Ứng dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang và phân tích hình ảnh tế bào trong đánh giá hoạt tính chống ung thư (ung thư gan và ung thư cổ tử cung)

Khóa luận sử dụng trang thiết bị từ dự án đầu tư phòng thí nghiệm trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KHCNVN về thử nghiệm hoạt tính sinh học và nội dung nghiên cứu thuộc Đề tài "Phát triển kỹ t

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

HÀ NỘI - 2019

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN KIM PHƯỢNG

Mã sinh viên: 1401488

ỨNG DỤNG KĨ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG VÀ PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH TẾ BÀO TRONG ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG UNG THƯ (UNG THƯ GAN VÀ UNG THƯ CỔ TỬ CUNG)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới quý Thầy, Cô trong Ban giám hiệu cùng toàn thể các giảng viên Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình giảng dạy và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong suốt thời gian em theo học chương trình đào tạo dược sĩ đại học hệ chính quy khóa 69

Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi lời cảm ơn tới GS.TS Phạm Quốc

Long – Viện trưởng Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên (Viện Hàn lâm

KHCNVN) cùng PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển – Trưởng bộ môn Dược học cổ

truyền (Trường Đại học Dược Hà Nội) đã thu nhận, hướng dẫn em tận tình cũng như góp ý nhiều nội dung quý báu từ khi nghiên cứu đề tài đến khi hoàn thành khóa luận này

Em cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Đỗ Hữu Nghị –

trưởng phòng Sinh học thực nghiệm – Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên cũng như các cô chú, anh chị tại phòng Sinh học thực nghiệm đã giúp đỡ, hướng dẫn và tạo điều kiện cho em thực hiện nghiên cứu này Khóa luận sử dụng trang thiết bị từ

dự án đầu tư phòng thí nghiệm trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KHCNVN về thử

nghiệm hoạt tính sinh học và nội dung nghiên cứu thuộc Đề tài "Phát triển kỹ thuật phân tích hình ảnh hiển vi huỳnh quang nội hàm cao phục vụ sàng lọc, đánh giá các hợp chất có hoạt tính chống ung thư mức độ tế bào và hướng đích phân tử "

(VAST 04.05/18-19; Chủ nhiệm ĐT: TS Đỗ Hữu Nghị)

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn hạn chế, khóa luận này không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô cùng với những người quan tâm để nội dung khóa luận được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Nguyễn Kim Phượng

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Tổng quan về ung thư 3

1.2 Sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học 5

1.3 Sàng lọc hoạt tính dựa trên phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào 7

1.4 Phương pháp điều trị ung thư hướng đích phân tử 9

1.5 Tổng quan về yếu tố nhân NF-κB liên quan quá trình viêm và ung thư 10

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Phạm vi, đối tượng nghiên cứu 13

2.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 13

2.2.1 Dòng tế bào 13

2.2.2 Môi trường nuôi cấy tế bào 13

2.2.3 Mẫu thử nghiệm 13

2.2.4 Thiết bị 14

2.3 Nội dung nghiên cứu 15

2.4 Phương pháp nghiên cứu 15

2.4.1 Phương pháp nuôi cấy và hoạt hóa tế bào 15

2.4.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế sự tăng sinh tế bào 16

2.4.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống ung thư đích phân tử NF-κB 17

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20

3.1 Sàng lọc hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thư: 20

3.2 Đánh giá hoạt tính chống ung thƣ đích phân tử NF-κB trên dòng tế bào HeLa

24

3.2.1 Kích thích chuyển vị NF-κB 24

3.2.2 Thu nhận hình ảnh huỳnh quang 25

3.2.3 Thiết lập thông số phân tích hình ảnh 27

3.2.4 Phân tích hình ảnh chuyển vị NF-κB 29

3.2.5 Hoạt tính ức chế chuyển vị NF-κB 32

BÀN LUẬN 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ADN Acid deoxyribonucleic Acid deoxyribonucleic

DMEM Dulbecco’s modified Eagle

medium

Môi trường nuôi cấy tế bào DMEM

DMSO Dimethyl sunfoxide Dimethyl sunfoxide

EMEM Eagle’s Minium Essential Môi trường nuôi cấy tế bào EMEM GFP Green fluorescent protein Protein huỳnh quang xanh

HCTN Hợp chất thiên nhiên Hợp chất thiên nhiên

HeLa Human cervical cancer cells Tế bào ung thư cổ tử cung

Hep-G2 Hepatocellular carcinoma Tế bào ung thư gan

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% cá thể/tế bào MTT Thiazolyl Blue Tetrazolium

Bromide

Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide

NF-κB Nuclear Factor kappa B Yếu tố nhân (yếu tố phiên mã) NF-κb

PBS Phosphate buffer saline Đệm phosphate

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu hóa học sử dụng trong nghiên cứu sàng lọc hoạt

tính kháng ung thƣ in vitro

Bảng 3.1 Hoạt tính gây độc tế bào của một số mẫu hợp chất trên dòng tế bào

ung thƣ gan Hep-G2

Bảng 3.2 Hoạt tính gây độc tế bào của một số mẫu hợp chất thiên nhiên trên

dòng tế bào ung thƣ cổ tử cung HeLa

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Ước tính các ca bệnh ung thư mắc mới trên thế giới năm 2018

