Nghiên cứu một số biến đổi bệnh lý của bệnh care (canine distemper) trên chó và ứng dụng phương pháp miễn dịch huỳnh quang (immuno fluorescent) để chẩn đoán bệnh

26 3.6.3 Phương pháp làm tiêu bản vi thể và quan sát bệnh tích trên tiêu bản của chĩ nghi mắc bệnh Care..... Nghiên cứu sự phân bố của virus Care ở các cơ quan của chĩ mắc bệnh Care bằng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

KHAO KEONAM

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIẾN ðỔI BỆNH LÝ CỦA BỆNH CARE (CANINE DISTEMPER) TRÊN CHÓ VÀ ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG (IMMUNO

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc hoàn thành luận văn này ñã ñược cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, tháng 09 năm 2012

Tác giả luận văn

Khao KEONAM

LỜI CẢM ƠN

Cho ựến nay tôi ựã hoàn thành luận văn tốt nghiệp Nhân dịp này tôi xin ựược bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới Bộ Giáo dục đào tạo CHDCND Lào ựã tạo cơ hội cho tôi ựược ựào tạo thạc sỹ chuyên ngành thú y tại trường đại học Nông nghiệp Hà Nội

Ở Việt Nam, trước tiên tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô giáo trong khoa Thú y, ựặc biệt là TS Nguyễn Thị Lan và

TS Nguyễn Bá Tiếp người ựã hướng dẫn khoa học và tận tình giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện ựề tài và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ trong Bộ môn Bệnh lý, Bộ môn Giải phẩm Tổ chức, Khoa Thú y, Viện đào tạo Sau ựại học, các cán bộ và chuyên gia thuộc Phòng thắ nghiệm trung tâm khoa Thú y, trường đại học Nông nghiệp Hà Nội, các phòng Khám ở ựịa bàn Hà Nội ựã tạo mọi ựiều kiện thuận lợi và giúp ựỡ tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ựến gia ựình và bạn

bè ựã giúp ựỡ, ựộng viên tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thiện luận văn

Hà Nội, tháng 09 năm 2012 Tác giả luận văn

Khao KEONAM

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC BIỂU ðỒ HÌNH vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix

PHẦN I: MỞ ðẦU 1

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Lịch sử của bệnh Care 3

2.2 Căn bệnh học 4

2.2.1 Phân loại virus gây bệnh Care 4

2.2.2 Hình thái của virus Care 5

2.2.3 Cấu trúc của virus Care 6

2.2.4 Sức ñề kháng của virus Care 7

2.2.5 Cơ chế sinh bệnh 8

2.3 Dịch tễ học 10

2.3.1 Loài vật mắc bệnh 10

2.3.2 Lứa tuổi mắc bệnh 10

2.3.3 Mùa vụ nhiễm bệnh 11

2.4 Truyền nhiễm học 11

2.4.1 Chất chứa virus 11

2.4.2 ðường xâm nhập và cách thức lây lan 11

2.4.3 Tỷ lệ ốm, tỷ lệ chết 12

2.5 Triệu chứng bệnh tích 12

2.5.1 Triệu chứng lâm sàng 12

2.5.2 Bệnh tích 14

2.6 Chẩn đốn bệnh 16

2.6.1 Dựa vào đặc điểm dịch tễ học của bệnh 16

2.6.2 Dựa vào triệu chứng lâm sàng 17

2.6.3 Chẩn đốn trong phịng thí nghiệm 17

2.7 Phịng và điều trị bệnh 21

2.7.1 Phịng bệnh 21

2.7.2 ðiều trị 23

PHẦN III: ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM, THỜI GIAN, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 ðối tượng nghiên cứu 24

3.2 ðịa điểm nghiên cứu 24

3.3 Thời gian nghiên cứu 25

3.4 Nội dung nghiên cứu 25

3.5 Nguyên liệu nghiên cứu 25

3.5.1 Mẫu bệnh phẩm dùng cho nghiên cứu được thu thập từ các cơ quan 25

3.5.2 Hĩa chất dùng cho nghiên cứu 25

3.5.3 Máy mĩc, dụng cụ 25

3.6 Phương pháp nghiên cứu 26

3.6.1 Theo dõi triệu chứng lâm sàng của chĩ nghi mắc bệnh Care 26

3.6.2 Phương pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể của chĩ nghi mắc bệnh Care 26

3.6.3 Phương pháp làm tiêu bản vi thể và quan sát bệnh tích trên tiêu bản của chĩ nghi mắc bệnh Care 27

3.6.4 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang để chẩn đốn bệnh Care 32

3.6.5 Phương pháp xử lý số liệu 34

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

4.1 Triệu chứng lâm sàng của chĩ nghi mắc bệnh Care 36

4.2 Biến đổi bệnh lý đại thể của chĩ nghi mắc bệnh Care 39

4.3 Biến đổi bệnh tích vi thể của chĩ mắc bệnh Care 42

4.4 Kết quả ứng dụng phương pháp miễn dịch huỳnh quang để

chẩn đốn 46

4.5 Nghiên cứu sự phân bố của virus Care ở các cơ quan của chĩ mắc bệnh Care bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang 50

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 59

5.1 Kết luận 59

5.2 Kiến nghị 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Kết quả chẩn đốn bệnh của chĩ tới khám và điều trị tại các

phịng mạch 35

Bảng 4.2 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của chĩ nghi mắc bệnh Care 36

Bảng 4.3 Các tổn thương đại thể ở chĩ nghi mắc Care 39

Bảng 4.4 Biến đổi vi thể ở một số cơ quan của chĩ nghi mắc bệnh Care 44

Bảng 4.5 Kết quả chẩn đốn bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang và RT-PCR 47

Bảng 4.6 Hồ sơ của 5 chĩ mắc bệnh Care được lựa chọn để nghiên cứu 51

Bảng 4.7 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của 5 chĩ mắc bệnh Care 52

Bảng 4.8 Biến đổi đại thể chủ yếu trên chĩ mắc bệnh Care 53

Bảng 4.9 Biến đổi bệnh tích vi thể chủ yếu trên chĩ mắc bệnh Care 54

Bảng 4.10 Kết quả xác định sự phân bố của virus ở các cơ quan bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang 55

DANH MỤC BIỂU ðỒ HÌNH

Hình 1 Hình thái của virus được chụp dưới kính hiển vi 6

Hình 2 Kít chẩn đốn nhanh bệnh Care 20

Hình 3 Khi chĩ mắc bệnh Care kít lên hai vạch 20

Hình 4 Quy trình làm tiêu bản vi thể 32

Hình 5 Kháng kháng thể cĩ gắn chất phát huỳnh quang 33

Hình 6 Kính hiển vi huỳnh quang 33

Hình 7 Cĩ nhiều dử mắt, cĩ nước mũi 38

Hình 8 Chĩ nghi mắc bệnh Care cĩ biểu hiện mệt mỏi, ủ rủ 38

Hình 9 Chĩ nghi mắc bệnh Care cĩ phân dính ở hậu mơn 38

Hình 10 Chĩ nghi mắc bệnh Care biểu hiện thần kinh 38

Hình 11 Chĩ nghi mắc bệnh Care cĩ các nốt sài ở vùng da mỏng. 38

Hình 12 Chĩ nghi mắc bệnh Care cĩ gan bàn chân sưng, cứng 38

Hình 13 Xuất huyết phổi ở chĩ nghi mắc bệnh Care 41

Hình 14 Ruột bị hoại tử ở chĩ nghi mắc bệnh Care 41

Hình 15 Hạch dưới hàm của chĩ nghi mắc bệnh Care bị sưng 41

Hình 16 Hạch màng treo ruột của chĩ nghi mắc bệnh Care bị sưng 41

Hình 17 Xuất huyết đại não và tiểu não ở chĩ nghi mắc bệnh Care 42

Hình 18 Khí quản của chĩ nghi mắc bệnh Care bị xuất huyết 42

Hình 19 Phổi của chĩ nghi mắc bệnh Care bị sung huyết 42

Hình 20 Xoang ngực tích nước ở chĩ nghi mắc bệnh Care 42

Hình 21 Chĩ nghi mắc bệnh Care bị viêm phế quản phổi (HE x 10) 44

Hình 22 Chĩ nghi mắc bệnh Care lơng nhung ruột đứt nát (HE x 10) 44

Hình 23 Chĩ nghi mắc bệnh Care bị xuất huyết ở cơ tim (HE x10) 44

44

Hình 25 Thâm nhiễm tế bào viêm ở phổi của chĩ nghi mắc bệnh

Care (HE x10) 45

Hình 26 Ruột chĩ nghi mắc bệnh Care xuất huyết và thối hĩa tế

bào ruột (HE x40) 45

Hình 27 Gan của chĩ nghi mắc bệnh Care xuất huyết, thâm nhiễm tế

bào viêm (HE x 40) 45

Hình 28 Hạch lympho của chĩ nghi mắc bệnh Care xuất huyết lan

tràn (HE x 10) 45

Hình 29 CDV tập trung nhiều ở vách phế quản của chĩ mắc

CDV (IF x 10) 49

Hình 30 Hình ảnh phế quản phổi của chĩ âm tính với phản ứng IF

10X (khơng chứa virus Care) 49

Hình 31 CDV phân bố nhiều trên tế bào vách phế nang (IF x

40) ở chĩ mắc bệnh Care 49

Hình 32 CDV phân bố ở vách phế nang (vị trí cĩ màu xanh lá mạ)

