- Đối với vùng QRDR của gyrB
3.4. Kết quả của phản ứng real-time PCR với các mẫu chứng dương là plasmid 1 Real-time PCR với các mẫu chứng dương là plasmid
3.4.1. Real-time PCR với các mẫu chứng dương là plasmid
3.4.1.1. Kết quả tạo dòng tạo plasmid tái tổ hợp dùng trong phản ứng real-time PCR
- Sản phẩm PCR với cặp mồi gyrA-3F và gyrA-4R cho các chủng vi khuẩn lao và cặp trình tự P91-F và P91-R (Bảng 2.8) dùng làm DNA bản mẫu để tạo dòng được trình bày trong Hình 3.13.
(a) (b)
Hình 3.13. Sản phẩm PCR với cặp mồi gyrA-3F và gyrA-4R của các chủng vi khuẩn lao (giếng 1-4, hình a) và cặp trình tự P91-F và P91-R (5, hình b). L: thang 100bp.
Kích thước của sản phẩm PCR thu được từ các chủng vi khuẩn lao đã biết trình tự vùng QRDR của gene gyrA trên gel tương ứng với kích thước lý thuyết là 163bp. Tương tự, kích thước của sản phẩm PCR từ cặp trình tự P91-F và P91-R cũng phù hợp với kích thước lý thuyết là 77bp.
(-) 5
500bp
500bp
77bp 163bp
- Sau khi biến nạp các plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn khả nạp E.coli DH5α, dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp được sàng lọc qua kỹ thuật sàng lọc khuẩn lạc trắng/xanh. Kiểm tra sự hiện diện của trình tự DNA mục tiêu trong dòng đã chọn lọc được tiến hành bằng cách khuếch đại sản phẩm PCR với cặp mồi gyrA-3F và gyrA-4R và điện di trên gel agarose. Kết quả điện di sản phẩm thu được trong các dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp được trình bày trong Hình 3.14.
Hình 3.14. Sản phẩm khuếch đại PCR với cặp mồi gyrA-3F và gyrA-4R cho các dòng khuẩn lạc có màu trắng sau biến nạp.
Giếng 1-5: khuẩn lạc chứa DNA mục tiêu từ chủng H37Rv, giếng 6-10: khuẩn lạc chứa DNA mục tiêu từ chủng FQ1031, giếng 11-15: khuẩn lạc chứa DNA mục tiêu từ chủng FQ1043, giếng 16-20: khuẩn lạc chứa DNA mục tiêu từ chủng FQ1094,
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 L 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 (-) L 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 (-) L 163bp 163bp 77bp 100bp 500bp 500bp 200bp
giếng 21-25: khuẩn lạc chứa DNA mục tiêu từ cặp trình tự P91-F và P91-R, (-): chứng âm, L: thang 100bp.
- Sau khi tách chiết plasmid tái tổ hợp từ gel agarose, các plasmid sẽ được kiểm tra bởi phản ứng real-time PCR sơ khởi (thành phần phản ứng: Bảng 2.13, điều kiện phản ứng: Bảng 2.14 với nhiệt độ bắt cặp là 66oC). Kết quả kiểm tra plasmid tách chiết được trình bày trong Hình 3.15.
a.Cy5 b.FAM
c.HEX
Hình 3.15. Tín hiệu huỳnh quang của 5 plasmid tái tổ hợp tương ứng với 5 trình tự DNA mục tiêu.
Đường cong màu đỏ tương ứng với tín hiệu của plasmid chứa sản phẩm PCR của cặp mồi gyrA-3F và gyrA-4R trên chủng hoang dại (H37Rv), plasmid này được gọi là chứng dương c1.
Tương tự, đường màu xanh lá tương ứng với chủng hoang dại S95T (FQ 1031), plasmid tương ứng là chứng c2.
Đường màu xanh dương tương ứng với chủng đột biến A90V (FQ 1043), plasmid tương ứng là chứng c3.
Đường màu cam tương ứng với chủng đột biến D94G (FQ 1094), plasmid tương ứng là chứng c4.
Đường màu hồng tương ứng với sản phẩm của cặp trình tự 91P-F và 91P-R (đột biến S91P), plasmid tương ứng là chứng c5.
Hình a biểu thị tín hiệu của màu Cy5 do mẫu dò w90 phát ra. Tín hiệu cho thấy
chứng c1, c2 và c4 có đường cong khuếch đại đặc trưng dương với màu Cy5 (vì các DNA bản mẫu tương ứng của các plasmid này đều là hoang dại ở vị trí codon 90); chứng c3 âm tính với màu Cy5 (vì các DNA bản mẫu tương ứng của plasmid c3 là đột biến ở vị trí codon 90 ). Đường cong Cy5 của c5 cho thấy lượng tín hiệu thấp hơn hẳn so với chứng c1, c2 và c4. Điều này có thể được giải thích bởi lượng sản phẩm tương ứng với mẫu dò w90 trong chứng c5 thấp hơn trong chứng c1, c2 và c4 hay do chứng c5 có đột biến tại vị trí codon 91 nên ức chế sự bắt cặp của mẫu dò w90. Vì nồng độ tương đối của các mẫu plasmid đã được xác định và pha loãng sao cho nồng độ giữa các phản ứng là tương tự nhau nên giải thích thứ hai là hợp lý. Theo lý thuyết, tín hiệu Cy5 trong chứng c5 phải âm nên đường baseline phải cao hơn tín hiệu Cy5 của chứng c5 như trong hình minh họa.
