Nghiên cứu nghiên cứu sản xuất kháng nguyên chẩn đoán bệnh cúm a/h5n1 bằng virus a/anhui 05-h5n1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI *** NGUYỄN THỊ HÀ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG NGUYÊN CHẨN ðOÁN BỆNH CÚM A/H5N1 BẰNG VIRUS A/ANHUI 05-H5N1 LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI – 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI *** NGUYỄN THỊ HÀ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG NGUYÊN CHẨN ðOÁN BỆNH CÚM A/H5N1 BẰNG VIRUS A/ANHUI 05-H5N1 LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : Thú y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. TÔ LONG THÀNH PGS.TS. BÙI THỊ THO HÀ NỘI – 2012 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… i LỜI CAM ðOAN - Tôi xin cam ñoan rằng: Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược sử dung ñể bảo vệ một học vị nào. - Tôi xin cam ñoan rằng: Các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ii LỜI CẢM ƠN Trong thời gian học tập, rèn luyện tại trường và thực hiện nghiên cứu phục vụ Luận Văn Thạc sĩ, tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ nhiệt tình của Ban Giám hiệu nhà trường, Viện ðào tạo Sau ðại học, các thầy cô giáo của trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội. ðến nay, tôi ñã hoàn thành Luận Văn Thạc sĩ với ñề tài “Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên chẩn ñoán bệnh Cúm A H5N1 bằng Virus A/Anhui/05-H5N1”. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, Viện Sau ñại học, Khoa Thú y, các Phòng, Ban cùng các thầy cô giáo trong nhà trường ñã tạo ñiều kiện cho tôi ñược học tập và thu thập nhiều kiến thức về lĩnh vực nghiên cứu khoa học. ðặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể cán bộ công nhân viên chức ở Trung tâm chẩn ñoán Thú y trung ương- Cục Thú y, trực tiếp là thầy giáo hướng dẫn khoa học PGS. TS Tô Long Thành và PGS.TS Bùi Thị Tho Bộ môn Dược –Nội chẩn Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội. Một lần nữa, tôi xin ñược bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới nhà trường, các thầy cô giáo, cơ quan, bạn bè ñồng nghiệp cùng người thân ñã ñộng viên, tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu thực hiện ñề tài. Hà Nội, ngày 10 tháng 9 năm 2012 Tác giả Nguyễn Thị Hà Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iii MỤC LỤC PHẦN I. MỞ ðẦU 1 1.1. ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục tiêu của ñề tài 2 1.3 Ý nghĩa khoa học và thục tiễn của ñề tài 2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Sơ lược về bệnh cúm gia cầm 3 2.1.1. ðịnh nghĩa 3 2.1.2. Lịch sử bệnh cúm gia cầm 3 2.2. Tình hình dịch cúm gia cầm trong nước và trên thế giới 5 2.2.1. Tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam 5 2.2.2. Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới 6 2.3 Triệu chứng bệnh tích bệnh Cúm gia cầm 10 2.3.1. Triệu chứng lâm sàng ñiển hình của bệnh cúm gia cầm chủng ñộc lực cao 11 2.3.2. Triệu chứng lâm sàng của bệnh do những chủng virus cúm ñộc lực thấp 12 2.4. Bệnh tích 12 2.5.Các chiến lược phòng chống bệnh cúm gia cầm. 12 2.6. ðặc ñiểm sinh học của virus cúm typ A 14 2.6.1. ðặc ñiểm cấu trúc chung của virus thuộc họ Orthomyxoviridae 14 2.6.2. ðặc ñiểm hình thái, cấu trúc của virus cúm typ A 15 2.6.3. ðặc tính kháng nguyên của virus cúm typ A 16 2.6.4. Thành phần hóa học 18 2.6.5. Quá trình nhân lên của virus 18 2.6.6. ðộc lực của virus 20 2.6.7. Danh pháp 21 2.6.8. Nuôi cấy và lưu giữ virus cúm gà 21 2.6.9. Nguồn gốc của vi rút A/Anhui05-H5N1 24 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iv PHẦN III. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU25 3.1. Nội dung 25 3.1.1. Tiêm truyền xác ñịnh nồng ñộ pha loãng tốt nhất cho nhân giống vi rút cúm A/H5N1 25 3.1.2. ðánh giá ñộ an toàn (tính không ñộc) của vi rút 25 3.1.3. Vô hoạt vi rút bằng formaldehyde. 25 3.1.4. ðánh giá ñộ thuần khiết của sản phẩm kháng nguyên 25 3.1.5. Kiểm tra tính sinh miễn dịch của sản phẩm kháng nguyên 25 3.1.6. Kiểm tra ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của chế phẩm kháng nguyên tự chế bằng phản ứng HI. 25 3.1.7 So sánh ñánh giá ñộ nhạy của kháng nguyên tự chế với kháng nguyên của Anh bằng mẫu giám sát sau tiêm phòng lấy từ Hà Nội, Nam ðịnh và Vĩnh Phúc 25 3.1.8 Xác ñịnh thời gian bảo quản kháng nguyên tự chế 25 3.2. Nguyên liệu 25 3.3. Phương pháp nghiên cứu 26 3.3.1. Phương pháp tiêm truyền trên trứng ñể nhân giống vi rút (theo quy trình phân lập vi rút cúm gia cầm của CDC/WHO). 