(IF x 10) của chĩ mắc bệnh Care 49

Hình 33 CDV phân bố ở vách phế nang của chĩ mắc bệnh Care (IF x

20) 50

Hình 34 CDV phân bố ít ở hạch lympho của chĩ mắc bệnh Care (IF x 10) 50

Hình 35 Kết quả chẩn đốn chĩ mắc Care bằng phản ứng RT-PCR 50

18 RT-PCR Reverse Transcription Polymesase Chain Reaction

PHẦN I

MỞ ðẦU

1.1 Tính cấp thiết của ñề tài

Bên cạnh sự phát triển chung của ngành chăn nuôi ñộng vật nông nghiệp, chăn nuôi chó cũng trở thành một nghề với sự gia tăng ngày càng nhiều số lượng chó ñược nuôi trong các hộ gia ñình Con người nuôi chó với nhiều mục ñích sử dụng khác nhau như: nuôi ñể giữ nhà, làm bạn trong nhà, làm cảnh, ñi săn, chăn cừu, phục vụ cho an ninh quốc phòng…

Chính vì các lợi ích mang lại từ việc nuôi chó nên ñã có rất nhiều người yêu thích và quan tâm ñến chó nên số lượng chó tăng lên một cách ñáng kể Thêm vào ñó việc mở rộng giao lưu với các nước trên thế giới và việc kinh doanh thú cảnh ngày càng phát triển nên có nhiều giống chó quý ñã ñược nhập vào Việt Nam ñể nhân giống và kinh doanh Song song với sự phát triển nhu cầu nuôi chó tăng cả về số lượng và chủng loại dẫn ñến nhiều khó khăn làm ảnh hưởng ñến hiệu quả việc chăm sóc nuôi dưỡng, ñó là tình hình bệnh tật trên ñàn chó ngày một phức tạp

Trong các nguyên nhân gây tử vong trên chó như các bệnh nội khoa, ngoại khoa, ký sinh trùng, truyền nhiễm, sản khoa thì bệnh truyền nhiễm chiếm một tỷ lệ khá cao Một trong số các bệnh truyền nhiễm gây bệnh trên chó thì hay gặp nhất là bệnh Care Bệnh Care (bệnh sài sốt ở chó) là một bệnh

truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm của loài chó, do virus care (Canine

Distemper Virus – CDV) gây ra Bệnh thường xảy ra ở chó non, lây lan

nhanh, tỷ lệ chết rất cao với các triệu chứng như: sốt, viêm cata ở niêm mạc, ñặc biệt là niêm mạc ñường hô hấp, viêm phổi, nổi mụn ở da và những triệu chứng thần kinh

bố ở các nước châu Á như Nhật Bản (Lan và cs, 2006), Thái Lan (Keawcharoen và cs, 2005), Hàn Quốc (An và cs, 2008) và Ấn ðộ (Latha và

cs, 2007) Ở nước Việt Nam, bệnh Care được phát hiện từ năm 1920 và cho đến nay bệnh đã xảy ra ở hầu hết các tỉnh và gây thiệt hại lớn do tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao nhưng các nghiên cứu để chẩn đốn bệnh cịn nhiều hạn chế Bên cạnh đĩ trên thế giới đã áp dụng các phương pháp như: phản ứng miễn dịch gắn Enzim ELISA (Enzime Linked Immuno Sorbent Assay), phản ứng miễn dịch huỳnh quang (Immunofluorescent - IF), hĩa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC), phản ứng RT-PCR để chẩn đốn nhanh, chính xác, kịp thời chĩ mắc Care Trong đĩ, phương pháp miễn dịch huỳnh quang nhằm xác định sự tập trung của virus trong các cơ quan ở chĩ mắc Care với độ chính xác cao và tin cậy và mang lại nhiều hiệu quả tích cực trong cơng tác chẩn đốn Mặt khác phương pháp miễn dịch huỳnh quang chưa được ứng dụng nhiều để chẩn đốn bệnh Care tại Việt Nam

Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tơi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu

một số biến đổi bệnh lý của bệnh Care (Canine Distemper) trên chĩ và ứng dụng phương pháp miễn dịch huỳnh quang (Immuno fluorescent)

để chẩn đốn bệnh”

1.2 Mục đích của đề tài

Nhằm hiểu được các triệu chứng lâm sàng, biến đổi bệnh lý đại thể, vi thể các cơ quan, tổ chức của chĩ mắc bệnh Care ðồng thời chẩn đốn chính xác được bệnh Care bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang, giúp cho việc phịng và trị bệnh kịp thời

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Lịch sử của bệnh Care

Bệnh Care hay bệnh sài sốt ở chó là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm thường xảy ra ở chó non, lây lan nhanh và tỷ lệ chết rất cao ðây là một căn bệnh nguy hiểm nhất trên chó trong nửa ñầu thế kỷ XIX Tỷ lệ mắc bệnh lớn nhất ở chó con 3 - 6 tháng tuổi, khi miễn dịch chủ ñộng từ mẹ truyền sang

ñã giảm thì tỷ lệ mắc bệnh từ 25% tới trên 30% và tỷ lệ chết ở chó mắc bệnh thường cao từ 50% - 90% (Ron Hines, 2006) Chó mắc bệnh này thấy tổn thương lớn ở hệ tiêu hoá ñặc biệt ở dạ dày và ruột, hệ thần kinh trung ương và

là do virus Sau này, người ta lấy tên ông ñể ñặt tên cho mầm bệnh và tên bệnh (David và Martin, 1979)

Sau ñó năm 1923, Putoni lần ñầu tiên chế vacxin nhược ñộc, tuy nhiên

VR vacxin này ñộc lực vẫn còn cao Từ năm 1948 về sau, với sự phát triển mạnh mẽ của virus học nhiều vacxin phòng bệnh Care có hiệu quả ra ñời (Ron Hines, 2006) Các công trình nghiên cứu về sự liên quan kháng

nguyên giữa virus Care và virus sởi, giữa virus Care và virus dịch tả trâu bò, của J.M Dams Pgoret ñã mở rộng ra ñược nhiều triển vọng cho việc phòng bệnh Care bằng cách dùng virus dịch tả trâu bò và virus sởi theo nghiên cứu của Merchant trong giai ñoạn 1961 – 1969

Hiện nay bệnh có ở khắp nơi trên thế giới, không những xảy ra ở chó nuôi mà còn ở nhiều quần thể ñộng vật hoang dã Người ta cho rằng những chó mắc bệnh Care nhưng không biểu hiện triệu chứng rõ ràng ñã trở thành mối ñe dọa nghiêm trọng cho việc bảo tồn nhiều loài thú ăn thịt và thú có túi Qua thống kê các nghiên cứu cho thấy, bệnh Care góp phần quan trọng vào sự tuyệt chủng của chồn chân ñen, hổ Tasmania và là nguyên nhân gây tử vong ñịnh kỳ của chó hoang dã châu Phi (Assessment, 2005) Năm 1991, bệnh xảy ra trên quần thể sư tử Serengeti ở Tanzania làm giảm 20% số lượng toàn ñàn (Timothy và cs, 2009) ðặc biệt virus Care ñã biến ñổi và có khả năng gây bệnh cho một số ñộng vật biển (Kennedy và cs, 1989)

Ở Việt Nam, bệnh ñược phát hiện từ năm 1920 Cho ñến nay, bệnh xảy

ra ở hầu hết các tỉnh và gây thiệt hại lớn do tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao (Lê Thị Tài, 2006) Nguyễn Thị Lan và cs ñã nghiên cứu thành công ñặc tính sinh trưởng cụ thể của một số chủng CDV trên dòng tế bào Vero có gắn receptor tương ứng với virus Care (Vero-DogSLAMtag hay Vero-DST) Qua ñó tác giả cũng chỉ ra tế bào Vero-DST là dòng tế bào thích hợp có thể sử dụng ñể phân lập

và xác ñịnh hiệu giá virus (Lan và cs, 2005)