Hình 1.2 Hệ thống sàng lọc/phân tích hiển vi huỳnh quang

Hình 1.3 Tín hiệu đích phân tử NF-κB liên quan các bệnh viêm

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử của tetrazolium và formazan

Hình 3.1 Tương quan nồng độ chất cảm ứng và sự chuyển vị NF-κB ở dòng tế

bào HeLa

Hình 3.2 Autofocus hình ảnh tế bào HeLa trên kênh lọc DAPI theo peak chỉnh

tinh (Fine) và chỉnh thô (Coarse) trên trục Z

Hình 3.3 Tín hiệu protein huỳnh quang xanh gắn với tiểu đơn vị NF-κB p65

(GFP-p65), ADN nhân tế bào (DAPI) và chồng hình ảnh huỳnh quang (MERGE) Hình ảnh được ghi trên thiết bị hiển vi huỳnh quang Olympus scanˆR

Hình 3.4 Lựa chọn thông số xác định viền và kích thước hình ảnh đối tượng

phân tích trên phần mềm Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2

Hình 3.5 Tạo thông số xác định đường viền đối với đối tượng phân tích chính

Main Object (kênh DAPI) và phần Sub-Object (tương ứng vùng tế bào chất “CytoI”, kênh GFP) Hình ảnh đường viền phân tách tốt với khoảng cách (distance) = -1

Hình 3.6 Phân tích hình ảnh thực trên phần mềm Olympus scanˆR Analysis

ver.2.7.2 Tế bào HeLa kích hoạt NF-κB bởi IL-1 10 ng/mL trong 30 phút

Hình 3.7 Phân tích sự chuyển vị NF-κB theo tỷ lệ huỳnh quang của protein p65

vùng tế bào chất và trong nhân (Nuc/Cyto) sử dụng phần mềm Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2

Hình 3.8 Hợp chất SHTN-Zer4 điều hòa/ức chế yếu tố kappa B (NF-κB) của tế

bào ung thư cổ tử cung HeLa qua đánh giá dựa trên sự chuyển vị

NF-κB (p65 gắn GFP) Nhân được xác định đồng thời với nhuộm DAPI

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nguồn hợp chất thiên nhiên bao gồm cả sinh vật biển và đất liền vẫn luôn chiếm được sự quan tâm lớn trong nghiên cứu phát triển dược phẩm mới có ích cho con người từ xa xưa tới nay Sự đa dạng về mặt hóa học trong sinh giới đã đóng một vai trò quan trọng trong lĩnh vực này Tuy nhiên, vấn đề đáng quan tâm là làm thế nào để phát hiện và khai thác các chất có hoạt tính sinh học từ nguồn tài nguyên này một cách có hiệu quả Sàng lọc, tìm kiếm các chất có hoạt tính là bước đi đầu tiên nhưng là bắt buộc đối với quá trình phát triển thuốc Chỉ thông qua các bước sàng lọc hoạt tính mới có thể chọn ra các đối tượng có triển vọng cho nghiên cứu

tiếp theo (nghiên cứu cấu trúc, cơ chế tác dụng, hoạt tính in vivo ) để cuối cùng

chọn ra được dược liệu và hoạt chất cho những nghiên cứu cứu sâu hơn, toàn diện hơn bởi các nhà y-dược học

Với thời gian nhanh, hiệu quả và có độ tin cậy cao, nghiên cứu hóa học theo định hướng hoạt tính sinh học đã được nhiều nước trên thế giới sử dụng như một

trong những công cụ hàng đầu để phát hiện các dược tố mới Nhiều cải tiến trong công nghệ sàng lọc đã được phát triển và một trong những công nghệ đó là kỹ thuật ghi hình ảnh tế bào sử dụng kính hiển vi huỳnh quang tự động hay kỹ thuật sàng lọc và phân tích nội hàm cao dựa trên phân tích hình ảnh để quan sát ảnh hưởng của chất thử lên chức năng sinh lý và kiểu hình trong quá trình phát triển của tế bào Bằng việc sử dụng các marker huỳnh quang tương thích sinh học có thể đưa ra các chuẩn đoán về phương thức tác động của chất dựa vào “dấu vân tay” (fingerprint) kiểu hình của tế bào Đó thường là các quá trình đóng vai trò then chốt trong quá trình sống và phân chia của tế bào Sử dụng kỹ thuật hình ảnh huỳnh quang trong đánh giá các chất tiềm năng giúp các nhà hóa học, nhà dược học đánh giá chính xác hơn về hiệu quả của chất thử do đó tiết kiệm thời gian, kinh phí cho các thử nghiệm tiếp theo trên động vật đồng thời cung cấp các thông tin về tác dụng dược lý của chất thử Do vậy, kỹ thuật sàng lọc dựa trên phân tích hình ảnh tế bào

