- Đối với vùng QRDR của gyrB
91P-R 5’ GGGCTTCGGTGTACCTC ATC CAC CAG GCT GTC GTA GAT CGG CGC GTC GCC GTG CGG GTG GTA GTT
GTA GAT CGG CGC GTC GCC GTG CGG GTG GTA GTT GCC CAT GGT CTC 3’
Trình tự gene gyrA (GenBank NC 000962) của vi khuẩn lao được sử dụng làm bản mẫu để thiết kế các đoạn mồi gyrA-3F, gyrA-4R bởi phần mềm Primer Express 2.0 (Applied Biosystems, USA).
Các mẫu dò m90 (F), w90 (F) và w94 (R) là các mẫu dò hoạt động theo nguyên tắc của mẫu dò Taqman để bắt lên các trình tự đột biến tại vị trí codon 90 (mẫu dò m90, bắt cặp từ nu 266 đến nu 279), trình tự hoang dại tại vị trí codon 90 (mẫu dò w90, bắt cặp từ nu 267 đến nu 279) và codon 94 (mẫu dò w94, bắt cặp từ nu 275 đến nu 288) trên gene gyrA của vi khuẩn lao. Các mẫu dò này đều chứa các nucleotide (nu) đặc biệt gọi là locked nucleic acid (LNA, được biểu diễn dưới dạng in đậm và gạch dưới trong Bảng 2.8). Các LNA này được thiết kế tại các vị trí gần hay tại vị trí nu có
thể bị đột biến nhằm gia tăng khả năng bắt cặp và phân biệt trình tự của các mẫu dò. Cấu trúc của LNA được trình bày trong Hình 2.4.
Bz-A-LNA 5-Me-Bz-C-LNA dmf-G-LNA T-LNA
Hình 2.4. Cấu trúc của locked nucleic acid (LNA)
Hai mẫu dò m90 và w90 được thiết kế mang tính cạnh tranh nhau vì chúng bắt lên cùng một mạch và có trình tự tương tự nhau. Điểm khác biệt của 2 mẫu dò này là tại vị trí nu 269 của gene gyrA, mẫu dò m90 sẽ mang nu T (tương ứng với codon đột biến tại vị trí 90, mã hóa cho valine (V)) trong khi mẫu dò w90 sẽ mang nu C (tương ứng với codon hoang dại tại vị trí 90, mã hóa cho alanine (A)). Nếu có đột biến tại codon 91(làm thay codon mã hóa cho serine (S) trong chủng hoang dại thành proline (P) trong chủng đột biến) thì sự bắt cặp của hai mẫu dò này bị cản trở (do có mis- match tại nu 271). Do vậy, với cặp mẫu dò này, phản ứng cũng sẽ phát hiện được đột biến tại codon 91.
Ngoài ra, tại vị trí codon 95 của gene gyrA trên vi khuẩn lao có một điểm đa hình đơn (AGC Æ ACC) không liên quan đến tính kháng FQ nên một hỗn hợp mẫu dò w94 đã được tổng hợp để phản ứng xảy ra đối với cả 2 kiểu đa hình. Trình tự trong
hỗn hợp mẫu dò w94 này chỉ khác nhau ở một nu và được ký hiệu là S (nghĩa là hoặc G hoặc C) trong trình tự trong Bảng 2.8. Mẫu dò w94 này được thiết kế để bắt cặp với mạch tới trên DNA bản mẫu nhằm giảm thiểu tính cạnh tranh bắt cặp với 2 mẫu dò m90 và w90. Nếu trình tự DNA bản mẫu có mang đột biến tại codon 94 của gene gyrA thì mẫu dò w94 sẽ không thể bắt cặp được và sẽ không phát tín hiệu huỳnh quang.
Tín hiệu huỳnh quang lý thuyết tương ứng cho từng kiểu đột biến có thể phát hiện được trên vùng QRDR của gene gyrA trong phản ứng real-time PCR với các mẫu dò trên được tóm tắt trong Bảng 2.9.