2.2 Căn bệnh học

2.2.1 Phân loại virus gây bệnh Care

Canine Distemper Virus (CDV) là một thành viên của giống

Morbillivirus, thuộc họ Paramixoviridae Các thành viên khác của giống Morbillivirus như virus gây bệnh sởi trên người (MV), virus dịch tả trâu bò (RPV), virus gây bệnh trên ñộng vật nhai lại nhỏ (PPRV), virus gây bệnh trên ñộng vật có vú dưới nước (cá heo, hải cẩu) (Griffin, 2001; Murphy, 1999) Virus Care cũng gây bệnh trên ñộng vật hoang dã ăn thịt và hổ (Appel và cs, 1994; Frolich và cs, 2000; Martella và cs, 2002)

Morbillivirus là một virus tương ñối lớn (ñường kính 150 – 250nm) với cấu trúc xoắn ốc, chúng có một lớp vỏ lipoprotein (Kennedy và cs, 1989)

Mặc dù có những sự khác biệt nhỏ về kháng nguyên giữa các chủng CDV khác nhau nhưng nó thường ñược chấp nhận là chỉ có một serotype Tuy nhiên, có sự khác biệt ñáng kể trong khả năng gây bệnh của các chủng virus phân lập và các type ở các khu vực ñịa lý khác nhau ñã ñược nói tới Các type của CDV bao gồm: Asia 1 (Nhật Bản, Trung Quốc), Asia 2 (chỉ có ở Nhật Bản), Bắc Cực, ñộng vật hoang dã châu Âu, USA 1 và 2, CDV cổ ñiển (Onderstepoort, Convac, Rockborne và Snyder Hill) (Haas và cs, 1997; 1999; Harder và Osterhaus, 1997; Martella và cs, 2006; 2007; Yoshida và cs, 1998) Bên cạnh ñó, dựa trên trình tự nucleotide của ñoạn gen mã hóa cho protein H, Lan NT và cs, (2008) ñã chia ra thành 5 type virus lớn ñược phân lập từ những vùng ñịa lý khác nhau: type Châu Âu, cổ ñiển (Classic type), Asia 1, Asia 2 và USA

2.2.2 Hình thái của virus Care

Hình thái virus quan sát ñược thấy dưới kính hiển vi ñiện tử có hình vòng tròn, hình bán nguyệt do các sợi cuộn quanh tròn mà thành Dạng tròn này có ñường kính ño ñược 115nm ñến 230nm Màng cuộn kép có ñộ dày 75

ñến 85Ao với bề mặt phủ các sợi xoắn ốc từ bên trong ra (Kennedy và cs,

1989; Ron Hines, 2006)

Hình 1 Hình thái của virus ñược chụp dưới kính hiển vi

(http://www.nature.com/nrmicro/journal/v4/n12/box/nrmicro1550_BX1.html)

2.2.3 Cấu trúc của virus Care

Nucleocapside chứa một sợi ñơn RNA không phân ñoạn gồm khoảng 15.690 nucleotide mã hóa thành 1 protein không cấu trúc (C) và 6 protein cấu trúc gồm: large protein (L), haemagglutinin (H), phosphoprotein (P), nucleocapsid protein (N), fusion protein (F) và matrix protein (M) (Diallo, 1990)

Protein không cấu trúc (C) ñược mã hóa từ một khung ñọc mở khác ở gen P (Lamb và Kolakofsky, 2001) Chức năng của protein C chưa ñược xác ñịnh rõ ràng

N: Nucleocapsid, khối lượng phân tử 58 kDa bao quanh và bảo vệ cho

hệ gen của virus, nhạy cảm với những chất phân giải protein

P: Phosphoprotein, khối lượng phân tử 54,9 - 66 kDa, nhạy cảm với những yếu tố phân giải protein, ñóng vai trò quan trọng trong sự sao chép của RNA (Sidhu và cs, 1993)

M: Matrix, khối lượng phân tử 34 - 39 kDa, ñóng vai trò quan trọng trong

sự trưởng thành của virus và nối nucleocapsid với những protein vỏ bọc

F: Fusion là glycoprotein trên bề mặt của vỏ bọc, khối lượng phân tử

59 – 62 kDa, ñóng vai trò trong sự kết hợp virus với thụ thể màng tế bào, dẫn ñến kết hợp nhiều tế bào cảm nhiễm (hợp bào)

H: Protein ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin) hay yếu tố kết dính, là glycoprotein thứ hai của vỏ bọc, khối lượng phân tử 76 – 80 kDa, ñóng vai trò gắn virus vào tế bào ñích Ở virus Care, protein này không hấp phụ hồng cầu cũng không ngưng kết hồng cầu

L: Large protein có khối lượng phân tử lớn 180 - 200 kDa, do có kích thước lớn, nó sẽ thể hiện phần lớn các hoạt ñộng của RNA polymerase

(Diallo, 1990)

2.2.4 Sức ñề kháng của virus Care

Virus Care là một virus không ổn ñịnh và nhạy cảm với nhiệt ñộ, tia

UV, dung môi hòa tan lipid, chất tẩy rửa và chất ôxy hóa (Grone và cs, 1998) mặc dù nó có vỏ bọc protein chống lại sự vô hoạt của các tác nhân bên ngoài Năm 1954, Celiker và Gillespie ñã dùng virus sài sốt chó thích nghi trên môi trường phôi trứng ñể nghiên cứu sự ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến tính cảm nhiễm của virus và tác giả ñã nhận thấy: Virus Care cực kỳ mẫn cảm với sức nóng Virus bị phá hủy ở 50 - 600C trong 30 phút Trong mô cô lập nó tồn tại ñược ít nhất một giờ ở 370C và 3 giờ ở 200C (nhiệt ñộ phòng) Thời tiết ấm áp

virus không thể tồn tại lâu trong chuồng nuôi chó sau khi chó bị bệnh ñược chuyển ñi

Thời gian sống và duy trì ñộc lực của virus sẽ lớn hơn trong ñiều kiện nhiệt ñộ lạnh Ở nhiệt ñộ dưới 00C, nó có thể tồn tại trong môi trường vài ngày nếu ñược bảo vệ bởi các vật liệu hữu cơ (Greene và Appel, 2006) Dưới nhiệt ñộ ñóng băng virus ñược ổn ñịnh Virus tồn tại ñược ở nhiệt ñộ -650C

ít nhất là 7 năm Việc bảo quản virus ở dạng ñông khô có ý nghĩa rất lớn trong việc bảo quản giống virus, sản xuất vacxin và nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

ðộ pH: virus ổn ñịnh ở pH = 4,5 – 9

Vỏ bọc của virus rất mẫn cảm với ete, clorofor, fomalin loãng (<0.5%), phenol (75%), dung dịch amoni Do vậy, khi dùng những chất này ñể tiêu ñộc chuồng và bệnh viện mang lại hiệu quả cao (Greene và Appel, 1987)

2.2.5 Cơ chế sinh bệnh

Virus gây bệnh Care là virus gây nhiễm hướng mô lympho, niêm mạc

và mô thần kinh ðầu tiên, virus nhân lên ở mô lympho của hệ hô hấp Sau ñó virus nhiễm vào các dịch bạch huyết rồi vào máu gây bại huyết Virus tác ñộng ñến nội mạc mạch máu và gây sốt, sốt kéo dài từ 1 - 2 ngày Virus theo máu vào hệ hô hấp, hệ tiêu hóa, hệ tiết niệu và hệ thống thần kinh trung ương cũng như dây thần kinh thị giác Do sự suy yếu của hệ bạch huyết, hệ thống phòng vệ quan trọng của cơ thể ñã làm suy giảm miễn dịch và tạo ñiều kiện cho các vi khuẩn như: Staphylococcus, Bronchisepticum, Salmonella, gây bệnh Ít ngày sau, cơn sốt thứ 2 xuất hiện, biểu hiện trầm trọng hơn do các nhiễm trùng nặng trong phủ tạng

Theo Carter và cs, 1992 Trong quá trình phơi nhiễm tự nhiên, CDV lây lan qua ñường khí dung vào biểu mô ñường hô hấp trên Trong 24 giờ nó sẽ nhân lên trong ñại thực bào và lan rộng ra nhờ hệ lympho cục bộ ñến hạch

amidal và các hạch lympho phế quản 2 - 4 ngày sau nhiễm số lượng virus tăng ở hạch amidal và hạch sau hầu, hạch lympho khí quản Nhưng chỉ có một số ít tế bào ñơn nhân bị nhiễm CDV Sau 4 - 6 ngày virus nhân lên trong

tế bào lympho ở lách, biểu mô dạ dày và ruột non, màng treo ruột và trong tế bào Kuffer ở gan Sự lây lan của virus trong các hệ lympho là nguyên nhân gây pha sốt ñầu tiên và virus ñã phá huỷ các tế bào lympho (lympho B, lympho T) dẫn tới chứng giảm bạch cầu

