Đến nay, đã có đến 55 quốc gia và vùng lãnh thổ báo cáo có ít nhất một ca lao

siêu kháng thuốc, trong đó có Việt Nam (67) Hình 1.5 minh họa cho sự hiện diện của

XDR-TB trên toàn cầu

Hình 1.5 Các quốc gia đã báo cáo có ít nhất một ca XDR-TB vào cuối năm

2008 (67)

1.4 Vai trò của fluoroquinolone trong điều trị bệnh lao

Fluoroquinolone (FQ) được sử dụng trong lâm sàng vào những năm 1980 FQ

là các kháng sinh dạng uống, phổ rộng, được chỉ định dùng trong điều trị nhiễm trùng

hô hấp, đường tiêu hóa, ống tiểu và các bệnh lây qua đường tình dục (6) Bên cạnh đó,

một vài loại FQ thể hiện khả năng giết vi khuẩn lao in vitro và in vivo như

ciprofloxacin, ofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin, gatifloxacin (10)

1.4.1 Một số fluoroquinolone

Các quinolone là một lớp kháng sinh tổng hợp nhân tạo có nguồn gốc từ các thuốc kháng ký sinh trùng sốt rét như mepacrine và chloroquine Quinolone đầu tiên là nalidixic acid được sản xuất vào năm 1962, sau khi nó được chú ý đến như một sản

phẩm phụ của quá trình chưng cất trong sản xuất chloroquine nhưng lại có đặc tính

diệt vi khuẩn (51) Hình 1.6 trình bày sự phát triển lâm sàng của các thuốc quinolone

theo thời gian

Hình 1.6 Quá trình phát triển lâm sàng của các thuốc quinolone

Nalidixic acid được sử dụng chủ yếu để chống nhiễm trùng đường tiểu Sau đó, các dẫn xuất của nalidixic acid lần lượt được tổng hợp và tạo ra một họ kháng sinh duy nhất có đặc tính kháng khuẩn nhờ ức chế các enzyme topoisomerase của vi khuẩn (59) Chúng có thể khóa hoạt động của hoặc topoisomerase II (DNA gyrase) hoặc topoisomerase IV dù tác động này là không đồng đều lên 2 loại enzyme Các quinolone thường ức chế DNA gyrase trong trường hợp vi khuẩn Gram âm nhưng lại

ức chế enzyme topoisomerase IV trong trường hợp vi khuẩn Gram dương (42) Kết quả của việc này là sự ức chế quá trình sinh tổng hợp DNA, đứt gãy DNA và gây chết

tế bào vi khuẩn

Các quinolone được sử dụng trong lâm sàng là các 4-quinolone và có chứa một nhóm carboxylic acid (-COOH) tại vị trí thứ 3 trên vòng cơ bản Đặc điểm khác biệt chủ yếu của các FQ đối với các dẫn xuất khác của quinolone là nhóm fluorine tại vị trí

thứ 6 của vòng cơ bản Hình 1.7 minh họa cấu trúc hóa học cơ bản của

fluoroquinolone

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học cơ bản của fluoroquinolone

Các quinolone được phân làm 4 thế hệ dựa vào cấu trúc hóa học của chúng: nalidixic acid là quinolone thế hệ thứ nhất; thế hệ hai bao gồm norfloxacin, ciprofloxacin, enoxacin, ofloxacin; thế hệ ba bao gồm sparfloxacin và grepafloxacin; thế hệ bốn gồm có trovafloxacin, clinafloxacin, moxifloxacin và gatifloxacin (59)

1.4.2 Hoạt tính của fluoroquinolone trên vi khuẩn lao

Các nghiên cứu lâm sàng về việc sử dụng FQ đã và đang được tiến hành với hai mục tiêu chính là rút ngắn thời gian điều trị bệnh lao (kết hợp với các thuốc kháng lao hàng thứ nhất) hay/và điều trị lao đa kháng thuốc (62)

