- Đối với vùng QRDR của gyrB
4.4. Kết quả phát triển phản ứng real-time PCR phát hiện các đột biến kháng FQ
Sau khi tạo dòng và tối ưu hóa thành công phản ứng real-time PCR, chúng tôi đã kiểm tra khả năng phát hiện đột biến của phản ứng trên 42 chủng kháng FQ đã biết trình tự vùng QRDR của gene gyrA. Sau đó, chúng tôi còn đánh giá hiệu quả của phản ứng trên DNA tách chiết của 40 chủng có kết quả giải trình tự vùng QRDR của gene
gyrA hoang dại và thu được 100% tín hiệu hoang dại.
Dùng kết quả giải trình tự của 82 chủng nói trên làm tiêu chuẩn, chúng tôi tính được độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng real-time PCR tương ứng là 75% và
100%. Độ nhạy của phản ứng như vậy là tương đối thấp. Nguyên nhân của độ nhạy thấp này cũng có thể do đặc thù đột biến của tập hợp chủng đánh giá có nhiều kiểu đột biến dị hợp. Ngoài ra, một nguyên nhân khác là do phản ứng real-time PCR không được thiết kế để phát hiện đột biến D89N mà chỉ giới hạn trong các đột biến tại 3 vị trí khảo sát (A90V, S91P và D94X).
Do vậy, phản ứng đã được cải thiện với chứng dương là DNA bộ gene và khảo sát trên toàn bộ 109 chủng kháng FQ để xác định cách phân tích kết quả sao cho khả năng phát hiện đột biến (kể cả đột biến dị hợp) tăng lên. Sử dụng kết quả giải trình tự làm chuẩn, chúng tôi tính được độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng real-time PCR với chứng dương là DNA bộ gene lần lượt là 90% và 100%.
Như vậy, độ đặc hiệu của phản ứng vẫn được duy trì ở mức 100% trong khi độ nhạy của phản ứng tăng lên đáng kể. Việc tăng độ nhạy của phản ứng có thể được giải thích một phần bởi sự thay đổi trong cấu trúc tập hợp mẫu đánh giá cũng như nhờ sự sử dụng chứng dương là DNA bộ gene. Vì các đường chuẩn (baseline) cho mỗi tín hiệu huỳnh quang được xác định trên các mẫu chứng dương được sử dụng để ghi nhận
tín hiệu trên các mẫu xét nghiệm nên sự tương đồng giữa chứng và mẫu là rất quan trọng.
Tóm lại, phản ứng real-time PCR đã phát triển được trong bài có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Ngoài ra, ưu điểm của phương pháp này là có thể sàng lọc nhanh các đột biến kháng FQ với lượng lớn nhờ thao tác đơn giản và thuận tiện. Hơn nữa, việc phân tích tín hiệu huỳnh quang được máy thực hiện một cách tự động nên rút ngắn được thời gian thao tác cũng như tránh được việc thao tác với ethidium bromide (là một tác nhân gây ung thư) để phát hiện sản phẩm khuếch đại. Nhược điểm của phương pháp này là cần sử dụng thiết bị đắt tiền và tương tự như các phương pháp sử dụng PCR khác là nguy cơ nhiễm do thao tác là có thể xảy ra. Tuy nhiên, nhiễm trong thao tác có thể được hạn chế nhờ thao tác cẩn thận.
5.1. Kết luận
Từ kết quả thu được trong đề tài, chúng tôi rút ra được một số kết luận:
- 78% (85/109) các chủng kháng FQ được phát hiện có mang ít nhất một đột biến liên quan đến tính kháng FQ trên vùng QRDR của gene gyrA. Các đột biến tập trung tại 5 vị trí: G88A, D89N, S91P, A90V và D94X. Các kiểu đột biến này đều đã được phát hiện.
- Tỷ lệ các kiểu đột biến trong vùng QRDR của gene gyrA trong 85 chủng kháng FQ và có đột biến trên vùng gene gyrA là: G88A/A90V-1.2%; D89N-1.2%; A90V-25,9%; S91P-2,4%; D94X-57,6% và 11,8%(10/85) các đột biến kết hợp (A90V/D94A, A90V/D94G, A90V/S91P/D94G-A và S91P/D94G-A).
- 11,9% các chủng kháng FQ trong đề tài có mang đột biến tại 6 vị trí codon trên vùng QRDR của gene gyrB: S486F, D500A, D500N, D500H-G509A, N538T, T539P, E540D, E540V. Các đột biến này đều được phát hiện lần đầu tiên trên thế giới và tại Việt Nam. Một số trình tự được đăng ký trên ngân hàng dữ liệu và có mã truy cập là: GU111541 (gyrB-T539P), GU111542 (gyrB-D500N), GU111543 (gyrB- E540D), GU111544 (gyrB-E540V), GU111545 (gyrB-S486F).
- 82,6% chủng kháng FQ có ít nhất một đột biến trên vùng QRDR của gyrA hay
gyrB.
- 7,3% chủng có đột biến trên cả hai vùng QRDR của gene gyrA và gyrB.
- 17,4% các chủng kháng FQ trong đề tài không chứa đột biến trong cả hai vùng QRDR của gene gyrA và gyrB.
- Kết quả giải trình tự 2 vùng QRDR của gene gyrA và gyrB đặt nền tảng cho các nghiên cứu sâu hơn về tính kháng fluoroquinolone của vi khuẩn lao ở Việt Nam. - Đề tài đã thiết lập thành công quy trình sử dụng phản ứng real-time PCR phát hiện đột biến kháng FQ trên vi khuẩn lao với độ nhạy và độ đặc hiệu lần lượt là 90% và 100% so với phương pháp giải trình tự.