Ngày thứ 8 và 9 sau khi nhiễm, virus theo máu tới thần kinh trung ương

và phụ thuộc vào miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào Quá trình bài thải ra ngoài bắt ñầu khi virus có mặt ở biểu mô và thông qua chất bài tiết của cơ thể thậm chí khi chó chỉ mắc bệnh nhẹ

Ngày thứ 14 sau nhiễm, với chó có hàm lượng kháng thể cao và tế bào T ñộc sẽ giúp loại bỏ virus khỏi các mô và ñộng vật sẽ không có triệu chứng lâm sàng Kháng thể IgG-CDV sẽ trung hoà hết CDV và ức chế lây lan của CDV giữa các tế bào

Với chó có ñáp ứng miễn dịch trung bình thì hàm lượng kháng thể sẽ giảm sau 9 - 14 ngày sau nhiễm, virus sẽ lây lan tới các biểu mô Triệu chứng lâm sàng có thể sẽ bị loại bỏ khi hàm lượng kháng thể tăng nhưng không thể tồn tại lâu dài khi virus xâm nhập vào mô mạch, thần kinh và da như da bàn chân Sự hồi phục sau nhiễm sẽ tạo ra miễn dịch lâu dài và ngăn ngừa sự bài thải virus Khi chó phơi nhiễm lại với virus ñộc lực cao, số lượng lớn hoặc trong tình trạng stress, có sự dung nạp miễn dịch thì chó có thể bị nhiễm lại

Với chó có sức ñề kháng kém, từ ngày 9 - 14 sau nhiễm, virus sẽ lan tràn trong các mô kể cả da, tuyến nội, ngoại tiết, trong mô dạ dày, ruột, ñường

hô hấp, niệu quản Triệu chứng lâm sàng của bệnh thường nặng và virus tồn tại lâu dài trong các mô tới khi con bệnh chết Trình tự lây lan của virus phụ thuộc vào chủng virus và có thể ngừng lại sau 1 - 2 tuần Nghiên cứu về huyết

thanh học cho thấy hàm lượng kháng thể khác nhau gây ra mức ựộ bệnh khác nhau Chỉ có những con chó tạo ra ựược kháng thể kháng vỏ của virus mới có khả năng tránh ựược virus tồn tại ở thần kinh trung ương Hậu quả của nhiễm trùng thần kinh trung ương phụ thuộc vào hàm lượng kháng thể IgG trong tuần hoàn do kháng nguyên H-glyco tạo nên Nhiễm kế phát vi khuẩn gây các biểu hiện khác nhau ở thần kinh trung ương và gây nên các biến chứng khác ở ựường hô hấp, tiêu hoá

2.3 Dịch tễ học

2.3.1 Loài vật mắc bệnh

Trong tự nhiên tất cả các giống chó ựều cảm thụ với virus Care, nhưng chó ngoại mẫn cảm hơn chó nội (Trần Thanh Phong, 1996) Virus Care cũng gây bệnh trên ựộng vật hoang dã ăn thịt (Appel và cs, 1994; Frolich và cs, 2000; Martella và cs, 2002) Năm 1987, người ta tìm thấy bệnh do virus Care trên hải cẩu (Phocasibirica) ở hồ Baikal Sibero những chủng này lần lượt ựược ựặt tên PDV1 và PDV2 (Phocin Distemper virus) Năm 2006, người ta thấy bệnh Care trên khỉ nâu châu Âu trong trại Quảng đông Trung Quốc Qua phân tắch trình tự axit amin của virus tại thực ựịa cho thấy ựây là chủng virus cường ựộc (Wei Qiu và cs, 2011)

Trong phòng thắ nghiệm, có thể gây bệnh cho chó con và chồn Ngoài

ra, có thể dùng chuột lang, thỏ, chuột nhắt trắng, khỉ ựể gây nhiễm

2.3.2 Lứa tuổi mắc bệnh

Trong tự nhiên hầu hết xảy ra ở chó từ 2 ựến 12 tháng tuổi, nhiều nhất

là chó từ 3 ựến 6 tháng tuổi Việc gây bệnh thử nghiệm trên chó 6 tháng tuổi

dễ hơn chó 3 tuần tuổi do chó 3 tuần tuổi có miễn dịch thụ ựộng thu nhận ựược từ mẹ (Hồ đình Chúc và cs, 1993; Simpson và cs, 1994) Người ta cũng ựã ghi nhận virus Care gây viêm não trên chó lớn tuổi theo nghiên cứu của Merchant và cs trong giai ựoạn 1961 Ờ 1969

2.3.3 Mùa vụ nhiễm bệnh

Tô Du và Xuân Giao (2006), khi nghiên cứu về dịch tễ học bệnh Care cho rằng tất cả các loài chó ựều cảm thụ bệnh, nhưng mẫn cảm hơn là loài chó lai, chó cảnh, chó nội ắt mẫn cảm hơn Bệnh xảy ra quanh năm nhưng xuất hiện nhiều khi có sự thay ựổi thời tiết ựặc biệt là những ngày mưa, ựộ ẩm cao Ở Việt Nam, bệnh thường diễn ra vào thời ựiểm giao mùa, từ xuân sang hè

2.4 Truyền nhiễm học

2.4.1 Chất chứa virus

Trong cơ thể chó mắc bệnh Care, virus thường có trong máu, phủ tạng, các chất bài tiết, ựặc biệt nước tiểu thường xuyên có virus Các cơ quan tập trung nhiều virus ở chó mắc Care như: não, lách, phổi, hạch, tuỷ xương theo nghiên cứu của Lan và cs (2005)

2.4.2 đường xâm nhập và cách thức lây lan

Chó mắc bệnh bài xuất virus qua các chất bài tiết của cơ thể như phân, nước tiểu, nước mũi, các dịch tiếtẦ và khuếch tán vào không khắ trong các giọt nước nhỏ Virus có thể tồn tại trong các dạng này 6 - 22 ngày ngoài môi trường Từ ựó, virus dễ dàng xâm nhập vào thức ăn, nước uống Bệnh Care có tắnh chất lây lan rất cao, các chó tiếp xúc trực tiếp với chó mắc bệnh, với chất bài tiết chứa virus hay thông qua thức ăn, nước uống có mầm bệnh thì dễ mắc bệnh đặc biệt, virus còn có thể xâm nhập vào cơ thể qua da (Nguyễn Vĩnh Phước và cs, 1978)

Mặc dù virus ựược bài tiết ra ngoài môi trường qua hầu hết những dịch tiết của cơ thể nhưng bệnh ắt lây lan qua nước tiểu Theo Hồ đình Chúc (1993) dịch tiết ở ựường hô hấp do chó mắc bệnh ho bắn ra có thể gây bệnh cho các con chó khác

Trong phòng thắ nghiệm, có thể ựưa virus vào cơ thể của ựộng vật thử nghiệm theo con ựường tiêm, uống, bôi vào niêm mạc mũi ựều gây ựược bệnh

2.4.3 Tỷ lệ ốm, tỷ lệ chết

Thời kỳ ủ bệnh Care thường là 3 - 6 ngày (dài nhất là 17 - 21 ngày) và

có thể kéo dài khoảng trên dưới 1 tháng Chó phát bệnh thường chết với tỷ lệ chết 50 - 80%, thậm chắ lên ựến 100% nếu không ựiều trị kịp thời (Hồ đình Chúc, 1993) Khi chó mắc các bệnh kế phát như parvovirus, viêm gan truyền nhiễm làm cho tỷ lệ chết càng cao (Vương đức Chất và Lê Thị Tài, 2004; Tô

Quan sát trên lâm sàng thấy sốt thường xảy ra từ 3 ựến 6 ngày sau khi nhiễm virus Care Thời kỳ nung bệnh cho tới khi bắt ựầu xảy ra các triệu chứng lâm sàng của bệnh Care cấp tắnh thường từ 14 ựến 18 ngày Sau khi nhiễm bệnh một cơn sốt ngắn xảy ra từ ngày thứ 4 tới ngày thứ 7 nhưng không có triệu chứng rõ rệt của bệnh Care Nhiệt ựộ trở lại bình thường sau