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh hoạt tính kháng vi khuẩn lao in vitro của FQ

(30, 38, 71) Các FQ mới như gatifloxacin, moxifloxacin có nồng độ ức chế tối thiểu (minimum inhibitory concentration, MIC) thấp hơn levofloxacin, ciprofloxacin và

ofloxacin (xem Bảng 1.2) (6) Ngoài ra, gatifloxacin và moxifloxacin cũng có hoạt

tính diệt khuẩn mạnh nhất trong các FQ được kiểm tra trên các vi khuẩn lao kháng rifampicin (39) Đặc biệt, các FQ còn có khả năng xâm nhập vào các đại thực bào và diệt vi khuẩn lao có trong đó (9, 54)

Bảng 1.2 Nồng độ ức chế tối thiểu của fluoroquinolone đối với vi khuẩn lao

Các FQ thế hệ sau quinolone thế hệ một cũng có hoạt tính kháng vi khuẩn lao

in vivo và hoạt tính của chúng phụ thuộc vào nồng độ Một nghiên cứu so sánh hoạt tính kháng vi khuẩn lao in vivo của các thuốc kháng lao cho thấy hoạt tính kháng lao

của gatifloxacin, moxifloxacin và isoniazid là tương đương nhau (5) Trong các FQ

được nghiên cứu (Bảng 1.2), moxifloxacin cho thấy có hoạt tính diệt khuẩn lao cao

tương đương với isoniazid (6)

Tuy nhiên, để xác định được sự tương quan giữa các thông số dược động học với hiệu quả thật sự trên người thì các mô hình thí nghiệm trên động vật cũng như các nghiên cứu lâm sàng là rất cần thiết

1.5 Sự kháng fluoroquinolone ở vi khuẩn lao

Tương tự như các thuốc kháng lao khác, sự chọn lọc của một quần thể phụ (subpopulation) các vi khuẩn lao kháng FQ đòi hỏi một quần thể vi khuẩn đang phân chia đủ lớn để chứa các thể đột biến kháng thuốc ngẫu nhiên và có sự hiện diện của loại thuốc đang hoạt động (15)

Nếu số lượng vi khuẩn trong một hang lao ở phổi là 1x108 CFU/ml và sự hiện diện ngẫu nhiên của các thể đột biến kháng FQ có tần suất khoảng 2x10-6 đến 1x10-8

mỗi lần phân chia thì có khoảng 1-100 thể đột biến kháng FQ hiện diện tại giai đoạn đầu của quá trình điều trị với FQ (6) Trong suốt quá trình trị liệu với FQ, các chủng vi

khuẩn hoang dại có kiểu hình nhạy với FQ sẽ bị tiêu diệt và như vậy sự chọn lọc in vivo các thể đột biến kháng FQ sẽ xảy ra

Trong khi không có báo cáo nào trình bày về sự kháng chéo giữa FQ và các lớp kháng sinh kháng lao khác thì sự kháng chéo trong lớp FQ đã được báo cáo khá nhiều (4, 7, 58) Điều đó có nghĩa là sự kháng với một FQ sẽ dẫn đến việc giảm độ nhạy của

chủng vi khuẩn lao với các FQ khác Đặc biệt, các đột biến trên gene gyrA của vi

khuẩn lao dự đoán sự kháng với ciprofloxacin ở mức độ lâm sàng (36) và kháng chéo với các FQ khác (16)

1.5.1 Tỷ lệ kháng fluoroquinolone ở vi khuẩn lao

Vì tính nhạy FQ không được đánh giá thường quy trên các chủng vi khuẩn lao trong lâm sàng nên tần suất hiện diện của sự kháng FQ ở vi khuẩn lao không thể xác định được trên thế giới cũng như trên bình diện quốc gia Tuy nhiên, gần đây, do sự kháng FQ ở vi khuẩn lao có chiều hướng tăng lên do sự sử dụng rộng rãi các FQ trong lâm sàng đã thúc đẩy các nước tiến hành điều tra tỷ lệ kháng FQ ở vi khuẩn lao

