1.5.3.1. Xét nghiệm kiểu hình
Tiêu chuẩn vàng để xét nghiệm độ nhạy với fluoroquinolone của vi khuẩn lao là phương pháp thành phần (proportion method-PM) trên môi trường thạch đặc (48). Khuyết điểm chính của phương pháp này là cần đến 3 tuần để có kết quả. Các phương pháp xét nghiệm kháng sinh đồ nhanh cho vi khuẩn lao đã có mặt nhưng chưa được khảo sát kỹ với các thuốc FQ. Các phương pháp này thường là các phương pháp kiểm tra trên môi trường lỏng như dùng các tube chỉ thị sự tăng trưởng của các mycobacteria (mycobacterial growth indicator tube – MGIT) 960 của hãng Becton- Dickinson, phương pháp quan sát độ nhạy thuốc dưới kính hiển vi (microscopic observation drug susceptibility – MODS) và xét nghiệm hiện màu với nitrate reductase (nitrate reductase assay – NRA).
Theo hướng dẫn của Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), sự kháng ofloxacin được định nghĩa là có ít nhất 1% các khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch đặc có chứa 2mg/l ofloxacin (48), nồng độ tương tự cũng được sử dụng cho các
phương pháp trên môi trường lỏng nêu trên (55). Tương tự,ciprofloxacin (2 mg/L), levofloxacin (2 mg/L) và moxifloxacin (0.5 mg/L) cũng được sử dụng cho cả 4 phương pháp để xét nghiệm tính kháng hay nhạy đối với các thuốc đó.
Các phương pháp trên môi trường lỏng đều có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao (> 98,7%) so với phương pháp chuẩn PM. Tuy nhiên, thời gian đòi hỏi để có được kết quả và giá thành của mỗi phương pháp rất khác nhau (xem Bảng 1.3.). Bên cạnh đó, ofloxacin tỏ ra có độ nhạy và độ đặc hiệu cao đối với sự kháng FQ trên vi khuẩn lao trong các phương pháp trên. Ngoài ra, xét nghiệm trên ofloxacin có độ nhạy và độ đặc hiệu đạt 100% trong việc phát hiện tính kháng với ciprofloxacin và levofloxacin. Độ nhạy này là 95% và độ đặc hiệu là 100% trong việc phát hiện kháng moxifloxacin. Ngoài ra, các thuốc FQ này cũng cho thấy là còn ổn định trong vòng 6 tuần lễ trong điều kiện ủ của phương pháp PM và máy MIGT 960. (55)
Bảng 1.3. Thời gian và giá cần cho một xét nghiệm kháng kinh đồ cho FQ theo các phương pháp kiểu hình khác nhau. PM: phương pháp thành phần chuẩn trên môi trường rắn; MGIT 960: phương pháp tự động trên môi trường MGIT (mycobacterial growth indicator tube); MODS: phương pháp quan sát độ nhạy thuốc dưới kính hiển vi và NRA: xét nghiệm hiện màu với nitrate reductase.
Phương pháp PM MGIT 960 MODS NRA Thời gian có kết quả 21 8 6 9
Giá (US $) 2,86 13,92 1,38 3,92
1.5.3.2. Xét nghiệm kiểu gene bằng sinh học phân tử
Vi khuẩn lao có tốc độ tăng trưởng rất chậm nên các phương pháp phân tử dùng để chẩn đoán kháng thuốc có ý nghĩa rất lớn. Các phương pháp này cung cấp công cụ sàng lọc nhanh các vi khuẩn lao mang đột biến kháng thuốc. Nhờ vậy, việc điều trị sẽ
hiệu quả hơn. Điều này có ý nghĩa lớn trong sự ngăn chặn sự lây lan của các chủng vi khuẩn kháng thuốc trong cộng đồng.
Vì đa số các chủng kháng FQ có mang đột biến trong vùng QRDR của gene
gyrA nên các đột biến trong vùng này chính là đối tượng sàng lọc của các phương pháp
phân tử phát hiện chủng kháng FQ.
Các phương pháp phân tử phát hiện đột biến kháng FQ bao gồm: giải trình tự, xét nghiệm dựa trên sự lai của các mẫu dò (line-probe assay), sắc ký lỏng hiệu năng cao (denaturing high-performance liquid chromatography, DHPLC) và phân tích cấu hình của sản phẩm PCR phức (multiplex PCR amplimer conformation (MPAC) analysis) (18, 32, 60).