ựó từ ngày 7 ựến ngày 14, sau ựó thân nhiệt lại tăng cao kèm theo viêm kết mạc và viêm mũi Tiếp theo ho, ỉa chảy, nôn mửa, biếng ăn, mất nước và giảm cân với sự suy nhược thường quan sát thấy ở chó mắc bệnh Care cấp tắnh Dịch mũi và mắt chảy ra có mủ nhày Viêm phổi thường do bội nhiễm vi khuẩn Da bị phát ban có thể viêm mủ ở vùng da bụng Triệu chứng viêm não cấp tắnh có thể phát triển với những biểu hiện khác nhau: sự co thắt cơ vân theo nhịp (Myolonus), cơ vân bị vặn không theo ý muốn, thể hiện như dạng nhai kẹo cao su, vận ựộng không ựiều hòa và không phối hợp với nhau Phản ứng sợ hãi và mù là những triệu chứng thường thấy trong bệnh Care cấp tắnh Khi xuất hiện triệu chứng thần kinh thời gian ngắn sau thì chết (Summers và

cs, 1978)

Theo Nguyễn Văn Thanh (2007), chó mắc bệnh Care ựầu tiên xuất hiện các triệu chứng như: mệt mỏi, ủ rũ, ăn ắt, không thắch vận ựộng, chảy nước mắt, nước mũi, nôn mửa; sau ựó sốt, nhịp thở tăng, thân nhiệt lên ựến 40 Ờ 41,50C kéo dài từ 24 Ờ 26 giở rồi thân nhiệt giảm xuống 38,5 - 39,50C Lúc này chó ăn ắt, mệt mỏi 3 - 4 ngày sau xuất hiện cơn sốt thứ hai đó là do sự bội nhiễm của các vi khuẩn kế phát Cơn sốt kéo dài 3 - 4 ngày Lúc này chó bắt ựầu thể hiện các triệu chứng ở ựường hô hấp, tiêu hoá, da và thần kinh

- Triệu chứng ở ựường tiêu hoá:

Do viêm cata ở dạ dày và ruột non nên con vật khát, nôn mửa rồi ỉa chảy, lúc ựầu phân loãng, có bọt sau ựó có lẫn máu, phân có màu cà phê nhạt Trường hợp nặng phân có thể lẫn máu tươi, niêm mạc ruột bong ra làm phân

có mùi tanh khắm rất khó chịu Chó thường bị viêm niêm mạc miệng và hạch hạnh nhân

Nôn là triệu chứng thường gặp của bệnh Care Nôn thường xuất hiện sớm, lúc ựầu nôn ra thức ăn sau ựó nôn khan hoặc nôn ra bọt có màu vàng

- Triệu chứng ựường hô hấp:

Chó bị viêm mũi, thanh quản, phế quản rồi viêm phổi nên chó khó thở, nhịp thở tăng rõ, phổi có tiếng ran ướt Con vật chảy nhiều nước mũi lúc ựầu loãng sau ựặc dần, ựôi khi có mủ xanh hoặc máu ựen Chó bị ho, lúc ựầu ho khan, sau ho ướt, chó thở gấp, thè lưỡi ra mà thở

Ngoài ra, chó bệnh thường xuyên có viêm mắt, chảy nước mắt Lúc ựầu nước mắt trong, sau ựặc dần như mủ, chó bị loét, ựục giác mạc

- Triệu chứng trên da:

đặc trưng là sự xuất hiện các nốt sài ở bụng, bẹn, ngực, phắa trong ựùi đầu tiên, ở các vị trắ da trên nổi những nốt chấm ựỏ, những chấm ựỏ ựó biến thành những nốt sài to bằng hạt ựỗ xanh, hạt gạo, lúc ựầu ựỏ sau bội nhiễm vi khuẩn nên mềm ra, có mủ, khi vỡ làm lông bết lại, hôi hám Các nốt sài có thể

vỡ ra hoặc không vỡ ra rồi hình thành vảy, bong ñi, ñể lại một vết thương nhanh chóng lành và không hình thành sẹo

Sau khi bị bệnh 10 - 15 ngày, ở 80 - 90% số con bị bệnh, da ở gan bàn chân tăng sinh dày lên, có khi bị nứt ra làm chó ñi khập khiễng

- Triệu chứng thần kinh:

Quá trình tiến triển, con vật có thể thể hiện các triệu chứng thần kinh như ủ rủ, buồn rầu hoặc hung dữ sau ñó là các cơn co giật ñều ñặn ở bắp thịt, mũi, tai, chân hoặc toàn thân cuối cùng là liệt Con vật loạng choạng, ñứng lên, ngã xuống, ñâm sầm vào tường, sùi bọt mép Cuối cùng chó nằm bệt, loạn nhịp tim, thân nhiệt hạ và chết Tỷ lệ chết có thể tới 60%, bệnh kéo dài 2- 5 tuần Những con lành bệnh thường có di chứng gầy còm, ñi xiêu vẹo, mù và ñiếc…

2.5.2 Bệnh tích

Theo Appel và Summer (1995), bệnh tích ñại thể có thể gặp bao gồm sừng hoá ở mõm và gan bàn chân Tuỳ theo mức ñộ kế phát các vi khuẩn có thể thấy viêm phế quản phổi, viêm ruột, mụn mủ ở da,

Bệnh tích ñường tiêu hóa: viêm cata ruột, loét ruột, hạch ruột sưng, gan thoái hóa mỡ

ðường hô hấp: viêm mũi, thanh quản, khí quản, viêm phổi, có mụn mủ trong phổi, có khi vỡ ra gây viêm phế mạc

Thần kinh: viêm não, não tụ máu, các tế bào thần kinh bị hoại tử

Tế bào thượng bì ñường hô hấp, tiết niệu, lưỡi, mắt, hạch và tuyến nước bọt có thể tìm thấy tiểu thể lenst trong nguyên sinh chất

Theo Carter và cs, (1992), chó con trước sinh hoặc sơ sinh bị nhiễm CDV thường bị teo tuyến ức, viêm phổi hoặc viêm ruột thể cata Ở những con chó sau khi sinh xuất hiện triệu chứng toàn thân Tổn thương ñường hô hấp trên kể cả viêm kết mạc mắt, viêm mũi, viêm nhánh khí phế quản Chó bị sừng hoá mũi, bàn chân thường thấy ở chó có triệu chứng thần kinh Tổn

thương nhẹ trung khu thần kinh, hiếm gặp sung huyết màng não, trong buồng não và tăng áp lực hệ thần kinh trung ương do phù não

Suy giảm lympho là bệnh tích ñiển hình ở chó có triệu chứng toàn thân Viêm kẽ phổi lan toả ñặc trưng là sự dày lên của vách phế nang và sự tăng sinh của biểu mô vách phế nang Lòng phế nang bao gồm các tế bào long vách phế nang và ñại thực bào Biểu mô ñường tiết niệu sưng phồng lên Chó con mắc bệnh sẽ bị hỏng men răng, hoại tử và thoái hoá tế bào tạo men răng

Viêm tinh hoàn thường thấy ở chó mắc bệnh Care ðiều này có thể giải thích ñược sự giảm sinh tinh trùng, giảm chất tiết của tiền liệt tuyến sau khi hồi phục ở chó ñực

Chó sơ sinh mắc bệnh có bệnh tích viêm não cấp tính, thoái hoá tế bào thần kinh và phá huỷ myelin Những con sống sót, các vùng ñốm hoại tử thay vào bởi các tế bào sao phì ñại, nơi tạo thành mạch lưới do ñại thực bào hấp thu myelin Biến ñổi trầm trọng nhất là chất trắng ở thần kinh trung ương, biến ñổi có thể tìm thấy trên cuống tiểu não sau, từ sừng lưng của tủy sống ñến buồng não IV Tổn thương cũng thấy ở não giữa và thuỳ thái dương của ñại não Các vùng trên bề mặt như bó thị giác, gấp nếp vỏ não, cách nhánh thần kinh bề mặt não, cũng bị ảnh hưởng

Ở một số chó, chủ yếu gây ảnh hưởng ở ñại não và ñồi thị Trường hợp nặng có thể làm huỷ myelin tạo các không bào xốp ở chất trắng, viêm phản ứng tế bào thần kinh ñệm Thể vùi trong bào tương và trong nhân chủ yếu tìm thấy ở tế bào sao và tế bào thần kinh

Chó ñược miễn dịch sẽ phát triển thành viêm não và giảm bạch cầu Những tổn thương này thường kết hợp với các triệu chứng mất thăng bằng và rối loạn tiền ñình Tổn thương này ñược ñặc trưng bởi sự lan rộng của những ñám cặn lympho bào xung quanh vùng myelin bị hủy và thần kinh bị thoái hoá Chúng có thể lan rộng và trầm trọng hơn ở trường hợp viêm não cấp tính