Ở Canada và Hoa Kỳ, trong các chủng vi khuẩn lao thu được từ năm 1996 đến

2000 thì tỷ lệ kháng với ciprofloxacin (xét nghiệm tại nồng độ 2µg/ml, theo phương pháp thành phần trên môi trường thạch đặc) là 1,8%(33/1852) Trong các chủng kháng ciprofloxacin đó có tới 75,8% (25/33) chủng là MDR-TB (13)

Tại Đài Loan, FQ ngày càng được sử dụng nhiều trong điều trị lao đa kháng thuốc nên việc xác định tần suất kháng FQ tại đây là cần thiết 141 chủng vi khuẩn lao được chọn dựa vào kết quả kháng sinh đồ trên thuốc kháng lao hàng thứ nhất từ 3497 chủng lâm sàng thu trong giai đoạn 1995-2003 Các chủng này bao gồm: 62 chủng nhạy với các thuốc H, R, S, E; 33 chủng MDR-TB và 46 chủng kháng thuốc khác đa kháng Sau đó, các chủng lao trên được tiến hành xác định MIC cho 3 loại FQ là

ciprofloxacin, ofloxacin và levofloxacin Kết quả cho thấy có sự kháng chéo trong 3 loại FQ sử dụng và tỷ lệ kháng tương đối thấp trong các chủng nhạy thuốc (1,6-3,2%)

và các chủng kháng khác MDR-TB (2,2-4,3%) Trong các chủng MDR-TB, tỷ lệ kháng FQ khá cao, dao động từ 7,7% (1995-1997) đến 22,2% (1998-2000) rồi giảm xuống 18,2% (2001-2003) (64)

Tại Thượng Hải, Trung Quốc, đột biến trên gene gyrA tìm thấy trong 1,9%

(5/257) các chủng nhạy với các thuốc kháng lao hàng thứ nhất (H, R, S, E) và 25,1% (44/175) chủng MDR-TB (52)

Trong khi đó, một trung tâm y tế tư chuyên về lao – phổi tại Mumbai, Ấn Độ, báo cáo sự gia tăng của tính kháng FQ tại đây từ 3% năm 1996 lên đến 35% năm 2004 (21)

Tuy nhiên, một cuộc khảo sát tính kháng FQ toàn quốc tại Rwanda lại cho thấy chỉ khoảng 0,6% (4/701) chủng nghiên cứu là kháng với ofloxacin (2µg/ml, theo phương pháp thành phần) (3) Trong 4 chủng kháng đó, có đến 3 chủng là lao đa kháng và 1 chủng nhạy hoàn toàn với 4 thuốc kháng lao chính yếu Cả 4 chủng đều

mang đột biến điểm trên gene gyrA: 3 chủng mang đột biến làm thay đổi threonine tại

vị trí 80 thành alanine (T80A) và 1 chủng mang đột biến tại codon 94, làm thay aspartic acid thành alanine (D94A)

Tóm lại, tính kháng FQ trên các chủng lao nhạy thuốc còn hạn chế Tuy nhiên, tính kháng FQ trên các chủng MDR-TB lại rất cao và là một mối đe dọa cho việc sử dụng FQ trong điều trị MDR-TB

1.5.2 Cơ chế kháng fluoroquinolone ở vi khuẩn lao

Các cơ chế kháng fluoroquinolone ở vi khuẩn lao cũng tương tự như ở các vi khuẩn khác Các cơ chế này bao gồm: sự đột biến dẫn đến thay đổi đích tác động của

FQ, giảm mức độ hấp thụ thuốc vào bên trong tế bào vi khuẩn, và bảo vệ DNA gyrase khỏi ảnh hưởng của thuốc (56)