Hình b biểu thị tín hiệu của màu FAM do mẫu dò m90 phát ra. Tín hiệu FAM
các chứng còn lại có đi lên nhẹ ở các chu kỳ sau nhưng có thể do phản ứng phân hủy của một lượng nhất định của mẫu dò theo thời gian phản ứng. Do đó, các tín hiệu này được xem là tín hiệu nền hay tín hiệu nhiễu. Đường baseline để phân biệt tín hiệu dương và âm phải nằm trên tín hiệu nền.
Hình c biểu thị tín hiệu của màu HEX do mẫu dò w94 phát ra. Về mặt lý
thuyết, tín hiệu HEX trong 5 chứng phải dương tính với c1, c2, c3 và c5; âm tính với c4. Trong hình, ta thấy mức độ tín hiệu của HEX trong chứng c5 cao vượt trội chứng c1 và c2. Điều này có thể do trong chứng c5, sự bắt cặp của 2 mẫu dò m90 và w91 bị ức chế nên sự tương tác tín hiệu giữa các màu huỳnh quang giảm xuống. Tín hiệu HEX của c1 và c2 cũng tạm chấp nhận được. Tuy nhiên, tín hiệu HEX của c3 và c4 lại rất gần nhau trong khi c3 nên dương với HEX và c4 nên âm với HEX. Điều này đòi hỏi sự tối ưu hóa điều kiện phản ứng để có thể phát hiện được các đột biến một cách chính xác và hiệu quả.
Tóm lại, tín hiệu huỳnh quang của các plasmid cho thấy các plasmid này đều chứa trình tự DNA mục tiêu.
3.4.1.2. Kết quả tối ưu hóa điều kiện phản ứng
Phản ứng real-time PCR được tối ưu hóa qua các bước tìm nhiệt độ lai thích hợp, nồng độ MgCl2 với các plasmid tái tổ hợp.
- Hai lần khảo sát gradient nhiệt độ lai 1 (dãy nhiệt độ từ 64oC đến 72o
C) và 2 (dãy nhiệt độ từ 58oC đến 70oC) được thực hiện trên một DNA bộ gene của các chủng được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR tạo plasmid tái tổ hợp. Các kết quả này cũng tương tự với kết quả lần khảo sát thứ ba (dãy nhiệt độ từ 57o
C đến 63oC): nhiệt độ càng tăng, cường độ tín hiệu huỳnh quang càng giảm. Tuy nhiên, 2 lần khảo sát đầu
tiên cho phép giới hạn nhiệt độ lai của phản ứng real-time PCR, làm tiền đề cho khảo sát lần ba.
Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của phản ứng real-time PCR trên các chứng dương (khảo sát lần ba) được trình bày trong Hình 3.16.
a.Cy5, chứng c4 b.FAM, chứng c3
c.HEX, chứng c5
Hình 3.16. Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của phản ứng real-time PCR trên các chứng đột biến.
Dãy đường cong có màu khác nhau tương ứng với nhiệt độ bắt cặp khác nhau: Màu đỏ (57,0o
C), màu xanh lá cây (58,2oC), màu xanh dương (59o
C), màu cam (60,0oC), màu hồng (61,2oC) và màu xanh ngọc bích (tín hiệu thấp nhất, 63,0o
Hình a thể hiện tín hiệu dương của màu Cy5 trong chứng c4. Hình b thể hiện tín hiệu dương của màu FAM trong chứng c3. Hình c thể hiện tín hiệu dương của màu HEX trong chứng c5.
Đây là kết quả đại diện cho sự thể hiện tín hiệu trong 5 chứng dương ở dãy nhiệt độ từ 57oC đến 63oC. Kết quả này cho thấy sự chệnh lệch Ct của từng mẫu ở các nhiệt độ là không đáng kể nhưng nhiệt độ càng tăng, cường độ tín hiệu huỳnh quang càng giảm. Do đó, nhiệt độ bắt cặp của phản ứng được chọn là 57o
- Đồng thời, nồng độ MgCl2 của phản ứng real-time PCR cũng được khảo sát ở nhiệt độ bắt cặp là 60oC. Có 9 nồng độ độ MgCl2 từ 2mM đến 6mM được khảo sát. Kết quả khảo sát này được minh họa trong Hình 3.17.
a.Cy5, chứng c4 b.FAM, chứng c3
c.HEX, chứng c5
Hình 3.17. Kết quả khảo sát nồng độ MgCl2 của phản ứng real-time PCR với các chứng plasmid.
Hình a thể hiện tín hiệu dương của màu Cy5 trong chứng c4. Hình b thể hiện tín hiệu dương của màu FAM trong chứng c3. Hình c thể hiện tín hiệu dương của màu HEX trong chứng c5.