Trường hợp mạn tắnh, tổn thương có thể phát triển thành xơ cứng trong não ựặc trưng bởi sự lắng cặn và thay thế của các mô thần kinh bởi các mạng lưới các tế bào sao dày ựặc

Ngược lại, tổn thương do tiêm vacxin ựược ựặc trưng bởi sự viêm não dẫn tới hoại tử não với vùng ưu tiên là sừng bụng Thể vùi có thể tìm thấy trong nhân hoặc bào tương tế bào sao và tế bào thần kinh

Kiểm tra tổ chức học, thể vùi CDV thường thấy nhất trong bào tương

và nhuộm màu axit, có ựường kắnh 1 - 5ộm, và tìm thấy ở tế bào biểu mô trong lớp chắnh thức màng nhầy, tế bào mắt, bạch cầu, tế bào thần kinh ựệm

và tế bào thần kinh chắnh thức Thể vùi tìm thấy sau khi nhiễm bệnh 5 - 6 tuần trong hệ lympho và ựường tiết niệu Thể vùi trong nhân phân bố nhiều nhất ở biểu mô tuyến

Hình thái thể vùi vẫn chưa ựược biết rõ Hoá tổ chức cho thấy thể vùi ựược tạo ra từ sự kết hợp giữa vỏ nucleocapsid của virus và cặn của các tế bào

là kết quả sự nhiễm virus Ta không thể khẳng ựịnh hoàn toàn là có bệnh Care khi chỉ có sự xuất hiện của thể vùi Thể vùi ựặc trưng trong bào tương khi nhiễm CDV cũng xác ựịnh ựược ở bàng quang chó bình thường đáng tiếc thể vùi không chỉ không ựặc trưng mà còn có thể xuất hiện muộn trong bệnh

Sự hình thành tế bào khổng lồ ựầu tiên trong chất trắng của thần kinh trung ương và tiếp ựó là hạch lympho, phổi, lớp màng não mỏng là ựiểm riêng biệt của virus Care Những phát hiện bệnh lý này có thể sử dụng ựể chẩn ựoán chắnh xác sự nhiễm CDV (Greene và Appel, 1987)

2.6 Chẩn ựoán bệnh

2.6.1 Dựa vào ựặc ựiểm dịch tễ học của bệnh

Bệnh chủ yếu xảy ra ở chó 2 ựến 12 tháng tuổi, ở thời ựiểm giao mùa, thời tiết thay ựổi ựột ngột, ựộ ẩm cao hoặc lạnh

2.6.2 Dựa vào triệu chứng lâm sàng

Chẩn ựoán bệnh Care thể cấp tắnh và á cấp tắnh có thể dựa vào bệnh sử

và triệu chứng lâm sàng Khi có những triệu chứng lâm sàng ựặc trưng của bệnh thì có thể nghi ngờ chó mắc bệnh Care Ở những chó chưa tiêm phòng hoặc chó trưởng thành không ựược tiêm phòng ựầy ựủ có những triệu chứng sốt, triệu chứng hô hấp như chảy nước mũi, ho, có dử mắt , triệu chứng tiêu hóa hoặc triệu chứng thần kinh thì khả năng chó mắc phải bệnh Care là rất cao (Hồ đình Chúc, 1993)

Chẩn ựoán bệnh dựa vào triệu chứng lâm sàng cần phân biệt với những bệnh sau:

Bệnh viêm gan truyền nhiễm: Bụng chướng to, sờ nắn vùng gan thấy con vật rất ựau ựớn Giác mạc ựục hơn, có thể như Ộcùi nhãnỢ

Bệnh do Parvovirus: Gây viêm dạ dày, ruột xuất huyết do hoại tử tế bào thượng bì nhung mao ruột, thường ỉa chảy phân loãng như nước và có máu tươi, con vật chết rất nhanh, không có triệu chứng thần kinh

Bệnh do Leptospira: Viêm dạ dày, ruột chảy máu, viêm loét miệng và thường xuất hiện ở chó lớn, vàng da, niêm mạc, số lượng bạch cầu tăng

2.6.3 Chẩn ựoán trong phòng thắ nghiệm

Tiêm truyền bệnh phẩm cho ựộng vật thắ nghiệm

Mẫu bệnh phẩm là máu, lách, gan, phổi, các chất bài tiết và dịch nước mũi, nước mắt của chó nghi mắc bệnh ựem nghiền, chế thành huyễn dịch và

tiêm cho động vật thí nghiệm Ưu tiên sử dụng chồn hoặc chĩ non, ngồi ra

cĩ thể tiêm cho chuột lang, chuột nhắt trắng, thỏ

Quan sát tiến triển của bệnh gây ra trên động vật thí nghiệm, mổ khám bệnh tích đại thể và kết luận

Trong bệnh phẩm cĩ thể phân lập được một số vi khuẩn kế phát như Pasteurella, Bacillus bronchisepticus, Staphylococcus, E coli và Salmonella

Phân lập virus trên mơi trường tế bào

Mẫu bệnh phẩm đem nghiền thành huyễn dịch, xử lý kháng sinh, ly tâm lấy nước trong và lọc qua màng lọc vi khuẩn rồi đem gây nhiễm lên mơi trường tế bào một lớp thích hợp Virus Care chỉ cĩ thể nhân lên và gây bệnh

tích tế bào (Cyto pathogenic Effect - CPE) khi gây nhiễm lên tế bào phù hợp

Bệnh tích tế bào do CDV gây ra cĩ thể quan sát được là những thể hợp bào, tế bào bị phá hủy màng và xuất hiện nhiều thể vùi ở trung tâm vùng tế bào xuất hiện CPE

Sự xuất hiện nhiều hay ít, nhanh hay chậm của CPE phụ thuộc vào số lượng, độc lực của virus và “tuổi” tế bào Tế bào mới nuơi cấy thì virus gây nhiễm dễ dàng hơn, CPE xuất hiện nhanh và nhiều hơn ở những tế bào đã nuơi cấy nhiều ngày (Lan và cs, 2005)

Chẩn đốn bằng phản ứng miễn dịch đánh dấu enzym (ELISA)

ELISA(Enzim linked Immuno Sorbent Assay) là một phương pháp xét

nghiệm miễn dịch dựa trên cơ chế kết quả đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, cĩ sử dụng kháng thể cĩ gắn enzyme và chất phát quang nhằm phát hiện ra sự kết hợp đĩ (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2009)

Chẩn đốn bằng phương pháp nhuộm hĩa mơ miễn dịch

Nhuộm hĩa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) là phương pháp cĩ độ chính xác cao cho phép phát hiện kháng nguyên tồn tại trong tổ chức Phương pháp này được thực hiện dựa trên nghuyên lý là sự kết hợp

giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu và được phát hiện bằng chất chỉ thị màu (Nguyễn Hữu Nam, 2011)

Chẩn đốn bệnh bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang

Phản ứng miễn dịch huỳnh quang IF (Immuno fluorescent test) cĩ độ chính xác cao, dùng chất đánh dấu là chất phát huỳnh quang (khi hấp thụ 1 ánh sáng cĩ bước sĩng nhất định sẽ phát ra 1 ánh sáng cĩ bước sĩng dài hơn) Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên lý: khi dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể đã được nhuộm bằng chất phát huỳnh quang, rồi cho kết hợp với kháng nguyên – kháng thể khi soi dưới kính hiển vi huỳnh quang

sẽ phát sáng (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010)

Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp

Trong phản ứng này thường dùng kháng thể đặc hiệu nhuộm chất phát huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên chưa biết

Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

Dùng kháng kháng thể được nhuộm chất phát huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên chưa biết

Chẩn đốn phát hiện RNA của virus Care bằng RT- PCR

Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription Polymesase Chain

Reaction) là sự kết hợp giữa phương pháp phiên mã ngược và phương pháp

PCR Phương pháp này cĩ thể phát hiện các RNA tồn tại với lượng rất thấp

mà khĩ cĩ thể phát hiện bằng phương pháp khác

Do Taq polymerase sử dụng trong PCR khơng hoạt động trên RNA nên trước hết cần chuyển RNA thành cDNA, nhờ enzyme phiên mã ngược Reverse Transcriptase (RT) Sau đĩ, cDNA này sẽ được khuếch đại nhờ Taq polymerase Dấu hiệu xác định bệnh là sản phẩm nhân bản một đoạn gen đặc hiệu của virus Sự hiện diện của sản phẩm này được nhận biết qua điện di trên gel agarose (Lan và cs, 2008)