đang là nhân tố cốt lõi trong khoa học sự sống cũng như nghiên cứu phát triển thuốc hiện đại (tín hiệu tế bào, các bệnh lý thần kinh, ung thư và độc tính thuốc)

Khóa luận tốt nghiệp “Ứng dụng kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang và

phân tích hình ảnh tế bào trong đánh giá hoạt tính chống ung thư (ung thư gan và ung thư cổ tử cung)” được thực hiện nhằm mục tiêu:

- Sàng lọc và đánh giá hoạt tính chống ung thư (tế bào ung thư gan G2 và cổ tử cung HeLa) trên mức độ tế bào bằng phương pháp MTT

Hep Nghiên cứu đánh giá hoạt tính của mẫu chất tiềm năng trên đích phân tử yếu tố nhân NF-κB ở tế bào HeLa bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang kết hợp phân tích hình ảnh tế bào

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Tổng quan về ung thư

Ung thư là một thuật ngữ được sử dụng cho các bệnh mà các tế bào bất thường phân chia không kiểm soát và có thể xâm nhập vào các mô khác Các tế bào ung thư có thể lan tới các bộ phận khác của cơ thể thông qua máu và hạch bạch huyết Có hơn 100 loại ung thư khác nhau, hầu hết chúng được đặt tên dựa vào mô hoặc cơ quan mà chúng gây bệnh, ví dụ: ung thư bắt đầu ở các tế bào của ruột lớn được gọi là ung thư ruột kết [8] Ngày nay, ung thư đã trở thành một mối đe dọa cho sức khỏe cộng đồng và đang thu hút sự chú ý trên toàn thế giới Nguyên nhân ung thư có thể gây ra theo một trong ba yếu tố, đó là: chế độ ăn uống không lành mạnh, yếu tố di truyền và các yếu tố môi trường Người ta ước tính khoảng 95% các loại ung thư là do lối sống và có thể mất khoảng 20-30 năm để phát triển thành ung thư

Con người hiện đại đang phải đối mặt với tỷ lệ ung thư và tử vong do ung thư ngày càng tăng [18] Gánh nặng ung thư toàn cầu ước tính đã tăng lên 18,1 triệu ca mắc mới và 9,6 triệu ca tử vong trong năm 2018 theo số liệu GLOBOCAN gần đây nhất của Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế [22] Các số liệu thống kê cho thấy đàn ông thường bị ung thư phổi, ruột kết, trực tràng và ung thư tuyến tiền liệt, trong khi phụ nữ ngày càng bị ung thư vú, ruột già, trực tràng và ung thư dạ dày [1]

Tại Việt Nam, Bộ Y tế dự báo rằng thế kỷ 21 sẽ là thế kỷ ung thư, bệnh tim mạch và các bệnh không lây nhiễm khác do quá trình đô thị hóa, công nghiệp hóa, cộng thêm các di chứng của chiến tranh vẫn tồn tại và đe dọa đến sức khoẻ con người mỗi ngày [2], [23] Theo thống kê của một số bệnh viện ung bướu ở Hà Nội,

Hồ Chí Minh và một số tỉnh khác trong năm 2008, có khoảng 100.000 đến 150.000 người mắc phải các loại ung thư khác nhau và trên 73% bệnh nhân (khoảng 70.000 bệnh nhân) tử vong mỗi năm khiến Việt Nam trở thành một trong những nước có tỷ

lệ tử vong cao nhất trên thế giới và con số này có xu hướng tăng trong tương lai

gần Dự báo đến năm 2020 sẽ có khoảng 200.000 ca ung thư mới và 100.000 ca tử vong mỗi năm tại Việt Nam [20]

Hình 1.1: Ước tính các ca bệnh ung thư mắc mới trên thế giới năm 2018[22]

Mặc dù có những tiến bộ đáng kể trong những thập kỷ gần đây đã được thực hiện trong nghiên cứu điều trị một số loại ung thư, thực tế là phòng chống và chữa bệnh ung thư vẫn còn nhiều khó khăn Gánh nặng bệnh ung thư ngày càng gia tăng

ở các nước phát triển kinh tế và đang phát triển do già đi và tăng trưởng dân số cũng như ngày càng có nhiều lựa chọn về lối sống liên quan đến ung thư như hút thuốc, ít vận động và chế độ ăn [9] Điều này khiến con người chú ý nhiều hơn và

có những nỗ lực nghiêm túc trong việc ngăn ngừa và điều trị để ngăn chặn căn bệnh nguy hiểm này

Ung thư là một bệnh di truyền vì hầu hết các loại ung thư phát sinh từ sự thay đổi (đột biến) trong ADN của tế bào bình thường Ung thư bắt đầu gây tổn hại tới một hoặc nhiều gen trong một tế bào đơn lẻ Tổn thương này làm cho các tế bào tăng sinh không kiểm soát được và tạo ra những tế bào bất thường Ở giai đoạn này, nếu hệ thống miễn dịch của cơ thể không tiêu diệt hay sửa chữa những tế bào bất thường này, thì chúng sẽ phát triển và cuối cùng chuyển thành tế bào ung thư

