Nội dung và phạm vi của đề tà
2.3.1.Tách chiết DNA bộ gene bằng phương pháp Lysosome/CTAB
Các chủng vi khuẩn lao thu từ bệnh nhân được nuôi cấy, giữ mẫu và ly trích DNA để phục vụ cho các nghiên cứu sinh học phân tử bởi các kỹ thuật viên.
Phần này sẽ trình bày phương pháp tách chiết DNA bộ gene của vi khuẩn lao đã qua nuôi cấy.
2.3.1.1. Hóa chất và thiết bị
a. Hóa chất
- Trizma base (Tris) Life technologies
- Clohydric acid (HCl) Merck
- Sodiumhydroxid (NaOH) Merck
- Sodium dodecyl sulphate (SDS) Rose Chemicals LTD - Sodium cloride (NaCl) Shantou Guanghua
- Lysozyme Bioline
- Proteinase K Bioline
- Chloroform Merck
- Isoamyl alcohol Merck
- Ethanol Merck
- Sodium ethylenediamine-tetra-acetic acid Life technologies - Cetyltrimetyl ammonium bromide (CTAB) Amresco
b. Cách pha hóa chất
1. Dung dịch đệm TE (10 mM Tris và 1 mM EDTA): - Pha dung dịch đệm Tris 1,0 M:
121,1 g Trizma base (Tris) 1,0 lít nước ELGA
Hấp khử trùng, trữ ở nhiệt độ phòng. - Pha dung dịch EDTA 0,5 M:
37,2 g Na2EDTA (Sodium ethylenediamine-tetra-acetic acid) 150 ml nước ELGA
4 g NaOH tủa để chỉnh pH
Điều chỉnh pH về 8,0 bằng dung dịch NaOH trước rồi thêm nước cho đủ 200 ml
Hấp khử trùng, trữ ở nhiệt độ phòng.
- Dung dịch đệm TE (10 mM Tris và 1 mM EDTA): 50 ml nước ELGA
100 ml Tris 1,0 M pH 8,0 20 ml EDTA 0,5 M pH 8,0
Điều chỉnh pH về 8,0 bằng dung dịch HCl hay NaOH, nếu cần. Chỉnh thể tích về 200ml bằng nước.
Hấp khử trùng, trữ ở nhiệt độ phòng
2. Dung dịch Lysozyme (10 mg/ml): pha mới mỗi khi sử dụng. 3. Protenase K (10 mg/ml)
4. Dung dịch SDS 20% (w/v trọng lượng/thể tích) 100 g SDS
400 ml nước ELGA
Dung dịch này mờ đục, chỉnh pH về 7,2 bằng dung dịch HCl. Chỉnh thể tích về 500 ml.
Trữ ở nhiệt độ phòng, không cần hấp khử trùng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lưu ý: Nếu dung dịch vẫn còn đục, hay trở nên đục trong tương lai thì làm ấm dung dịch bằng cách ủ ở nhiệt độ 50-65oC đế hòa tan SDS trước khi sử dụng.
29,22 g NaCl
100ml nước ELGA
Trữ ở nhiệt độ phòng.
6. Dung dịch CTAB 5%: (Cetyltrimetyl ammonium bromide)
5,0 g CTAB (5% w/v)
2,9 g NaCl (0,5 M)
Hòa trong 80 ml nước cất Làm nóng bởi nhiệt độ 65o
C
Điều chỉnh thể tích về 100ml bằng nước cất. 7. Dung dịch Chloroform:isoamyl alcohol (24:1):
96 ml chloroform 4 ml isoamyl alcohol Trữ ở 4o C. 8. Isopropanol 9. Ethanol 70% (-20oC) c. Thiết bị
- Máy ly tâm (Centrifuge 5415D, hãng Eppendorf, Đức) - Máy vortex (Vortex – Genie 2, hãng JENCONS-PLS) - Pipettman (GILSON, Pháp) và các loại đầu tip tương ứng. - Tube 1,5ml (eppendorf)
- Cân điện tử (OHAUS® ) - Tủ lạnh 4o
C - Tủ lạnh -20o
C.
2.3.1.2. Quy trình thực hiện việc tách chiết DNA bộ gene
- Thu nhận 1 đến 2 vòng vi khuẩn và hòa trộn vào dung dịch TE. - Ủ ở 80oC trong 20 phút. Chờ các ống trở về nhiệt độ phòng.
- Pha dung dịch lysozyme mới (10mg/ml). Thêm 50µl lysozyme vào mỗi ống, vortex.
- Ủ ở 37o qua đêm.
- Thêm 10µl proteinase K (10mg/ml) và 35µl dung dịch SDS 20% (trọng lượng/ thể tích) vào mỗi ống, vortex.
- Ủ ở 55o
C trong 30 phút.
- Bổ sung 100µl dung dịch NaCl 5M, vortex.
- Bổ sung 100µl dung dịch CTAB 5% và vortex cho đến khi dung dịch có màu trắng đục.
- Ủ ở 65o
C trong 15 phút.
- Chờ cho các ống trở về nhiệt độ phòng, bổ sung 700µl dung dịch chloroform : isoamyl alcohol (24:12), vortex.
- Ly tâm 13200 vòng/phút trong 5 phút.
- Hút cẩn thận 600µl lớp nước trên cùng cho vào eppendorf mới. - Bổ sung 360µl isopropanol để tủa DNA.
- Đảo ngược ống vài lần rồi giữ ở -20oC ít nhất 30 phút. - Ly tâm 13200 vòng/phút trong 15 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Bỏ dịch trong. Thêm 1,0ml cồn 70% lạnh vào.Đảo ống một lần. - Ly tâm 13200 vòng/phút trong 7 phút.
- Cẩn thận loại bỏ dịch trong.
- Ly tâm 13200 vòng/phút trong 2 phút. Loại bỏ chất lỏng còn sót lại. - Để ống mở nắp ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô hoàn toàn.
- Thêm lượng TE phù hợp vào từng ống, trộn đều. Để ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ hay qua đêm ở 4o
C.
Nếu thấy có tủa Æ thêm 35µl TE
Nếu có tủa lớn Æ 40-80µl TE
- Tất cả các mẫu DNA tách chiết được bảo quản ở -20oC. Các mẫu đã được pha loãng để sử dụng thì được bảo quản ở 4o
C.