1.5.2.1 Đích tác động của fluoroquinolone trên vi khuẩn lao

Một cách tổng quát thì đích tác động của các quinolone là DNA topoisomerase loại II là các enzyme cần thiết cho quá trình đóng và tháo xoắn của vi khuẩn (51) DNA topoisomerase loại II bao gồm topoisomerase II (DNA gyrase) và topoisomerase

IV

Các DNA topoisomerase loại II cần thiết cho quá trình sao chép DNA cũng như phiên mã RNA ở vi khuẩn Bình thường, DNA của vi khuẩn ở dạng đóng vòng và siêu xoắn nên khi bước vào sao chép hay phiên mã, DNA cần được tháo xoắn trước khi tách mạch nhằm giảm áp lực lên cấu trúc phân tử DNA, tránh đứt gãy DNA dẫn đến chết tế bào Thông thường, DNA gyrase sẽ chịu trách nhiệm tạo xoắn từ DNA dạng

thả lỏng còn topoisomerase IV sẽ làm nhiệm vụ tháo xoắn cho DNA (xem Hình 1.8)

Tuy nhiên, khi có sự hiện diện của các quinolone, hoạt động đóng và tháo xoắn này của các enzyme sẽ bị gián đoạn, dẫn đến đứt gãy DNA và chết tế bào (46)

Hình 1.8 Hoạt động của DNA gyrase và topoisomerase IV

Tuy nhiên, kết quả giải trình tự bộ gen của vi khuẩn lao chủng H37Rv (ATCC 27294) cho thấy không có vùng tương đồng của gen mã hóa cho DNA topoisomerase

IV (57) Do vậy, DNA gyrase của vi khuẩn lao chính là đích tác động duy nhất của các

FQ

DNA dạng thả lỏng

DNA bị cắt một mạch

DNA dạng đóng xoắn (siêu xoắn)

DNA gyrase là một enzyme gồm 4 tiểu phần: 2 tiểu phần A (mã hóa bởi gene

gyrA) và 2 tiểu phần B (mã hóa bởi gene gyrB) (xem Hình 1.9) Sự tương tác giữa

enzyme DNA gyrase và các thuốc quinolone có thể liên quan đến các vùng bảo tồn gọi

là vùng quy định tính kháng quinolone (QRDR) trên 2 gene gyrA và gyrB

Hình 1.9 Hình minh họa cấu trúc của DNA gyrase và phức hợp DNA-enzyme

DNA gyrase-fluoroquinolone

Vùng QRDR của vi khuẩn lao trên gene gyrA nằm trong khoảng codon 74 đến

113 (tương ứng với 67 đến 106 trên gyrA của E.coli) (xem Hình 1.10) (28) Các đột

biến tại codon 90 và 94 trên gene gyrA (tương ứng với 83 và 87 trên gene gyrA của E.coli) và codon 495, 516 và 533 trên gene gyrB (tương ứng với 426, 447 và 464 trên gene gyrB của E.coli) của vi khuẩn lao thường thấy nhất trong các chủng vi khuẩn lao

kháng FQ (37)

Fluoro -quinolone

Hình 1.10 Vùng quyết định tính kháng quinolone (QRDR) của gene gyrA

Hình nhỏ ở góc phải mô tả cấu trúc dưới dạng ribbon của phân mảnh protein gyrA (59

kiloDalton), trong đó, phần có màu xám đậm chính là vùng QRDR Hình chính là vùng QRDR được phóng lớn Tyrosine ở vị trí 122 là trung tâm hoạt động của protein Các serine ở vị trí 83 và aspartate ở vị trí 87 nằm ở vị trí tiếp xúc với dung môi Số thứ

tự của các vị trí được ghi nhận theo thứ tự của gene gyrA trên vi khuẩn E.coli (28)