- Phản ứng real-time PCR đã phát triển được trong đề tài có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể sàng lọc nhanh các đột biến kháng FQ với lượng lớn, thao tác đơn giản và thuận tiện.
Như vậy, đề tài đã thực hiện thành công các mục tiêu đề ra.
5.2. Đề nghị
Để mở rộng và phát triển đề tài, chúng tôi đề nghị tiếp tục tiến hành các nghiên cứu sau:
- Khảo sát các cơ chế kháng fluoroquinolone khác đột biến trên gene gyrA và
gyrB trên tập hợp chủng kháng fluoroquinolone, đặc biệt là trên các chủng không có
đột biến trên 2 vùng QRDR của gene gyrA và gyrB.
- Khảo sát tính ứng dụng của phản ứng real-time PCR đã thiết lập được trực tiếp trên các loại bệnh phẩm (đàm, dịch não tủy …).
- Khảo sát tỷ lệ kháng fluoroquinolone ở Việt Nam, đặc biệt là trên nhóm bệnh nhân nguy cơ cao như bệnh nhân lao đa kháng thuốc, bệnh nhân lao màng não, bệnh nhân lao tái trị …
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ Y Tế, C. t. c. l. q. g., Dự án quản lý bệnh lao kháng thuốc. 2008. Tập
huấn triển khai dự án quản lý bệnh lao kháng thuốc tại Tp Hồ Chí Minh.
2. Dương Duy An. 2006. Tìm hiểu sự kháng thuốc ở vi khuẩn lao Mycobacterium
tuberculosis mức phân tử. Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh-Đại học khoa học tự nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh.
Tài liệu tiếng Anh
3. A.N. Umubyeyyi, L. R., I.C.Shamputa, K. Fissette, Y. Elkrim, P. W. B. de Rijk, M. J. Strulens, F. Portaels. 2007. Limited fluoroquinolone resistance
among Mycobacterium tuberculosis isolates from Rwanda: redults of a national survey. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 59:1031-1033.
4. Alangaden GJ, M. E., Vakulenko SB, et al. 1995. Characterization of
fluoroquinolone-resistant mutant strains of Mycobacterium tuberculosis selected in the laboratory and isolated from patients. Antimicrobial Agents Chemotherapy 39:1700-03.
5. Alvirez-Freites EJ, C. J., Cynamon MH. 2002. In vitro and in vivo activities
of gatifloxacin against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother 46:1022-25.
6. Amy Sarah Ginsburg, Jacques H Grosset, and W. R. Bishai. 2003.
Fluoroquinolones, tuberculosis, and resistance. The LANCET Infectious Diseases 3:432-441.
7. Andrea Von Groll, A. M., Pontus Jureen, Sven Hoffner, Peter Vandamme, Francoise Portaels, Juan Carlos Palomino, Pedro Almeida Da Silva. 2009.
Fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis and mutations in
gyrA and gyrB. Antimicrob Agents Chemother doi:10.1128/AAC.00287-09.
8. Aubry, A., N. Veziris, E. Cambau, C. Truffot-Pernot, V. Jarlier, and L. M. Fisher. 2006. Novel gyrase mutations in quinolone-resistant and -
hypersusceptible clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis: functional analysis of mutant enzymes. Antimicrob Agents Chemother 50:104-12.
9. Ben Yang Zhao, R. P., John Domagala, Karl Drlica. 1999. Fluoroquinolone
Action against Clinical Isolates of Mycobacterium tuberculosis: Effects of a C- 8 Methoxyl Group on Survival in Liquid Media and in Human Macrophages. ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY 43:66-666.
10. Berning, S. E. 2001. The Role of Fluoroquinolones in Tuberculosis Today.
11. Bloom, B. R. 1994. Tuberculosis - Pathogenesis, Protection, and Control. ASM
Press, Washington, DC, USA.
12. Blower S. M., C. T. 2004. Modeling the emergence of the "hot zones":
tuberculosis and the amplification dynamics of drug resistance. Nature Medicine 10:1111-1116.
13. Bozeman L, B. W., Metchock B, et al. 2002. Fluoroquinolone susceptibility
among selected Mycobacterium tuberculosis isolates from the United States and Canada. American Journal of Respiratory Criteria Care Medicine 165:(suppl): A18.
14. Brock, T. D. 1999. Robert Koch, A life in Medicine and Bacteriology. ASM
Press, Washington, DC, USA.
15. Cambau E, J. V. 1996. Resistance to quinolones in mycobacteria. Respiratory
Microbiology 147:52-59.
16. Cambau E, W. S., M.Basson, C. Truffot-Pernot, J. Grosset, V. Jarlier.
1994. Selection of a gyrA mutant of Mycobacterium tuberculosis resistant to fluoroquinolones during treatment with ofloxacin. Journal of Infectiuos Diseases 170:479-483.
17. Camus Jean-Christophe, M. J. P., Claudine Mdigue, and Stewart T. Cole.
2002. Re-annotation of the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Microbiology 148:2967 - 2973.
18. Cheng, A. F., W. W. Yew, E. W. Chan, M. L. Chin, M. M. Hui, and R. C. Chan. 2004. Multiplex PCR amplimer conformation analysis for rapid
detection of gyrA mutations in fluoroquinolone-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates. Antimicrob Agents Chemother 48:596-601.