Nội dung và phạm vi của đề tà
2.3.2. Giải trình tự vùng QRDR của gene gyrA và gyrB
2.3.2.1. Hóa chất và thiết bị
a. Hóa chất
- Dung dịch đệm cho PCR 10X Bioline
- dATP, dTTP, dGTP, dCTP Roche
- Dung dịch MgCls 50mM Bioline
- Mồi Proligo-Sigma
- Enzyme Taq polymerase Bioline
- Cồn 100% Merck
- Dung dịch NaOAc (Wako) 3M pH 5,2 24.61 g NaOAc
100ml nước ELGA
Đo và chỉnh pH, trữ ở nhiệt độ phòng - Dung dịch EDTA (Prolabo) 100mM pH 8,0
3.72 g EDTA 100ml nước ELGA
Đo và chỉnh pH, trữ ở nhiệt độ phòng
- Bộ Kit tinh sạch DNA QIAgen (QIAgen quick PCR purification) gồm: Cột spin QIAguick
Dung dịch PB (binding buffer) Dung dịch rửa PE (washing buffer)
Hình 2.3. Ảnh điện di của thang khối lượng chuẩn
- Kit phản ứng PCR-giải trình tự (Beckman Coulter) có chứa các ddNTP được đánh dấu thuốc nhuộm phát huỳnh quang, gồm:
_ Hỗn hợp phản ứng PCR-giải trình tự, có chứa: dung dịch đệm, polymerase, dNTP các loại và ddNTP các loại đã được đánh dấu.
_ Glycogen (20mg/ml) _ Dầu khoáng
_ Dung dịch nạp mẫu (SLS Sample Loading Solution). b. Thiết bị
- Máy PCR (DNA Engine TETRAD®2, Peltier Thermal Cycler, 4 block, hãng Biorad, Mỹ)
- Máy giải trình tự (CEQTM
8000 Genetic Analysis System, hãng BECKMAN COULTER, Mỹ)
- Máy vi tính
- Máy ly tâm (Centrifuge 5415D, hãng Eppendorf, Đức) - Máy ly tâm lạnh (Centrifuge 5415R, hãng Eppendorf, Đức) - Máy vortex (Vortex – Genie 2, hãng JENCONS-PLS)
- Máy hút chân không (DNA 120 Speed Vac, hãng ThermoSavant, Mỹ) - Bộ nguồn điện di (Power PAC 300, hãng Biorad, Mỹ)
- Pipettman (GILSON, Pháp) và các loại đầu tip tương ứng.
- Các loại tube 0,2ml; 0,5ml; 1,5ml … (tube có vách mỏng để chạy PCR, tube có nắp vặn, eppendorf)
2.3.2.2. Quy trình thực hiện giải trình tự
Bước 1: Khuếch đại sản phẩm cần giải trình tự bằng phản ứng PCR chuyên biệt cho từng vùng cần giải trình tự