Các trường hợp ung thư mắc mới năm 2018

trên toàn cầu

Phổi Vú Đại trực tràng Tuyến tiền liệt

Dạ dày Gan Thực quản

Cơ quan khác

Các đặc tính của tế bào ung thư là chúng phân chia nhanh hơn các tế bào bình thường và hình thành khối u ác tính, những khối u này sẽ xâm nhập các mô khỏe mạnh Quá trình của một tế bào bình thường trở thành ung thư khối u thường mất nhiều năm để phát triển

1.2 Sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học

Đầu thế kỷ XIX, Serturner F.W lần đầu tiên phân lập morphin từ cây thuốc phiện mở ra kỷ nguyên sử dụng các hợp chất thiên nhiên làm thuốc trong Y-Dược [5] Từ đó, các hợp chất và sản phẩm thiên nhiên có hoạt tính sinh học là nguồn cung cấp quan trọng cho sản xuất thực phẩm chức năng, phụ gia và phát triển các thuốc điều trị mới Giá trị của nhiều hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học không chỉ ở công dụng trực tiếp là thuốc chữa bệnh mà còn vì chúng có thể làm nguyên mẫu hoặc cấu trúc dẫn đường cho sự phát hiện và phát triển các dược phẩm mới Theo tổng quan nghiên cứu các thuốc mới từ năm 1981 đến 2006, có 48% trong 1.1184 hợp chất mới đã được chứng nhận bởi Cục quản lý Thực phẩm và

Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration, FDA) [13], [17] và tốc độ

phát triển hàng năm các thuốc nguồn gốc thiên nhiên trên thế giới lên tới 20% Do vậy, các hợp chất thiên nhiên được đánh giá là nguồn có ý nghĩa lớn trong tìm kiếm

và phát triển thuốc

Tuy nhiên, trong những năm qua ngành công nghiệp hóa dược phải đối mặt với sự sụt giảm đáng kể số lượng các thuốc mới Mặc dù trong những năm 1990 tổ hợp hóa học và sàng lọc hiệu năng cao (High-throughput screening, HTS) - một quy trình cho phép sàng lọc hiệu quả số lượng lớn mẫu trong một thời gian ngắn - được áp dụng để sàng lọc thư viện các chất tổng hợp nhằm đẩy nhanh quá trình tìm kiếm thuốc, nhưng phần lớn sản phẩm đưa ra lại không đáp ứng được yêu cầu do những lựa chọn ban đầu không phù hợp Do vậy, dễ dàng nhận ra rằng việc sàng lọc hoạt tính của các chất là vấn đề cần quan tâm đầu tiên trong các chương trình phát triển thuốc Nhiều hoạt tính sinh học của các chất tiềm năng được sàng lọc, giúp rút ngắn thời gian và chi phí cho quá trình phát triển thuốc và số lượng lớn các

thuốc mới đã được chuyển giao từ các chất tiềm năng này Các phương pháp thử nghiệm sinh học trong sàng lọc hoạt tính trở thành công cụ mạnh mẽ cho việc tìm kiếm các hợp chất tiềm năng từ thiên nhiên cho nhiều mục đích sinh học khác nhau Trong đó lĩnh vực mà các hợp chất thiên nhiên vẫn giữ vai trò quan trọng là trong khai thác các thuốc chống ung thư Từ năm 1940, có tới 75% các chất phân tử nhỏ được chứng nhận trong điều trị ung thư là các hợp chất thiên nhiên hoặc các dẫn suất (bán) tổng hợp từ các chất thiên nhiên Gần đây nghiên cứu các hợp chất từ sinh vật biển cho thấy có nhiều thành công trong lĩnh vực này với 15 chất được chứng nhận bởi FDA hoặc qua thử nghiệm lâm sàng trong điều trị ung thư [7], [13]

Nguồn hợp chất thiên nhiên (sinh vật biển và đất liền) luôn chiếm được sự quan tâm lớn trong nghiên cứu phát triển dược phẩm mới có ích cho con người tư

xa xưa tới nay Sự đa dạng về mặt hóa học trong sinh giới đã đóng một vai trò quan trọng trong lĩnh vực này Tuy nhiên, vấn đề đáng quan tâm là làm thế nào để phát hiện và khai thác các chất có hoạt tính sinh học từ nguồn tài nguyên tái tạo này một cách có hiệu quả Sàng lọc, tìm kiếm các chất có hoạt tính là bước đi đầu tiên nhưng là bắt buộc đối với quá trình phát triển thuốc Chỉ thông qua các bước sàng lọc hoạt tính mới có thể chọn ra các đối tượng có triển vọng cho nghiên cứu tiếp

theo (nghiên cứu cấu trúc, cơ chế tác dụng, hoạt tính in vivo ) để cuối cùng chọn

ra được dược liệu và hoạt chất cho những nghiên cứu cứu sâu hơn, toàn diện hơn bởi các nhà y-dược học