1.5.2.2 Cơ chế kháng fluoroquinolone ở vi khuẩn lao

Năm 1994, Howard E Takiff và cộng sự đã tạo dòng thành công và giải trình tự

các gene gyrA và gyrB (GenBank L27512) mã hóa cho các protein cấu trúc của DNA gyrase của vi khuẩn lao Đồng thời, Takiff cũng giải trình tự vùng QRDR cho gyrA và gyrB cho trên 50 chủng lâm sàng và phát hiện các đột biến tại codon 90, 91 và 94 của

gene gyrA (36) Đây là tiền đề để nghiên cứu cơ chế kháng thuốc fluoroquinolone ở vi

khuẩn lao

Tương tự như các thuốc kháng lao khác, tính kháng fluoroquinolone của vi khuẩn lao có thể do sự đột biến ngẫu nhiên hay dưới áp lực chọn lọc của việc sử dụng

thuốc Các đột biến xuất hiện ngẫu nhiên tại vùng QRDR của gyrA trong phòng thí

nghiệm có tần suất là 2x10-6 đến 1x10-8 (31) Hình 1.11 minh họa các vị trí phát hiện

thấy đột biến trên gene gyrA trong các chủng kháng FQ trong nghiên cứu của Takiff và cộng sự Đột biến trên gyrB trên các chủng kháng fluoroquinolone cũng được báo cáo

nhưng rất hiếm và nằm rãi rác trong vùng QRDR (7, 8, 53, 64) Tuy nhiên, các nghiên cứu chức năng của các đột biến này vẫn chưa được công bố

Hình 1.11 Trình tự của vùng QRDR trên gene gyrA của vi khuẩn lao (từ

nucleotide thứ 78 đến 397) với các dạng đột biến có thể tìm thấy trong các chủng kháng quinolone (tại các codon 88, 90, 91 và 94).(36)

Các cơ chế khác liên quan tới tính kháng fluoroquinolone ở vi khuẩn lao có thể

là do sự thay đổi mức tích lũy thuốc nội bào và/hay do các bơm đẩy thuốc ngược ra khỏi tế bào như ở các loại vi khuẩn khác (6, 10, 62)

Bên cạnh đó, một cơ chế kháng FQ khác ở vi khuẩn lao mới được phát hiện vào năm 2005 Cơ chế này liên quan đến một loại protein thuộc họ “penta peptide repeats”

và được đặt tên là MtMfpA (do gene Rv3361c mã hóa) trong vi khuẩn lao (35) Họ protein này có chứa các protein đặc biệt mà cứ mỗi 5 amino acid (aa) thì aa thứ năm sẽ hoặc là leucine hoặc là phenylalanine (19) Cấu trúc này tạo ra một dạng protein mô phỏng DNA với các xoắn helix có độ rộng và tích điện âm tương tự các B-helix DNA (35) Một vài thành viên trong họ protein này có thể kể đến là MfpA trong

Mycobacterium smegmatis, McbG trong Escherichia coli và Qnr trên plasmid của Klebsiella pneumoniae và các vi khuẩn đường ruột khác (Enterobacteriaceae) Sự

liên quan giữa sự hiện diện của các protein này và tính kháng FQ đã được đề xuất bởi Dryden và cộng sự (23)

1.5.3 Chẩn đoán sự kháng fluoroquinolone ở vi khuẩn lao

1.5.3.1 Xét nghiệm kiểu hình

Tiêu chuẩn vàng để xét nghiệm độ nhạy với fluoroquinolone của vi khuẩn lao là phương pháp thành phần (proportion method-PM) trên môi trường thạch đặc (48) Khuyết điểm chính của phương pháp này là cần đến 3 tuần để có kết quả Các phương pháp xét nghiệm kháng sinh đồ nhanh cho vi khuẩn lao đã có mặt nhưng chưa được khảo sát kỹ với các thuốc FQ Các phương pháp này thường là các phương pháp kiểm tra trên môi trường lỏng như dùng các tube chỉ thị sự tăng trưởng của các mycobacteria (mycobacterial growth indicator tube – MGIT) 960 của hãng Becton-Dickinson, phương pháp quan sát độ nhạy thuốc dưới kính hiển vi (microscopic observation drug susceptibility – MODS) và xét nghiệm hiện màu với nitrate reductase (nitrate reductase assay – NRA)