Nồng độ MgCl2 : 6,0 mM : 5,5 mM : 5,0 mM : 4,5 mM : 4,0 mM : 3,5 mM : 3,0 mM : 2,5 mM : 2,0 mM
Đây là kết quả đại diện cho sự thể hiện tín hiệu trong 5 chứng dương ở dãy nồng độ MgCl2 từ 2mM đến 6mM. Kết quả này cho thấy sự chệnh lệch Ct của từng mẫu ở các nồng độ là không đáng kể nhưng nồng độ càng cao, cường độ tín hiệu huỳnh quang càng tăng. Do đó, nồng độ MgCl2 của phản ứng được chọn là 6mM.
Từ các kết quả khảo sát trên, nhiệt độ lai 57oC và nồng độ MgCl26mM được sử dụng làm điều kiện phản ứng.
3.4.1.3. Kết quả real-time PCR của 42 chủng kháng FQ
42 chủng kháng FQ đã được giải trình tự vùng QRDR của gene gyrA được sử dụng để xác định khả năng phát hiện đột biến của các mẫu dò m90, w90 và w94 trong phản ứng real- time PCR. Kết quả so sánh giữa phản ứng real-time PCR và giải trình tự được tóm tắt trong Bảng 3.3. (Xem thêm phụ lục 2)
Bảng 3.3. Kết quả real- time PCR của 42 chủng kháng FQ so với kết quả giải trình tự Kiểu đột biến Giải trình tự Real-time PCR Hoang dại 10 18 D89N 1 0 A90V 13 8 S91P 0 0 D94X 18 16 Tổng cộng: 42 42
D: aspartic acid, N: asparagine, A: alanine, V: valine, S: serine, P: proline, X: amino acid khác aspartic acid.
Trong 42 chủng này, kết quả giải trình tự cho thấy có đến 12 chủng có chứa peak dị hợp và tùy vào kiểu dị hợp (tín hiệu của peak hoang dại cao hay thấp hơn peak đột biến trong kết quả giải trình tự) mà phản ứng real-time PCR có thể phát hiện được có đột biến hay không. Cụ thể, phản ứng real-time PCR chỉ xác định được 16 chủng mang đột biến D94X, 8 chủng mang A90V và 18 chủng hoang dại trong khi kết quả giải trình tự cho thấy số chủng hoang dại chỉ có 10 và tổng số chủng đột biến (đơn và dị hợp) là 32.
Tín hiệu huỳnh quang của các chủng được kết luận là hoang dại bởi real-time PCR nhưng lại có mang đột biến trong kết quả giải trình tự được trình bày trong Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả real-time PCR và giải trình tự của các chủng có đột biến nhưng thể hiện tín hiệu của chủng hoang dại.
Giải trình tự Kết quả real-time PCR
Chủng Kiểu đột biến Ct Cy5 Ct FAM Ct HEX Ct Cy5-Ct HEX Kết luận
FQ983 A90V* 35.20 - 26.86 8.34 hoang dại FQ984 D94G* 29.96 - 26.07 3.89 hoang dại FQ985 A90V* 31.92 - 25.51 6.41 hoang dại FQ987 A90V / G88A* 37.46 - 26.89 10.57 hoang dại FQ1031 A90V* 33.53 - 25.74 7.79 hoang dại FQ1042 A90V* 29.92 - 24.82 5.10 hoang dại FQ1150 D89N 30.73 - 26.93 3.80 hoang dại FQ1152 D94G* 32.46 - 29.65 2.81 hoang dại
D: aspartic acid, N: asparagine, A: alanine, V: valine, G: glycine, Ct: chu kỳ ngưỡng, Cy5, FAM, HEX: tín hiệu huỳnh quang của các mẫu dò w90, m90 và w94 dùng trong phản ứng real-time PCR. Trong các chủng có đột biến kiểu dị hợp (*), các ký hiệu aa được in đậm trong ký hiệu kiểu đột biến thể hiện tín hiệu cao hơn trong kết quả giải trình tự.
Vì phản ứng real-time PCR không được thiết kế để phát hiện đột biến D89N nên kết quả real-time PCR cho chủng này thể hiện tín hiệu của chủng hoang dại. Các chủng còn lại đều thể hiện kiểu đột biến dị hợp, trong đó các peak hoang dại luôn cao hơn peak đột biến.
Chủng FQ 987 chứa 2 kiểu đột biến, cả 2 vị trí đột biến đều là dị hợp. Tuy peak đột biến tại vị trí codon 88 cao hơn peak hoang dại nhưng phản ứng real-time PCR không thể phát hiện được do sự hạn chếcủa mẫu dò.
Như vậy, phản ứng real-time PCR trên bị giới hạn trong 3 vị trí khảo sát (90,91 và 94) và không phát hiện được các chủng có kiểu đột biến dị hợp mà trong đó peak hoang dại cao hơn peak đột biến cũng như là các chủng có đột biến ở các vị trí khác ba vị trí trên.