Chẩn đốn phát hiện bệnh Care bằng kit chẩn đốn nhanh

Hiện nay, nhiều phịng khám thú y sử dụng phương pháp xét nghiệm nhanh bằng thiết bị thiết kế sẵn, đơn giản, tiện dụng và cĩ độ chính xác cao

Về bản chất, đây là phương pháp xét nghiệm ELISA để phát hiện kháng nguyên của virus Care trong máu, dịch kết mạc mắt và nước mũi của chĩ Hai kháng thể đơn dịng trong thiết bị sẽ kết hợp đặc hiệu với các nhĩm quyết định kháng nguyên khác nhau của virus Care Sau khi cho bệnh phẩm vào vị trí đệm Cellulose của thiết bị, virus Care sẽ kết hợp với kháng thể đơn dịng thứ nhất Rồi phức hợp này kết hợp với kháng thể đơn dịng khác trong màng nitơ - cellulose của thiết bị để tạo thành hợp chất kép hồn chỉnh Kết quả xét nghiệm được biểu hiện qua các vạch do thiết bị sử dụng theo phép

MỘT SỐ HÌNH ẢNH KIT CHẨN ðỐN BỆNH CARE

Hình 2 Kít chẩn đốn nhanh

bệnh Care

Hình 3 Khi chĩ mắc bệnh Care kít

lên hai vạch

Những chó ốm phải nuôi cách ly, chuồng chó ốm phải tiêu ñộc bằng thuốc sát trùng, xử lý chất bài tiết và thức ăn nước uống thừa của chó bệnh

Chó mới mua về phải kiểm tra kỹ hồ sơ, nuôi cách ly, theo dõi ít nhất

10 ngày, nếu không thấy có biểu hiện của bệnh mới cho nhập ñàn

Phòng bệnh bằng tiêm phòng vacxin

Tiêm vacxin là biện pháp phòng bệnh dễ dàng và có hiệu quả nhất ñối với các bệnh do virus gây ra nói chung, trong ñó có bệnh Care Vacxin phòng bệnh Care ñược tiêm lần ñầu cho chó lúc 2 tháng tuổi, trong những trường hợp chó có nguy cơ lây nhiễm cao thì có thể tiêm phòng sớm hơn Tiêm nhắc lại sau mũi ñầu tiên 3 ñến 4 tuần Sau ñó, tiêm nhắc lại mỗi năm một lần ñể ñảm bảo khả năng bảo hộ

Theo Greene và Appel (1987), Kháng thể thụ ñộng truyền qua nhau thai và sữa ñầu có tác dụng bảo vệ cho chó con sau sinh và cai sữa Lượng kháng thể giảm một nửa sau 8.4 ngày Có 3% kháng thể truyền qua nhau thai

và 97% truyền qua sữa ñầu, kết quả cho thấy rằng hiệu giá ban ñầu ở chó con mới sinh bằng 77% lượng kháng thể ở con mẹ Nếu không có sự hấp thu sữa ñầu chó con có thể ñược bảo vệ ít nhất 1 - 4 tuần Kháng thể bị ñộng thường biến mất sau 12 - 14 tuần tuổi ðối với chó ñược bú sữa ñầu tiêm cho chó trong khoảng 6 - 16 tuần tuổi cứ 3 - 4 tuần tuổi tiêm 1 lần

Chó khỏi bệnh sau khi mắc tự nhiên hoặc ñược tiêm vacxin, miễn dịch

có thể kéo dài hàng năm Sự bảo vệ có thể ñược bảo ñảm nếu chó không bị

phơi nhiễm với virus ñộc lực cao, số lượng lớn, stress hoặc dung nạp miễn dịch Sau khi tiêm một mũi ñơn vacxin Care cho chó chưa ñược tiêm bất kỳ một loại vacxin nào thì hiếm khi tạo ra ñược miễn dịch kéo dài quá 1 năm Vì

lý do này, mặc dù không có kháng thể thụ ñộng can thiệp thì phải tiêm ít nhất

2 mũi vacxin cách nhau 2 - 4 tuần khi bắt ñầu hết sữa ñầu và ở chó sau 16 tuần tuổi Chó trưởng thành vẫn có thể bị nhiễm Care, mặc dù miễn dịch có thể kéo dài vì vậy phải tiêm vacxin ñịnh kỳ

Mặc dù kháng thể giảm nhưng sự bảo hộ của vacxin có thể kéo dài ít nhất 7 năm Vacxin vô hoạt không tạo ra ñược miễn dịch ñầy ñủ ñể chống lại bệnh sau khi công cường ñộc nhưng nó vẫn có tác dụng bảo hộ tốt hơn so với chó không ñược tiêm vacxin Nhưng ñáng tiếc là vacxin vô hoạt vẫn ñược sử dụng ñể tiêm cho ñộng vật hoang dã dễ bị nhiễm virus và những giống nhập nội Vacxin vô hoạt bị mất gluco-protein bề mặt khác do vậy không tạo ra ñáp ứng miễn dịch khi công cường ñộc Tương tự những vacxin tiểu phần vô hoạt

có chứa kháng nguyên F tiểu phần vô hoạt có tạo ra ñáp ứng miễn dịch ở chó khi công cường ñộc Vacxin có chứa protein H của virus sởi tạo ra ñược kháng thể trung hoà bảo vệ chó khi công cường ñộc CDV Vacxin tái tổ hợp

từ gen tổng hợp protein H của virus sởi hoặc CDV gắn vào virus ñậu ñã ñược thử nghiệm trên chó và chuột Vacxin tái tổ hợp CDV gắn vào cananypox ñã

có ñể phòng bệnh cho chó

Mặc dù ñã có những thành công khi tiêm vacxin phòng bệnh Care nhưng nó có ñáp ứng miễn dịch không kéo dài bằng chó khỏi bệnh sau nhiễm bệnh tự nhiên hoặc qua phòng bệnh thực nghiệm bằng virus cường ñộc Sử dụng vacxin nhược ñộc phòng bệnh CD cho chó ñặt ra nhiều tranh luận về tính hiệu quả và ñộ an toàn

Hiện nay, trên thị trường thuốc thú y Việt Nam, vắc xin phòng bệnh Care cho chó khá phong phú về chủng loại do doanh nghiệp trong nước sản

xuất và nhập khẩu từ nước ngoài Thống kê từ danh mục vắc xin và chế phẩm sinh học ñược phép nhập khẩu năm 2008 cho thấy có tới 17 loại vắc xin phòng Care và 1 loại kháng huyết thanh (Homoserum - Merial, Pháp) ñể phòng và trị bệnh này Trong ñó có sự tham gia của những tên tuổi lớn như Intervet- Hà Lan, Merial- Pháp, Biocan - Cộng hòa Séc, PFRIZER - Mỹ, Fort Dodge Animal Health - Mỹ Xí nghiệp Thuốc thú y trung ương (Vetvaco) ñã chế ñược vắc xin phòng bệnh Care từ chủng virus nhược ñộc ñông khô, sản xuất qua môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp, mỗi liều chứa tối thiểu 103TCID50 virus ðiều này chứng tỏ Việt Nam ñang ngày càng quan tâm ñến bệnh Care và việc phòng bệnh Care

2.7.2 ðiều trị

Dùng kháng huyết thanh: liều 15 – 30 ml/con, tiêm sớm Khi con vật ñã

có triệu chứng viêm phổi hay triệu chứng thần kinh thì kháng huyết thanh không có hiệu lực

Ở các cơ sở ñiều trị theo các bước sau ñây:

Cắt nôn bằng cách tiêm atropin hay primeran 2 ml, tiêm dưới da

Bổ sung nước và chất ñiện giải bằng cách cho uống Ozeron 5%, tiêm nước muối sinh lý 0,9% hay nước ñường Glucoza 5% vào tĩnh mạch khoeo của chó

Cầm ỉa chảy bằng cách cho uống thuốc ñặc trị tiêu chảy chó mèo (ADP), Imodium hay Bisepton, Hampiseptol… ngày uống một lần

Chống bội nhiễm bằng cách tiêm các loại kháng sinh: Gentamycin, Streptomycin + Penicillin G 5000…

An thần cho chó: dùng các loại thuốc có tính chất an thần như: Seduxen, Meprobamat, Novocain, Analgin

Trợ sức, trợ lực cho chó: sử dụng các thuốc trợ tim mạch, trợ sức, trợ lực, cầm máu cho chó như: Cafein, Spartein, Vitamin B1, Vitamin B12,Vitamin K, Vitamin C