Bảng 2.9. Tín hiệu huỳnh quang trong phản ứng real-time PCR tương ứng với kiểu đột biến trên vùng QRDR của gene gyrA ở vi khuẩn lao
Kiểu đột biến HEX (w94) Cy5 (w90) FAM (w90)
Hoang dại + + -
Hoang dại (S95T) + + -
A90V + - +
D94G - + -
S91P + - -
Như vậy, trong mỗi phản ứng real-time PCR có DNA bản mẫu của vi khuẩn lao thì luôn có sự hiện diện của ít nhất một màu huỳnh quang.
Nhiệt độ nóng chảy của mẫu dò LNA được xác định qua trang web Exiqon (http://lna-tm.com , Exiqon A/S, Đan Mạch).
Trang web http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold được dùng để kiểm tra khả năng tạo cấu trúc kẹp tóc của mồi và mẫu dò.
Bởi vì trong giai đoạn thiết kế mồi, kết quả giải trình tự vùng QRDR của gene
gyrA cho thấy chưa có kiểu đột biến S91P nên hai trình tự 91P-F và 91P-R được tổng
hợp nhân tạo để đưa vào plamid nhằm tối ưu hóa phản ứng real-time PCR. Hai trình tự này được thiết kế dựa trên trình tự của đoạn QRDR của gene gyrA và có chứa một vị trí đột biến tương ứng với đột biến tại codon 91 (TCG ÆCCG) chuyển S thành P. Trình tự của 91P-F và 91P-R đều bắt đầu và kết thúc bởi trình tự của cặp mồi gyrA-3F và gyrA-4R, tương ứng với nu 235 (codon 79) đến nu 397 (codon 104).
Sản phẩm khuếch đại của cặp mồi gyrA-3F và gyrA-4R trên mạch khuôn là DNA bộ gene của vi khuẩn lao có độ dài 163 bp. Sản phẩm khuếch đại của cặp mồi gyrA-3F và gyrA-4R trên bản mẫu là trình tự 91P-F và 91P-R có độ dài là 77 bp.
2.3.3.2. Tạo dòng để tạo các mẫu chứng dương bằng plasmid cho phản ứng real-time PCR phát hiện đột biến kháng FQ
a. Vật liệu
DNA của chủng vi khuẩn lao H37Rv và 3 mẫu lâm sàng (DNA của chúng đã được tách chiết và giải trình tự vùng QRDR gyrA và biết có mang các đột biến tương ứng là S95T (đa hình), D94G và A90V) được sử dụng làm bản mẫu trong tạo dòng.
Trình tự của cặp oligonucleotide 91P-F và 91P-R (Bảng 2.8) cũng được sử dụng làm bản mẫu để khuếch đại trình tự chứa đột biến S91P để tạo dòng plasmid.
Các plasmid này sau khi tạo dòng sẽ được sử dụng để tối ưu hóa điều kiện của phản ứng real-time PCR và làm chứng dương trong quy trình sử dụng phản ứng real- time PCR phát hiện đột biến kháng FQ.
b. Hóa chất và thiết bị
- BIOTAQ DNA polymerase (Bioline) - Dung dịch đệm NH4 10X (Bioline) - Dung dịch MgCl2 (Bioline)
- Dung dịch chứa dNTP các loại (Roche)
- Bộ kít pCR2.1-TOPO vectors (plasmid TA dạng thẳng có gene kháng ampicillin, plasmid TA dạng vòng sẽ tạo được LacZα) (Invitrogen)
- Chủng vi khuẩn khả nạp Escherichia coli DH5α (nhạy cảm với ampicillin,
mất khả năng tạo LacZα ) (Invitrogen)
- Dung dịch MgCl2 dùng trong hóa biến nạp (Merck) - Môi trường LB thạch và LB lỏng (Sigma)
- Ampicillin (Sigma) - X-gal (Bio-Rad)
- Bộ kít tách chiết gel QIA quick gel extration kit (Qiagen) - Máy luân nhiệt DNA Engine Tetrad 2 Thermocycler (Bio-Rad) - Tủ ấm 37o
C
c. Các bước tiến hành
Bước 1: Thực hiện phản ứng PCR để tạo các đoạn DNA mục tiêu từ khuôn DNA bộ gene có các trình tự tương ứng.
Phản ứng được thực hiện với cặp mồi gyrA-3F và gyrA-4R (Bảng 2.8) trên các chủng H37Rv (hoang dại), FQ1031 (hoang dại, có điểm đa hình S95T), FQ 1043 (mang đột biến A90V), FQ1094 (mang đột biến D94G) và cặp trình tự P91-F, P91-R (Bảng 2.8).