Với thời gian nhanh, hiệu quả và có độ tin cậy cao, nghiên cứu hóa học theo định hướng hoạt tính sinh học đã được nhiều nước trên thế giới sử dụng như một

trong những công cụ hàng đầu để phát hiện các dược tố mới Qua những quá trình phát triển nghiên cứu với việc áp dụng những công nghệ tiên tiến, ngày nay sàng lọc theo định hướng hoạt tính đã trở thành cơ sở chính của sàng lọc hiệu năng cao HTS [3] Về một số phương diện nhất định, việc phối hợp các phép thử khác nhau không chỉ giúp tăng cường khả năng sàng lọc các hợp chất có hoạt tính mà còn có thể đưa ra những nhận xét quan trọng về cơ chế tác dụng và hiệu quả của mẫu thử

hay chất thử đó Ngoài ra, kết quả của các quá trình sàng lọc này còn có thể cung cấp những dấu hiệu ban đầu về những khả năng điều trị mới cho các mẫu thử nghiệm hay phát hiện những hoạt tính chưa được biết trước đó [6]

1.3 Sàng lọc hoạt tính dựa trên phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào

Hiện nay, sàng lọc hoạt tính chống ung thư in vitro thường được đánh giá

qua hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxicity), ức chế sự tăng sinh tế bào (antiproliferation), kích thích sự chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) thông qua biểu hiện của protein p53, Bax, Bak, Bcl-XL/BH3, hoạt tính enzyme caspase-3/7; hoạt tính ức chế aurora kinase, serine/threonine kinase, ADN topoisomerase I, kháng NF-κB (liên quan quá trình viêm và ung thư), phosphoryl hóa, ty thể, chu kỳ tế bào, chuyển vị nội bào,… sử dụng các kỹ thuật như MTT, Western blot, SEAP-assay, trắc lưu tế bào (flow cytometry), miễn dịch huỳnh quang và phân tích hình ảnh hiển vi tế bào,… Trong đó, tất cả các chiến lược sàng

lọc in vitro tìm kiếm các chất hoạt tính sinh học có thể chia thành 2 nhóm phương pháp: (i) Sàng lọc trên mức độ (toàn bộ) tế bào và (ii) Sàng lọc trên đích là các

phân tử đặc hiệu Mặc dù chiếm số lượng lớn so với thư viện các chất tổng hợp, các HCTN trong mẫu chiết dường như không hoàn toàn phù hợp cho sàng lọc hiệu năng cao HTS trên đích là các phân tử đặc hiệu Ngược lại, có thể dễ dàng nâng cao hiệu quả sàng lọc ở mức độ tế bào, nhưng nhóm phương pháp này không cung cấp được thông tin về phương thức hay đích tác động của chất thử, do vậy sẽ khó khăn trong lựa chọn ưu tiên chất tiềm năng cho những nghiên cứu tiếp theo (trên mô hình động vật và lâm sàng)

Nhiều cải tiến trong công nghệ sàng lọc đã được phát triển với mục đích phối hợp được cả hai phương pháp trên Một trong những công nghệ đó là kỹ thuật ghi hình ảnh tế bào sử dụng kính hiển vi huỳnh quang tự động để quan sát ảnh hưởng của chất thử lên chức năng sinh lý và kiểu hình trong quá trình phát triển của tế bào Bằng việc sử dụng các marker huỳnh quang tương thích sinh học có thể đưa ra các chuẩn đoán về phương thức tác động của chất dựa vào “dấu vân tay”

(fingerprint) kiểu hình của tế bào Do vậy, kỹ thuật sàng lọc dựa trên phân tích hình ảnh tế bào đang là nhân tố cốt lõi trong khoa học sự sống cũng như nghiên cứu phát triển thuốc hiện đại (tín hiệu tế bào, các bệnh lý thần kinh, ung thư và độc tính thuốc)

Trong lĩnh vực tìm kiếm các thuốc chống ung thư, kỹ thuật phân tích huỳnh quang tế bào có thể được sử dụng để đánh giá tác dụng của chất thử lên các quá trình apoptosis, chu trình tế bào (cell cycle), chuyển vị nội bào và di căn Prével và cộng sự đã phát triển kỹ thuật huỳnh quang phục vụ sàng lọc hiệu năng cao các chất điều trị ung thư mới hướng đích là các kinase phụ thuộc cyclin (Cyclin-dependent kinases, CDKs) - enzyme có vai trò quan trọng trong điều khiển chu trình tế bào sống và biểu hiện cao ở hầu hết các bệnh ung thư người [16] Phương pháp huỳnh quang được phát triển sử dụng cảm biến protein/peptide sinh học là công cụ có độ nhạy cao để phát hiện những thay đổi về thành phần, hoạt tính và trạng thái cấu trúc của các CDK/Cyclin trong nghiên cứu phát triển thuốc chống ung thư Sử dụng kỹ thuật huỳnh quang tế bào phân tích trên thiết bị KineticScan®HCS Reader (ThermoFisher, USA), Wei et al (2008) đã chứng minh hoạt tính

chống ung thư gan của triterpene jaspolide B phân lập từ loài bọt biển Jaspis sp

Trên 2 dòng tế bào Bel-7402 và Hep-G2 qua hoạt tính cảm ứng apoptosis (66,8% ở nồng độ 0,5µM) và đích ty thể Hơn nữa, qua phân tích chu trình tế bào (cell cycle)

và sự thay đổi cấu trúc sợi vi ống xác định được jaspolide B ức chế phase G1 của chu trình tế bào và sự phân tách vi ống cấu trúc tế bào ung thư gan [19]

