- Đối với vùng QRDR của gyrB
4.1. Kết quả giải trình tự vùng QRDR của gene gyrA
Kết quả giải trình tự vùng QRDR của gene gyrA cho thấy 100% (109/109) các chủng kháng FQ có điểm đa hình S95T so với trình tự hoang dại của vùng gene tương ứng trên chủng chuẩn H37Rv. Điểm đa hình này không liên quan đến tính kháng FQ và hiện diện ở các chủng kháng cũng như nhạy với FQ. Ngoài ra, điểm đa hình tại codon 95 của gene gyrA kết hợp với điểm đa hình tại codon 463 của gene katG được sử dụng để phân nhóm cho phức hợp M. tuberculosis (61).
78% (85/109) các chủng kháng FQ được phát hiện có mang ít nhất một đột biến liên quan đến tính kháng FQ trên vùng QRDR của gene gyrA. Các đột biến tập trung tại 5 vị trí: G88A (n=1), D89N (n=1), S91P (n=3), A90V (n=32) và D94X (n=59). Aspartic acid (D) tại vị trí 94 trong các chủng kháng FQ có thể bị đột biến thành glycine (G), alanine (A), tyrosine (Y), asparagine (N) và histidine (H). Các kiểu đột biến tại codon 90, 91 và 94 phát hiện được trong đề tài tương đồng với các đột biến tìm thấy trong các chủng kháng FQ trên lâm sàng cũng như thực nghiệm chọn lọc thể đột biến trên thế giới (36, 40, 41, 45, 53, 63).
Các nghiên cứu chức năng trên các protein mang đột biến tương đối ít. Một nghiên cứu chức năng của các protein mang đột biến T80A, A90G, T80A/A90G, A90V, D94G, D94H, A90V/D94G trên gene gyrA đã được công bố vào đầu năm 2006 bởi Alexandra Aubry và cộng sự (8). Nghiên cứu này cho thấy các đột biến A90V, D94G, D94H, A90V/D94G làm tăng khả năng duy trì hoạt tính của enzyme dưới sự hiện diện của các FQ, nghĩa là chúng kháng FQ. Trong khi đó, các đột biến T80A, A90G, T80A/A90G lại làm giảm khả năng này của enzyme khi so sánh với enzyme hoang dại. Như vậy, không phải tất cả các loại đột biến trên gene gyrA đều liên quan đến tính kháng FQ của chủng vi khuẩn lao.
Vào cuối năm 2006, nhóm tác giả Stéphanie Matrat cũng công bố việc phân tích chức năng của 2 kiểu đột biến tại codon 88 của gene gyrA của vi khuẩn lao: G88A và G88C. Cả hai kiểu đột biến đều làm tăng nồng độ ức chế tối thiểu của các FQ xét nghiệm so với enzyme hoang dại (43).
Như vậy, nghiên cứu chức năng của các đột biến S91P và D89N vẫn chưa được công bố. Điều này có thể lý giải bởi tần số xuất hiện các đột biến này quá thấp nên chưa được quan tâm hay không có chủng để tiến hành nghiên cứu.
Tỷ lệ các kiểu đột biến trong vùng QRDR của gene gyrA trong 85 chủng kháng FQ và có đột biến trên vùng gene gyrA khảo sát trong đề tài này là: 1.2% (1/85) G88A/A90V; 1.2% (1/85) D89N; 25,9% (22/85) A90V; 2,4% (2/85) S91P; 57,6% (49/85) D94X và 11,8%(10/85) các đột biến kết hợp gồm A90V/D94A, A90V/D94G, A90V/S91P/D94G-A và S91P/D94G-A.
Sự phân bố tỷ lệ đột biến trong vùng QRDR của gene gyrA phát hiện được trong các chủng kháng FQ trong đề tài này cũng tương đồng với các nghiên cứu tại Thái Lan (53) và Nga (45). Cả 3 nghiên cứu đều sử dụng ofloxacin tại nồng độ 2 µg/ml để xác định chủng kháng FQ. Tuy nhiên, nghiên cứu tại Thái Lan và Nga đều có số lượng chủng thấp hơn số chủng sử dụng trong đề tài: 35 chủng trong nghiên cứu của Thái và 48 chủng trong nghiên cứu của Nga. Có thể do số lượng mẫu hạn chế nên trong nghiên cứu ở Thái chưa thấy sự xuất hiện của các chủng có hai hay ba đột biến kháng FQ trên gene gyrA. Tương tự, đột biến S91P không phát hiện được trong nghiên cứu ở Nga trong khi lại xuất hiện với tần suất 9,1% (2/22) trong nghiên cứu ở Thái.
Kết quả giải trình tự vùng QRDR của gene gyrA cho 109 chủng kháng FQ cũng cho thấy có đến 22% (24/109) các chủng này không mang đột biến nào trong vùng gene này. Kết quả này cũng tương tự như các nghiên cứu khảo sát đột biến trên gene
gyrA cho các chủng kháng FQ ở các quốc gia khác trên thế giới (6, 7, 45, 53, 64). Điều
này cho thấy, cơ chế chi phối tính kháng FQ có thể nằm ngoài vùng gene này.
Điểm nổi bật trong kết quả giải trình tự vùng QRDR của gene gyrA trong đề tài này là sự hiện diện của các chủng mang nhiều đột biến và có các kiểu đột biến dị hợp (có peak hoang dại và đột biến tại cùng một vị trí). Vì có 11 chủng mang hai hay ba kiểu đột biến nên tổng số đột biến phát hiện được trong 109 chủng kháng FQ lên đến 121 điểm đột biến. Bên cạnh đó, số lượng các peak dị hợp tìm thấy trong các chủng kháng FQ này là 48 trong số 121 điểm đột biến. Nguyên nhân của các đột biến dị hợp này vẫn chưa thật sự được hiểu rõ. Một số khả năng có thể dẫn đến hiện tượng này có thể liệt kê là: siêu nhiễm (super-infection) cùng lúc nhiều chủng lao; tạp nhiễm do thao tác trong phòng thí nghiệm; cùng một chủng nhưng có một số tế bào vi khuẩn bắt đầu phát sinh đột biến kháng FQ dưới áp lực chọn lọc của thuốc.