- Thành phần phản ứng PCR và chương trình luân nhiệt của phản ứng lần lượt trình bày trong Bảng 2.10 và Bảng 2.11.
Bảng 2.10. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại vùng QRDR của gene gyrA Thành phần phản ứng Nồng độ phản ứng Thể tích cho 1 phản ứng Nước ELGA 14,6 µl GYRA-3F 0,2 µM 2 µl GYRA-4R 0,2 µM 2 µl Dung dịch đệm (10X) 1X 2,5 µl Hỗn hợp dNTP 0,2 mM 2 µl MgCl2 1.5 mM 0,75 µl Taq polymerase 0,75 U 0,15 µl DNA bảng mẫu 15 ng/ µl 1 µl Tổng cộng: 25 µl
Bảng 2.11. Chương trình luân nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại vùng QRDR của gene gyrA
Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
94oC 2 phút 1 94oC 30 giây 65oC 30 giây 72oC 30 giây 40 72oC 2 phút 1
- Sản phẩm PCR sau đó được điện di trong gel agarose 1,5 % để kiểm tra.
- Tinh sạch sản phẩm PCR thu được với bộ kít tinh sạch DNA QIAgen (QIAgen) theo quy trình đã nêu trong quy trình giải trình tự.
Bước 2: Nối các đoạn DNA mục tiêu vào vector TA và biến nạp các plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli DH5α (Invitrogen).
- Thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất với thành phần phản ứng nối được trình bày trong Bảng 2.12.
Bảng 2.12. Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR với vector TA để tạo ra plasmid tái tổ hợp.
Thành phần phản ứng Thể tích phản ứng
Sản phẩm PCR đã tinh sạch 4 µl
Dung dịch muối (TOPO-TA kit) 1 µl Dung dịch chứa vector TA (TOPO-TA kit) 1 µl
Phản ứng nối được thực hiện ở nhiệt độ phòng, trong 5 phút.
- Thực hiện hóa biến nạp các plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α khả nạp bằng MgCl2 và sốc nhiệt.
- Cấy trãi trên môi trường LB có chứa ampicillin và X-gal để chọn lọc các khuẩn lạc có mang plasmid tái tổ hợp.
Bước 3: Chọn lọc và làm giàu các dòng E.coli DH5α có mang plasmid tái tổ hợp và kiểm tra sự hiện diện của đoạn DNA mục tiêu.
- Chọn lọc các dòng E.coli DH5α có mang plasmid tái tổ hợp theo nguyên tắc của sàng lọc khuẩn lạc trắng/xanh trên môi trường có X-gal và ampicillin:
• Chọn lọc các khuẩn lạc có màu trắng. Vì nếu dòng vi khuẩn có chứa plasmid tái tổ hợp thì sự hình thành enzyme β-galactosidase hoạt động bị ngăn cản (do chỉ có tiểu phần LacZΩ được tạo ra bởi vi khuẩn E.coli DH5α). Do đó, dòng vi khuẩn này không thể chuyển hóa X-gal (tan, không màu).
• Nếu dòng khuẩn lạc chứa plasmid tự gắn kết, chúng sẽ có màu xanh do sự bổ sung của tiểu phần LacZα sẽ tạo ra β-galactosidase hoạt động. β- galactosidase sẽ chuyển hóa X-gal thành 5-bromo-4 chloroindole (không tan, có màu xanh).
• Dòng vi khuẩn không chứa plasmid không mọc được trên môi trường chọn lọc.
- Thu nhận các khuẩn lạc trắng (trung bình 5 khuẩn lạc cho mỗi sản phẩm PCR) và kiểm tra sự tồn tại của trình tự đích trong các khuẩn lạc này bằng cách tiến hành phản ứng PCR với thành phần và chương trình luân nhiệt trình bày trong Bảng 2.10 và
Bảng 2.11.
- Điện di sản phẩm PCR trong gel agarose 1,5%.
- Nuôi cấy làm giàu các dòng vi khuẩn chứa trình tự mục tiêu.
Bước 4: Tách chiết và tinh sạch các plasmid tái tổ hợp.