ðiều trị bằng glucocorticoid ñể chống trạng thái ức chế miễn dịch trong

3 tuần không gây ức chế ñáp ứng miễn dịch bình thường với vacxin phòng bệnh Care mặc dù ở chó ñược ñiều trị có sự giảm ñáp ứng với phytohemaglutinin của lympho bào Những con chó này cũng sống sót sau khi công cường ñộc CDV

Sự nhiễm Parvovirus vẫn ñược cho là nguyên nhân làm giảm sản sinh kháng thể của chó ñược tiêm vacxin phòng bệnh Care ðồng thời việc chủng vacxin chống bệnh do Parvovirrus cũng ñược cho là gây ức chế ñáp ứng miễn dịch ở chó ñược chủng Care mặc dù những minh chứng ñầy ñủ còn thiếu và

nó cũng chưa ñược chứng minh ở chó nhiều tuổi (Greene và Appel, 1987)

PHẦN III ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM, THỜI GIAN, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng nghiên cứu

- Chó nghi mắc bệnh Care trên ñịa bàn Hà Nội

3.2 ðịa ñiểm nghiên cứu

- Một số phòng khám và ñiều trị bệnh chó mèo trên ñịa bàn Hà Nội

- Bệnh viện thú y trường ðại học nông nghiệp Hà Nội

- Phòng thí nghiệm bộ môn bệnh lý - Khoa thú y của trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

- Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa Thu y, trường ðại học Nông nghiệp

Hà Nội

3.3 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 08 năm 2011 đến tháng 06 năm 2012

3.4 Nội dung nghiên cứu

- Xác định một số triệu chứng lâm sàng của chĩ nghi mắc bệnh Care

- Xác định biến đổi bệnh lý đại thể chủ yếu ở các cơ quan của chĩ nghi mắc bệnh Care

- Xác định bệnh lý vi thể chủ yếu ở các cơ quan của chĩ nghi mắc bệnh Care

- Áp dụng phương pháp miễn dịch huỳnh quang để chẩn đốn bệnh Care

3.5 Nguyên liệu nghiên cứu

3.5.1 Mẫu bệnh phẩm dùng cho nghiên cứu được thu thập từ các cơ quan

Phổi, tim, gan, ruột, hạch, lách, não,… của các chĩ nghi mắc bệnh Care tại địa bàn Hà Nội

3.5.2 Hĩa chất dùng cho nghiên cứu

- Hố chất sử dụng làm tiêu bản vi thể: formol 10%, cồn, xylen, parafin, thuốc nhuộm haematoxylin, thuốc nhuộm eosin, buncanada …

- Hố chất sử dụng làm miễn dịch huỳnh quang: EDTA, PBS, BSA, citrate, HCl, nước cất chỉnh cho được pH = 6.0, (Sigma–Aldrich, Singapore)

- Kháng thể chuẩn (Fluorescent Isothicocynat – Dako - Denmark)

3.5.3 Máy mĩc, dụng cụ

- Máy mĩc sử dụng cho làm tiêu bản vi thể: lọ chứa formol 10%, máy chuyển mẫu tự động (Microm STP 120 – ðức), máy đúc (Microm Ap 280), máy cắt Microton (Microm HM315 – Dức), máy sấy, kính hiển vi thường (Carl Zeiss Microlmaging GmbH 37081 Gotting En, VMI 0189 – ðức), …

- Máy mĩc sử dụng trong việc làm miễn dịch huỳnh quang: bơ can, lị vi sĩng (Panasonic Nhật Bản), tủ lạnh -80oC, tủ lạnh âm -20oC, tủ ấm 37oC (Beschikhung loading Modell 100 – 800, ðức), kính hiển vi huỳnh quang

(Carl Zeiss Microlmaging GmbH 37081 Gotting En, VMI 0190 – ðức)

3.6 Phương pháp nghiên cứu

3.6.1 Theo dõi triệu chứng lâm sàng của chĩ nghi mắc bệnh Care

Triệu chứng lâm sàng của chĩ nghi mắc bệnh Care được xác định thơng qua theo dõi, quan sát và ghi chép đầy đủ ngay từ khi chĩ xuất hiện triệu chứng đầu tiên ðồng thời chúng tơi cũng kết hợp thực tế của địa phương với việc thu thập thơng tin từ người nuơi chĩ và cán bộ thú y để tăng

độ tin cậy cho chẩn đốn

3.6.2 Phương pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể của chĩ nghi mắc bệnh Care

- Phương pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể

Mổ khám xoang ngực

Trước tiên lột bỏ hết cơ ngực, sau đĩ dùng kéo cắt xương cắt một đường bắt đầu từ đầu dưới xương sườn thứ nhất đến đầu dưới của xương sườn cuối cùng, rồi cắt rời xương ức ra khỏi cơ hồnh, phế mạc giữa và bao tim Kiểm tra các vị trí và mặt ngồi các cơ quan xoang ngực: trạng thái tim, trạng thái phổi và các bộ phận liên quan đến màng tim và phổi như hạch phổi là chủ yếu

Các khí quan vùng cổ

Rạch một đường thẳng từ mõm đến đến vùng ngực, mở da ra hai bên, kiểm tra niêm mạc dưới da và tuyến giáp trạng, tuyến nước bọt: vị trí, trọng lượng của tuyến… Kiểm tra sâu hơn nữa là hạch dưới hàm Dùng tay và dao rạch từ từ lấy lưỡi ra ngồi kiểm tra lưỡi, hạch amidal, hầu và thực quản,…

Mổ khám xoang bụng

Rạch một đường thẳng bên trái từ mỏm xương kiếm xuống đến sát hậu mơn Cắt từng lớp da ở bụng và các tổ chức liên kết ra Nếu bụng chướng to

thì phải lấy ngón tay hoặc vật cùn làm thủng màng bụng, luồn ngửa hai ngón tay trỏ và ngón giữa của tay trái vào xoang bụng, tay phải cầm ngửa lưỡi dao luồn vào kẽ hai ngón tay trái ñó rồi vạch vách màng bụng theo hướng từ trên xuống dưới như vậy tránh ñược làm rách dạ dày và ruột Kiểm tra các cơ quan ở xoang bụng:

Kiểm tra: lách, gan, dạ dày, ruột, thận và tuyến thượng thận,

Các cơ quan vùng xoang chậu

Cơ quan sinh dục ñực: bao dịch hoàn, âm nang, qui ñầu, niệu ñạo… Khí quan sinh dục cái: tương mạc từ cung, màng cheo và tổ chức liên kết xung quanh niệu quản, lâm ba quản và hoạch lâm ba Mổ tử cung và âm ñạo ñể quan sát màu sắc, ñộ rắn, lở loét, sẹo…

Bàng quang (bóng ñái): trạng thái tương mạc, số lượng và tính chất của

chất chứa bên trong, trạng thái niêm mạc bàng quang

Trực tràng: kiểm tra tương mạc, niêm mạc và trạng thái phân bên trong

Mổ kiểm tra hộp sọ và não

Cố ñịnh ñầu con vật rồi lột da và cơ vùng trán rồi cưa một ñường ngang sau lồi xương ñỉnh, sau ñó từ hai bên xương ñỉnh men theo xương thái dương hai bên tới giáp phần dưới mũi Lấy dao nạy xương sọ theo các ñường cắt lên trên sẽ bộc lộ ñược não Dùng ngón tay luồn dưới não kẽ nâng não lên, dùng chuôi dao luồn xuống dưới bẩy nhẹ não lên ñế lấy cho dễ Sau ñó luồn kéo cắt ñứt các dây thân kinh khác

3.6.3 Phương pháp làm tiêu bản vi thể và quan sát bệnh tích trên tiêu bản của chó nghi mắc bệnh Care

Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm ñúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE)

- Chuẩn bị

Dụng cụ và hoá chất: Lọ chứa focmol 10%, dao, kéo, panh kẹp, cốc ñựng hoá chất, phiến kính, máy ñúc block, khuôn ñúc, tủ ấm 370C, máy cắt mảnh microton, nước ấm 480C, xylen, parafin, thuốc nhuộm Haematoxilin,

Tiến hành lần lượt các bước sau:

+ Rửa focmol: Lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành các miếng có chiều dài, rộng khoảng 4 – 5mm cho vào khuôn ñúc bằng nhựa ðem rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24 giờ ñể rửa sạch formol

+ ðưa mẫu vào hệ thống máy chuyển ñúc mẫu tự ñộng trong 18 tiếng Lấy mẫu ra và tiến hành ñúc block

+ Hệ thống máy chuyển ñúc mẫu tự ñộng gồm 12 bình

- Cắt dán mảnh

Chuẩn bị: máy cắt, dao cắt, nước ấm 480C, phiến kính, panh kẹp