Giải trình tự vùng QRDR của gene gyrA được xem là tiêu chuẩn vàng để phát hiện các đột biến liên quan đến tính kháng FQ. Biện pháp này giúp phát hiện các đột biến đã biết lẫn các đột biến chưa được công bố do đoạn mồi sử dụng trong phương pháp này thường được thiết kế để bao phủ cả vùng QRDR của gene gyrA. Tuy nhiên, kỹ thuật này khá đắt tiền và đòi hỏi kỹ thuật viên lành nghề nên không khả thi để sử dụng thường quy, nhất là ở các nước đang phát triển.
Xét nghiệm dựa trên sự lai của các mẫu dò được phát triển bởi nhóm tác giả Federico Giannoni và công bố năm 2005 (32). Nguyên tắc của xét nghiệm này tương tự như xét nghiệm lai bằng mẫu dò nhằm phát hiện đột biến kháng rifampicin đã thương mại hóa (INNO-LiPA Rif. TB, hãng Innogenetics, Ghent, Bỉ). Trong xét nghiệm này, 9 mẫu dò đã được thiết kế để phát hiện các trình tự tương ứng là A90V, A90V-S95T, S91P, S91P-S95T, D94A, D94N, D94G-S95T và D94H-S95T. Các mẫu dò sau khi được tổng hợp sẽ được cố định lên màng nitrocellulose nhờ đuôi poly-T gắn vào từng mẫu dò. Sau đó, mẫu cần xét nghiệm được dùng để tiến hành phản ứng PCR với hỗn hợp phản ứng có chứa digoxigenin-dUTP để được đánh dấu sản phẩm PCR. Các sản phẩm PCR được biến tính và lai với strip (cắt ra từ màng lai đã cố định mẫu dò). Kết quả lai được phát hiện bởi kháng thể kháng digoxigenin gắn alkaline
phosphatase trong dung dịch có chứa nitroblue tetrazolium. Kết quả của xét nghiệm này phù hợp 100% với kết quả giải trình tự vùng QRDR của gene gyrA.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (DHPLC) cũng được sử dụng để phát hiện đột biến kháng FQ trên gene gyrA (60). Đây là một kỹ thuật tương đối mới và sử dụng nguyên tắc phân tích heteroduplex để phát hiện đột biến. Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã sử dụng 2 chủng vi khuẩn lao chuẩn để làm chủng đối chiếu là H37Rv và M. tuberculosis Erdman. Cả hai chủng này đều nhạy với FQ và không chứa các đột biến kháng FQ trên vùng QRDR của gene gyrA. Khác biệt của hai chủng này là H37Rv hoàn toàn hoang dại, M. tuberculosis Erdman có mang đột biến đa hình S95T không liên quan đến tính kháng FQ. Kết quả của nghiên cứu này cho thấy dạng biểu hiện DHPLC của mỗi kiểu đột biến là chuyên biệt và có khả năng dự đoán được kiểu đột biến nhờ phương pháp này.
Nguyên tắc của phân tích heteroduplex (heteroduplex analysis, HA) dựa trên sự hình thành cấu hình của phân tử DNA dạng mạch kép (duplex DNA) khi phân tích trên gel. Các thể heteroduplex được hình thành khi sản phẩm khuếch đại sau PCR từ các chủng hoang dại đã biết và trình tự của chủng đột biến được biến tính bằng nhiệt và tái bắt cặp khi nhiệt độ giảm. Như vậy, các heteroduplex sẽ mang mismatch tùy theo kiểu đột biến nên độ di động trong điện trường của chúng khác với các homoduplex. Dựa vào tính chất đó, người ta có thể phát hiện được các đột biến nhờ kỹ thuật điện di có độ phân giải cao. Ngoài ra, nhiệt độ nóng chảy của các heteroduplex cũng khác các homoduplex nên nguyên tắc này cũng được áp dụng trong kỹ thuật DHPLC nêu trên. Tóm lại, các phương pháp phát hiện nhanh các đột biến kháng FQ là rất cần thiết, nhất là ở các nước đang phát triển. Việc phát triển và áp dụng phương pháp phù hợp còn tùy thuộc vào nguồn lực của từng nơi.
Đến nay, toàn bộ cơ chế kháng fluoroquinolone vẫn chưa được hiểu đầy đủ và số liệu chính xác về tỷ lệ kháng fluoroquinolone trên thế giới vẫn còn thiếu. Hơn nữa, chưa có nghiên cứu nào tại Việt Nam tìm hiểu về tỷ lệ kháng và cơ chế kháng fluoroquinolone. Đề tài này tìm hiểu các kiểu đột biến trên 2 vùng quy định tính kháng quinolone của gene gyrA và gyrB nhằm làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về các cơ chế kháng FQ ở vi khuẩn lao tại Việt Nam.
[±\