Nghiên cứu phát hiện chuyển vị của yếu tố nhân NF-κB trong các thử nghiệm mức độ tế bào thường gặp nhiều khó khăn do các tương tác protein nội bào xẩy ra nhanh và phức tạp Kỹ thuật chuyển gel hay di động điện di EMSA (electrophoretic mobility shift assay) thường được sử dụng để phát hiện liên kết đặc hiệu NF-κB và ADN hoặc có thể sử dụng kỹ thuật Western blot Một trong các yếu điểm của phương pháp EMSA và Western blot là chúng không cung cấp đầy đủ thông tin trong mẫu phân tích phức tạp và do đó thiếu độ tin cậy Ví dụ, khi quan

sát giảm 50 % độ mạnh tín hiệu phát hiện được không đồng nghĩa với việc giảm 50

% trong 100 % quần thể đó Mặt khác các phương pháp hóa sinh-phân tử này cũng không đủ nhạy để phát hiện các hiện tượng hiếm khi chỉ thực hiện trên số lượng tế bào hạn chế (vd 100-200 TB) Trong khi đó phân tích trắc lưu tế bào Flow cytometry có thể cung cấp nhiều dữ liệu từ số lượng lớn tế bào thử nghiệm, tuy nhiên rõ ràng kỹ thuật này không thể thu được các dữ liệu phân tích nội bào từ các tín hiệu huỳnh quang [11] Những hạn chế này có thể được khắc phục bằng kỹ thuật phân tích hình ảnh tế bào và chuyển vị nội bào sử dụng thiết bị hiển vi huỳnh quang Dưới đây mô tả các bước tiến hành, phân tích trên hệ thiết bị hiển vi huỳnh quang nội hàm cao Olympus scanˆR

Hình 1.2: Sàng lọc/phân tích hiển vi huỳnh quang (A) Nuôi cấy tế bào trên phiến vi lượng, (B) Chuẩn bị mẫu, (C) Kit và thuốc thử, (D) Thiết bị ghi ảnh hiển vi (có thể tích hợp laser scanner), (E) Phần mềm phân tích, (F) Thiết bị lưu/xử lý dữ liệu (máy tính, server)

1.4 Phương pháp điều trị ung thư hướng đích phân tử

Trong điều trị ung thư, các phương pháp chính hay dùng là phẫu thuật, hóa trị và chiếu xạ, trong đó hóa trị là một liệu pháp điều trị quan trọng Tuy nhiên, thành công của liệu pháp này bị hạn chế do thiếu chọn lọc cho các tế bào khối u so

với các tế bào bình thường dẫn đến nồng độ thuốc không đủ trong khối u, có độc tính toàn thân và làm xuất hiện của các tế bào khối u kháng thuốc Nhằm nâng cao hiệu quả của các liệu pháp trị liệu ung thư, người ta tiếp tục nghiên cứu thay đổi công thức, bào chế dạng liposome, tạo các chất điều hoà sự đề kháng (ví dụ PSC833), chất thay đổi/ức chế độc tố (ví dụ ICRF-187) Liệu pháp nhắm đích phân

tử gần đây đang đạt được tầm quan trọng do tính đặc hiệu của nó đối với các tế bào ung thư trong khi không gây độc cho các tế bào ngoài mục tiêu [14]

Các liệu pháp điều trị ung thư được nhắm đích phân tử sử dụng các thuốc hoặc các chất khác ngăn chặn sự phát triển và lây lan của ung thư bằng cách can thiệp vào các phân tử cụ thể ("mục tiêu phân tử") có liên quan đến sự hình thành, tiến triển và lây lan của ung thư Hầu hết các liệu pháp nhắm đích sử dụng thuốc phân tử nhỏ hoặc kháng thể đơn dòng Sự phát triển của các liệu pháp nhắm đích đòi hỏi phải xác định các mục tiêu tốt, đó là các mục tiêu đóng vai trò chính trong

sự phát triển và sống sót của tế bào ung thư Nhiều liệu pháp nhắm đích khác nhau

đã được phê duyệt để sử dụng trong điều trị ung thư Những liệu pháp này bao gồm liệu pháp hormon, thuốc ức chế tải nạp tín hiệu, bộ điều biến biểu hiện gen, thuốc cảm ứng apoptosis, thuốc ức chế hình thành mạch máu mới, liệu pháp miễn dịch và phân tử mang độc tố Hiện nay, việc sử dụng các phân tử nhỏ có khả năng tác động các đích phân tử là các protein hay gene liên quan đến ung thư là một trong những liệu pháp điều trị phổ biến nhất [21] Trong phạm vi khóa luận này chúng tôi tập trung vào đích phân tử là: Yếu tố nhân NF-κB