Theo hướng dẫn của Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), sự kháng ofloxacin được định nghĩa là có ít nhất 1% các khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch đặc có chứa 2mg/l ofloxacin (48), nồng độ tương tự cũng được sử dụng cho các

phương pháp trên môi trường lỏng nêu trên (55) Tương tự, ciprofloxacin (2 mg/L), levofloxacin (2 mg/L) và moxifloxacin (0.5 mg/L) cũng được sử dụng cho cả 4 phương pháp để xét nghiệm tính kháng hay nhạy đối với các thuốc đó

Các phương pháp trên môi trường lỏng đều có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao (> 98,7%) so với phương pháp chuẩn PM Tuy nhiên, thời gian đòi hỏi để có được kết

quả và giá thành của mỗi phương pháp rất khác nhau (xem Bảng 1.3.) Bên cạnh đó,

ofloxacin tỏ ra có độ nhạy và độ đặc hiệu cao đối với sự kháng FQ trên vi khuẩn lao trong các phương pháp trên Ngoài ra, xét nghiệm trên ofloxacin có độ nhạy và độ đặc hiệu đạt 100% trong việc phát hiện tính kháng với ciprofloxacin và levofloxacin Độ nhạy này là 95% và độ đặc hiệu là 100% trong việc phát hiện kháng moxifloxacin Ngoài ra, các thuốc FQ này cũng cho thấy là còn ổn định trong vòng 6 tuần lễ trong điều kiện ủ của phương pháp PM và máy MIGT 960 (55)

Bảng 1.3 Thời gian và giá cần cho một xét nghiệm kháng kinh đồ cho FQ theo

các phương pháp kiểu hình khác nhau PM: phương pháp thành phần chuẩn trên môi trường rắn; MGIT 960: phương pháp tự động trên môi trường MGIT (mycobacterial growth indicator tube); MODS: phương pháp quan sát độ nhạy thuốc dưới kính hiển vi

và NRA: xét nghiệm hiện màu với nitrate reductase

Phương pháp PM MGIT 960 MODS NRA

1.5.3.2 Xét nghiệm kiểu gene bằng sinh học phân tử

Vi khuẩn lao có tốc độ tăng trưởng rất chậm nên các phương pháp phân tử dùng

để chẩn đoán kháng thuốc có ý nghĩa rất lớn Các phương pháp này cung cấp công cụ sàng lọc nhanh các vi khuẩn lao mang đột biến kháng thuốc Nhờ vậy, việc điều trị sẽ

hiệu quả hơn Điều này có ý nghĩa lớn trong sự ngăn chặn sự lây lan của các chủng vi khuẩn kháng thuốc trong cộng đồng

Vì đa số các chủng kháng FQ có mang đột biến trong vùng QRDR của gene

gyrA nên các đột biến trong vùng này chính là đối tượng sàng lọc của các phương pháp

phân tử phát hiện chủng kháng FQ

Các phương pháp phân tử phát hiện đột biến kháng FQ bao gồm: giải trình tự, xét nghiệm dựa trên sự lai của các mẫu dò (line-probe assay), sắc ký lỏng hiệu năng cao (denaturing high-performance liquid chromatography, DHPLC) và phân tích cấu hình của sản phẩm PCR phức (multiplex PCR amplimer conformation (MPAC) analysis) (18, 32, 60)