- Tách chiết plasmid theo qui trình cải biên từ phương pháp của Birnboim và Doly (1979) và Ish Horowicz và Burke (1981).
- Điện di plasmid tái tổ hợp trong gel agarose 0,8%.
- Tinh sạch plasmid tái tổ hợp từ gel bằng bộ kít QIA quick gel extration kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Kiểm tra sự hiện diện của trình tự mục tiêu trên các plasmid tái tổ hợp thu được bằng cách thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi dùng khuếch đại sản phẩm trước khi tạo dòng.
2.3.3.3. Phản ứng real-time PCR với các mẫu chứng dương là plasmid
a. Hóa chất và thiết bị - Nước cất (ELGA)
- DNA polymerase HotStar Taq (Qiagen) - Dung dịch đệm PCR 10X (Qiagen) - Dung dịch MgCl2 25mM (Qiagen) - Dung dịch chứa dNTP các loại (Roche)
- Máy luân nhiệt DNA Engine Peltier Thermocycler (Bio-Rad) - Máy dò Chromo4 RT PCR detector (Bio-rad)
b. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng
Tương tự như phản ứng PCR thông thường, phản ứng real-time PCR cần được tối ưu hóa các điều kiện phản ứng để đạt hiệu quả cao. Theo nguyên tắc, tất cả các thành phần trong phản ứng real-time PCR đều phải được tối ưu. Tuy nhiên, có 2 thành phần quan trọng nhất cần được tối ưu là nhiệt độ bắt cặp của phản ứng và nồng độ MgCl2.
- Để tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp của phản ứng, các gradient nhiệt độ bắt cặp lần lượt được sử dụng với thành phần phản ứng trình bày trong Bảng 2.13.
Bảng 2.13. Thành phần phản ứng real-time PCR dùng trong tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp của phản ứng real-time PCR. Thành phần phản ứng Nồng độ phản ứng Thể tích cho 1 phản ứng Nước cất 7,35 µl Dung dịch đệm (có MgCl2 15mM) 1X 2,5 µl Mồi gyrA-3F 0,2 µM 2 µl Mồi gyrA-4R 0,2 µM 2 µl dNTP các loại 0,2 mM 2 µl Mẫu dò w90 0,15 µM 1,5 µl Mẫu dò m90 0,15 µM 1,5 µl Mẫu dò w94 0,15 µM 1,5 µl MgCl2 25mM 3,5 mM 3,5 µl Hotstar Taq 0,75 U 0,15 µl DNA bản mẫu 1 µl Tổng cộng: 25 µl
Vì nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các mẫu dò m90, w90 và w94 lần lượt là 69o C, 71oC và 64oC nên gradient nhiệt độ bắt cặp đầu tiên được sử dụng là 64,0o
C, 65,4oC, 67,4oC, 68,8oC, 70,8oC và 72,0oC.
Gradient nhiệt độ bắt cặp được sử dụng trong lần thứ hai bao gồm 58,0o C, 60,2oC, 61,6oC, 63,6oC, 67,6oC và 70,0oC.
Gradient nhiệt độ bắt cặp được sử dụng trong lần thứ ba bao gồm 57,0o C, 58,2oC, 59,0oC, 60,0oC, 61,2oC, 63,0oC.
Chương trình luân nhiệt tương ứng được sử dụng trong tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp được tóm tắt trong Bảng 2.14.
Bảng 2.14. Chương trình luân nhiệt tương ứng được sử dụng trong tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp của phản ứng real-time PCR
Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
95oC 15 Phút 1 lần 95oC 30 giây 57oC - 72oC 30 giây 72oC 30 giây Đọc tín hiệu 40 c hu k ỳ
- Để tối ưu hóa nồng độ MgCl2, thành phần phản ứng như trong Bảng 2.15
Bảng 2.15. Thành phần phản ứng real-time PCR dùng trong tối ưu hóa nồng độ MgCl2 của phản ứng real-time PCR. Thành phần phản ứng Nồng độ phản ứng Thể tích cho 1 phản ứng Nước cất 10,35-6,35 µl Dung dịch đệm (có MgCl2 15mM) 1X 2,5 µl Mồi gyrA-3F 0,2 µM 2 µl Mồi gyrA-4R 0,2 µM 2 µl dNTP các loại 0,2 mM 2 µl Mẫu dò w90 0,15 µM 1,5 µl Mẫu dò m90 0,15 µM 1,5 µl Mẫu dò w94 0,15 µM 1,5 µl MgCl2 25mM 0,5-4,5 mM 0,5-4,5 µl Hotstar Taq 0,75 U 0,15 µl DNA bản mẫu 1 µl Tổng cộng: 25 µl
Bảng 2.16. Chương trình luân nhiệt tương ứng được sử dụng trong tối ưu hóa nồng độ MgCl2 của phản ứng real-time PCR.
Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
95oC 15 Phút 1 lần 95oC 30 giây 60oC 30 giây 72oC 30 giây Đọc tín hiệu 40 c hu k ỳ
c. Cách tiến hành phản ứng
- Thành phần phản ứng real-time PCR được trình bày trong Bảng 2.17.
Bảng 2.17. Thành phần phản ứng real-time PCR phát hiện đột biến kháng FQ
Thành phần phản ứng Nồng độ phản ứng Thể tích cho 1 phản ứng Nước cất 6,85 µl Dung dịch đệm (có MgCl2 15mM) 1X 2,5 µl Mồi gyrA-3F 0,2 µM 2 µl Mồi gyrA-4R 0,2 µM 2 µl dNTP các loại 0,2 mM 2 µl Mẫu dò w90 0,15 µM 1,5 µl Mẫu dò m90 0,15 µM 1,5 µl Mẫu dò w94 0,15 µM 1,5 µl MgCl2 25mM 4,5 mM 4,5 µl Hotstar Taq 0,75 U 0,15 µl DNA bản mẫu 7,5 ng 0,5 µl Tổng cộng: 25 µl
- Mỗi lần pha hỗn hợp phản ứng, cần pha thêm 6 phản ứng tương ứng với 5 chứng dương (DNA bản mẫu là các plasmid tái tổ hợp chứa các đoạn DNA tương ứng với trình tự của các QRDR của gene gyrA) và 1 chứng âm (nước). Các chứng dương và tín hiệu huỳnh quang tương ứng với các kiểu đột biến được thể hiện trong Bảng 2.18.
Bảng 2.18. Tín hiệu huỳnh quang của các chứng dương là plasmid trong phản ứng real-time PCR.
Chứng dương Kiểu đột biến HEX Cy5 FAM
Plasmid 1 Hoang dại + + -
Plasmid 2 Hoang dại (S95T) + + -
Plasmid 3 A90V + - +
Plasmid 4 D94G - + -
Plasmid 5 S91P + - -
- Cài đặt chương trình luân nhiệt và dò tìm tín hiệu cho các chất phát huỳnh quang HEX, FAM và Cy5 theo Bảng 2.19.
Bảng 2.19. Chương trình phản ứng real-time PCR phát hiện đột biến kháng FQ
Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
95o C 15 Phút 1 lần 95o C 30 giây 57o C 30 giây 72o C 30 giây Đọc tín hiệu 40 c hu k ỳ
- Sau khi phản ứng kết thúc, điều chỉnh đường baseline cho từng tín hiệu huỳnh quang dựa trên tín hiệu của các mẫu chứng dương:
• Đường baseline của Cy5 nằm cao hơn tín hiệu Cy5 trong chứng chứa plasmid 5.
• Đường baseline của HEX phải nằm ở khoảng giữa của đường cong thể hiện tín hiệu HEX trong chứng của plasmid 1.
• Đường baseline của FAM phải nằm ở khoảng giữa của đường cong thể hiện tín hiệu FAM trong chứng của plasmid 3.
- Ghi nhận tín hiệu huỳnh quang cho từng mẫu.
- Phân tích kết quả của từng mẫu tương ứng với tín hiệu huỳnh quang thông qua các giá trị Ct Cy5, Ct FAM, Ct HEX, và (Ct Cy5 – Ct HEX).
• Giá trị Ct của các màu huỳnh quang thể hiện sự dương tính (+) của màu tương ứng, không có Ct nghĩa là âm tính (-) với màu huỳnh quang đó. Trong đó, Ct là chu kỳ ngưỡng được xác định là điểm giao nhau giữa