1.5 Tổng quan về yếu tố nhân NF-κB liên quan quá trình viêm và ung thư

Yếu tố nhân kappa B, NF-κB, là một yếu tố phiên mã thiết yếu kiểm soát quá trình biểu hiện gen mã hóa của các cytokine tiền viêm trong quá trình sinh lý bệnh viêm và ung thư Khi tế bào ở trạng thái nghỉ, NF-κB tồn tại trong bào tương ở dạng tương tác không đồng hóa trị với các protein IκB (IκB-, IκB-, IκB-ɣ, IκB-

ɛ, Bcl-3, p100 và p105) Tất cả các IκB này đều chứa các đoạn lặp lại là ankyrin Các ankyrin này điều hòa quá trình gắn kết giữa IκB - NF-κB và tương tác với một

vùng trên RHD của NF-kB do đó che mất phần NLS (nuclear localization sequence) nên phân tử NF-κB không thể di chuyển từ bào tương vào nhân được Những tác nhân hoạt hóa NF-κB gây nên quá trình phosphoryl hóa các IκB Kết quả là IκB bị giáng hóa bởi quá trình thủy phân protein hoặc bị phân hủy do các proteasome hay các protease khác Khi đó các NF-κB sẽ được giải phóng, đi vào nhân tế bào và kích hoạt quá trình phiên mã tại đây Sự kích hoạt sai lệch tín hiệu NF-κB có liên quan đến các bệnh viêm như viêm khớp dạng thấp và hen suyễn và một số bệnh chuyển hóa

Hình 1.3: Tín hiệu đích phân tử NF-κB liên quan các bệnh viêm [10]

Mặt khác, khi viêm không lành dễ chuyển sang giai đoạn viêm mạn tính và nhiều nghiên cứu đã chứng minh có mối liên hệ giữa viêm mạn tính và nguy cơ ung thư cao thông qua yếu tố NF-κB Liên quan tới bệnh ung thư, NF-κB có vai trò là yếu tố điều hòa biểu hiện của những gen kiểm soát sự tăng sinh và sống sót của tế bào Như vậy, nhiều loại khối u khác nhau của con người do sự kiểm soát sai NF-κB: NF-κB hoạt động giúp biểu hiện của các gen giữ cho tế bào tăng sinh và bảo vệ

tế bào khỏi các điều kiện kích ứng quá trình chết theo chương trình apoptosis Trong ung thư, các protein kiểm soát tín hiệu NF-κB bị đột biến hoặc biểu hiện bất thường dẫn đến sự phối hợp không hoàn thiện giữa các tế bào ác tính

và phần còn lại của cơ thể sinh vật Điều này dẫn tới việc hệ thống miễn dịch loại

bỏ không hiệu quả khối u và những tế bào ung thư ác tính Vì vậy, NF-κB là chủ đề của nhiều nghiên cứu của các công ty dược phẩm… như một đích của liệu pháp kháng viêm và ung thư

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Phạm vi, đối tượng nghiên cứu

Họat tính chống ung thư ở mức độ tế bào được sàng lọc trên 2 dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và cổ tử cung HeLa

Đánh giá hoạt tính chống ung thư trên đích phân tử yếu tố nhân NF-κB ở tế bào HeLa sử dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào với kính hiển vi huỳnh quang tự động

2.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.2.1 Dòng tế bào

Dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa (ATCC®

CCL-2TM) và tế bào ung thư gan Hep-G2 (ATCC® HB-8065™) sử dụng trong nghiên cứu được mua từ nguồn ATCC (American Type Culture Collection, Virginia, USA) và lưu giữ tại phòng Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học các HCTN)

2.2.2 Môi trường nuôi cấy tế bào

Môi trường (EMEM, DMEM) có bổ sung 0,1% kháng sinh và 10% huyết thanh bào thai bò FBS (ThermoFisher hoặc Sigma)

2.2.3 Mẫu thử nghiệm

Mẫu sử dụng cho sàng lọc, đánh giá hoạt tính sinh học là các cao chiết từ nguồn thực vật, sinh vật biển hoặc các chất tinh sạch và bán tổng hợp (từ HCTN) được cung cấp bởi các đơn vị phối hợp như một số Viện nghiên cứu hóa học thuộc Viện Hàn lâm KHCNVN, Trường đại học bách khoa Hà Nội, Viện nghiên cứu và phát triển sản phẩm thiên nhiên Do các kết quả thu được trong nghiên cứu này chưa được công bố và thuộc khuôn khổ hợp tác với các đơn vị liên quan nên các

mẫu được kí hiệu theo bảng sau:

Bảng 2.1: Danh sách các mẫu hóa học sử dụng trong nghiên cứu sàng lọc hoạt tính

kháng ung thư in vitro*

2 Nitid, M1 – 7aa, M2 – 7ab, M3 – 7ac,

4 LCN, LCH, LCC, LCE, MN, DH, HD,

DE, ME, HT, DC, MH, DN, MC

Mẫu cao chiết, phân đoạn

5 Paclitaxel (taxol), Ellipticine Thuốc chống ung thƣ, sử

dụng làm chứng (+)

* Các mẫu sử dụng trong khóa luận này chỉ là minh chứng cho kết quả thử nghiệm sàng lọc

và lựa chọn mẫu cho nghiên cứu tiếp theo trên các đích phân tử Việc sử dụng kết quả về sàng lọc MTT đã đƣợc sự đồng ý của đơn vị gửi mẫu

2.2.4 Thiết bị

- Tủ cấy vô trùng (Bio Clean Bench, Sanyo, Nhật)

- Tủ ấm CO2 (Esco, Indonesia)

- Máy ly tâm (Hettich rotofix 32A, CHLB Đức)

- Máy ly tâm lạnh (Hettich universal 32R, CHLB Đức)

- Tủ lạnh (Panasonic, Nhật)

- Tủ lạnh sâu (đến -86°C, Sanyo, Nhật), Bình nitơ lỏng (Chart BioMedical, Trung Quốc)

- Kính hiển vi soi ngược (Optika, Ý)

- Bể siêu âm (Daihan scientific, Hàn Quốc)

- Máy đo quang (Infinite F50, Tecan, Thụy Sỹ)

- Hệ thống hiển vi huỳnh quang tự động Olympus scanˆR (Heidelberg, CHLB Đức) và phần mềm phân tích scanˆR Analysis Software

2.3 Nội dung nghiên cứu

Các hợp chất thiên nhiên, tổng hợp

Sáng lọc hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào Hep-G2 và HeLa (phương pháp MTT)

Chọn chất tiềm năng

Nghiên cứu thu nhận và phân tích chất lượng hình ảnh hiển vi huỳnh quang

Đánh giá hoạt tính chống ung thư trên đích phân tử NF-κB

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp nuôi cấy và hoạt hóa tế bào

Tế bào ung thư được nuôi cấy ở 37 oC ở tủ ấm cấp CO2 5 % trong môi trường DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose; Sigma-Aldrich, USA) có bổ sung L-glutamine 2mM, kháng sinh (Penicillin + Streptomycin sulfate)

và huyết thanh bào thai bò (FBS 10 %) Sau khi tế bào phát triển đạt trên 70 %, loại

bỏ môi trường cũ và rửa với dung dịch đệm phosphate (PBS 0,1 M, pH 7,8), sau đó

bổ sung Trypsin-EDTA 0,05 % để tách tế bào bám dính khỏi đáy đĩa nuôi cấy Dịch tế bào được chuyển sang ống falcon 15 mL có chứa 4-5 mL dịch môi trường mới và ly tâm 300 vòng/phút Sau khi loại bỏ phần dịch, phần cặn tế bào được trộn

với môi trường dinh dưỡng và được chuyển sang bình nuôi cấy mới để sẵn sàng cho các thử nghiệm hoạt tính

2.4.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế sự tăng sinh tế bào

Nguyên tắc: Việc sử dụng thuốc nhuộm tetrazolium (MTT) làm phép đo

chính xác số lượng tế bào đã được công bố từ đầu những năm 1980 [12] Nguyên lý của phương pháp MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] dựa trên sự chuyển hóa MTT thành dạng tinh thể formazan bởi enzyme oxidoreductase phụ thuộc NAD(P)H của ti thể có liên quan tuyến tính với sự tăng hoặc giảm số lượng tế bào Do đó, số lượng tế bào sống sót có thể được xác định gián tiếp bằng cách đo nồng độ hấp thụ MTT-formazan tại bước sóng λ=570 nm Trong quá trình phân chia tế bào, việc giảm số lượng tế bào phản ánh khả năng ức chế sự sinh trưởng của tế bào và hoạt tính của thuốc/chất thử sau đó được xác định dựa trên nồng độ của mẫu tại đó ức chế 50% sự phát triển của tế bào so với đối chứng không xử lý với thuốc (giá trị IC50) Quy trình này dựa trên tài liệu tham khảo và được tối ưu trên các thử nghiệm với chất thử và thuốc có độc tính tế bào để thu được kết quả phù hợp với thực nghiệm chuẩn [15]

Hình 2.1: Cấu trúc phân tử của tetrazolium và formazan Tiến hành: tế bào ung thư được nuôi cấy ở 37oC (tủ ấm CO2 5%) trên phiến

96 giếng (1,5 x 105 tế bào/giếng) trong môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) hoặc EMEM (Eagle’s Minimum Essential Medium, Sigma-Aldrich, USA) bổ sung kháng sinh (Penicillin + Streptomycin sulfate) và huyết thanh bê 10% Sau đó, tế bào được ủ với chất chuẩn Ellipticine (hoặc Paclitaxel) và