Giải trình tự vùng QRDR của gene gyrA được xem là tiêu chuẩn vàng để phát

hiện các đột biến liên quan đến tính kháng FQ Biện pháp này giúp phát hiện các đột biến đã biết lẫn các đột biến chưa được công bố do đoạn mồi sử dụng trong phương

pháp này thường được thiết kế để bao phủ cả vùng QRDR của gene gyrA Tuy nhiên,

kỹ thuật này khá đắt tiền và đòi hỏi kỹ thuật viên lành nghề nên không khả thi để sử dụng thường quy, nhất là ở các nước đang phát triển

Xét nghiệm dựa trên sự lai của các mẫu dò được phát triển bởi nhóm tác giả Federico Giannoni và công bố năm 2005 (32) Nguyên tắc của xét nghiệm này tương

tự như xét nghiệm lai bằng mẫu dò nhằm phát hiện đột biến kháng rifampicin đã thương mại hóa (INNO-LiPA Rif TB, hãng Innogenetics, Ghent, Bỉ) Trong xét nghiệm này, 9 mẫu dò đã được thiết kế để phát hiện các trình tự tương ứng là A90V, A90V-S95T, S91P, S91P-S95T, D94A, D94N, D94G-S95T và D94H-S95T Các mẫu

dò sau khi được tổng hợp sẽ được cố định lên màng nitrocellulose nhờ đuôi poly-T gắn vào từng mẫu dò Sau đó, mẫu cần xét nghiệm được dùng để tiến hành phản ứng PCR với hỗn hợp phản ứng có chứa digoxigenin-dUTP để được đánh dấu sản phẩm PCR Các sản phẩm PCR được biến tính và lai với strip (cắt ra từ màng lai đã cố định mẫu dò) Kết quả lai được phát hiện bởi kháng thể kháng digoxigenin gắn alkaline

phosphatase trong dung dịch có chứa nitroblue tetrazolium Kết quả của xét nghiệm

này phù hợp 100% với kết quả giải trình tự vùng QRDR của gene gyrA

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (DHPLC) cũng được sử dụng để phát

hiện đột biến kháng FQ trên gene gyrA (60) Đây là một kỹ thuật tương đối mới và sử

dụng nguyên tắc phân tích heteroduplex để phát hiện đột biến Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã sử dụng 2 chủng vi khuẩn lao chuẩn để làm chủng đối chiếu là H37Rv

và M tuberculosis Erdman Cả hai chủng này đều nhạy với FQ và không chứa các đột biến kháng FQ trên vùng QRDR của gene gyrA Khác biệt của hai chủng này là H37Rv hoàn toàn hoang dại, M tuberculosis Erdman có mang đột biến đa hình S95T

không liên quan đến tính kháng FQ Kết quả của nghiên cứu này cho thấy dạng biểu hiện DHPLC của mỗi kiểu đột biến là chuyên biệt và có khả năng dự đoán được kiểu đột biến nhờ phương pháp này

Nguyên tắc của phân tích heteroduplex (heteroduplex analysis, HA) dựa trên sự hình thành cấu hình của phân tử DNA dạng mạch kép (duplex DNA) khi phân tích trên gel Các thể heteroduplex được hình thành khi sản phẩm khuếch đại sau PCR từ các chủng hoang dại đã biết và trình tự của chủng đột biến được biến tính bằng nhiệt và tái bắt cặp khi nhiệt độ giảm Như vậy, các heteroduplex sẽ mang mismatch tùy theo kiểu đột biến nên độ di động trong điện trường của chúng khác với các homoduplex Dựa vào tính chất đó, người ta có thể phát hiện được các đột biến nhờ kỹ thuật điện di có

độ phân giải cao Ngoài ra, nhiệt độ nóng chảy của các heteroduplex cũng khác các homoduplex nên nguyên tắc này cũng được áp dụng trong kỹ thuật DHPLC nêu trên Tóm lại, các phương pháp phát hiện nhanh các đột biến kháng FQ là rất cần thiết, nhất là ở các nước đang phát triển Việc phát triển và áp dụng phương pháp phù hợp còn tùy thuộc vào nguồn lực của từng nơi

XœW