26 3.3.2. Phương pháp tiêm truyền cho gà ñể ñánh giá ñộ an toàn (tính không ñộc) của vi rút ñối với gà (theo hướng dẫn của USDA) 27 3.3.3. Phương pháp vô hoạt vi rút bằng formaldehyde 27 3.3.4. Phương pháp kiểm tra vô trùng ñối với sản phẩm kháng nguyên (theo quy trình kiểm nghiệm thông thường) 27 3.3.5. Kiểm tra tính sinh miễn dịch của sản phẩm kháng nguyên 28 3.3.6. Phương pháp kiểm tra ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của chế phẩm kháng nguyên tự chế 34 3.3.6.1. Phương pháp ñánh giá ñộ nhạy 34 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… v 3.3.7. Phương pháp so sánh ñánh giá ñộ nhạy của kháng nguyên tự chế và kháng nguyên của Anh bằng mẫu giám sát sau tiêm phòng lấy từ Hà Nội, Nam ðịnh và Vĩnh Phúc. 35 3.3.8. Phương pháp bảo quản chế phẩm kháng nguyên 36 PHẦN IV 37 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1. Kết quả tiêm truyền xác ñịnh tính ổn ñịnh và nồng ñộ pha loãng tốt nhất cho nhân giống vi rút 37 4.2. Kết quả kiểm tra tính an toàn của giống vi rút H5N1 trên gà 39 4.3. Kết quả vô hoạt vi rút bằng Formaldehyde 41 4.4. Kết quả kiểm tra ñộ vô trùng của sản phẩm kháng nguyên tự chế 42 4.5. Kết quả kiểm tra tính kháng nguyên của sản phẩm kháng nguyên tự chế bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA) 44 4.6. Kết quả ñánh giá chất lượng của các chế phẩm kháng nguyên 44 4.6.1. ðánh giá ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu với các mẫu ñối chứng dương và âm 44 4.6.2. ðánh giá ñộ ñặc hiệu với các kháng thể cúm gia cầm subtype khác 45 4.7. Kết quả so sánh kháng nguyên tự chế và kháng nguyên của Anh bằng phản ứng HI với các mẫu huyết thanh gia cầm ñược thu thập từ Hà Nội, Nam ðịnh và Vĩnh Phúc 46 4.9. Kết quả xác ñịnh thời gian bảo quản kháng nguyên tự chế 53 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 54 5.1. KẾT LUẬN 54 5.2. ðỀ NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vi DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1: Kết quả nhân giống vi rút H5N1 A/Anhui/05-H5N1 38 Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra tính an toàn của vi rút A/Anhui/05-H5N1 41 Bảng 4.3: Kết quả xác ñịnh nồng ñộ formaldehyde dùng ñể vô hoạt vi rút A/Anhui/05-H5N1 42 Bảng 4.4. Kết quả kiểm tra ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của kháng nguyên tự chế A/Anhui/05-H5N1 45 Bảng 4.5. Kết quả ñánh giá ñộ ñặc hiệu của các chế phẩm kháng nguyên tự chế với một số kháng thể chuẩn thuộc các subtype khác nhau 46 Bảng 4.6. Kết quả so sánh kháng nguyên tự chế và kháng nguyên chuẩn 47 Bảng 4.7. Kết quả xét nghiệm các mẫu huyết thanh gia cầm ñã ñược tiêm phòng vaccine H5N1-Re1 và H5N1-Re5 bằng phản ứng HI sử dụng kháng nguyên tự chế và kháng nguyên của Anh 49 Bảng 4.8. Phân bố kết quả xét nghiệm các mẫu huyết thanh theo hiệu giá HI và mối tương quan giữa kháng nguyên A/Anhui/05-H5N1 và kháng nguyên chuẩn của UK 51 Bảng 4.9: Kết quả xác ñịnh thời gian bảo quản chế phẩm kháng nguyên 53 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 1 PHẦN I MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn ñề Nhờ có chủ trương phát triển chăn nuôi ñúng ñắn của ðảng và Nhà nước, trong những năm gần ñây, ngành chăn nuôi gia cầm ñã và ñang ñược chú trọng với ñầu tư khoa học kỹ thuật, nghiên cứu về giống, thức ăn, các biện pháp thú y và tăng cường hợp tác quốc tế, liên doanh, liên kết với các quốc gia có nền chăn nuôi tiên tiến. ðàn gia cầm phát triển nhanh với hàng ngàn trang trại chăn nuôi gia cầm, thủy cầm có qui mô lớn và nhỏ khác nhau. Ngành chăn nuôi ñã ñem lai lợi nhuận cho người chăn nuôi và ñóng góp ngân sách cho nền kinh tế quốc dân. Song song với sự phát triển của ngành chăn nuôi, dịch bệnh luôn luôn tồn tại và xuất hiện các bệnh mới, gây thiệt hại kinh tế rất lớn khiến nhiều nhà nghiên cứu, các cơ quan thú y, các ñơn vị chức năng phải ñầu tư nhân tài, vật lực ñể tìm ra giải pháp phòng chống và thanh toán dịch bệnh. Một trong số bệnh mà hiện nay chúng ta ñang rất quan tâm là bệnh Cúm gia cầm. Bệnh cúm gia cầm ñã ñược biết ñến từ lâu sau những vụ ñại dịch gây ra cho các ñàn gia cầm ở nhiều nước. Hiện nay, bệnh cúm gia cầm thể ñộc lực cao (HPAI) ñang là mối quan tâm hàng ñầu của tất cả các nước trên thế giới. Dịch bệnh xảy ra ñã giết chết hàng trăm triệu gia cầm, ñồng thời kéo theo ñó là hàng triệu gia cầm khác bị tiêu hủy bắt buộc ñể tránh lây lan, gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi và nền kinh tế của các nước có dịch Từ cuối năm 2003 ñến nay, bệnh cúm gia cầm H5N1 ñã xảy ra ở hầu khắp các tỉnh, thành trong cả nước, dẫn ñến hàng triệu gia cầm ñã bị tiêu hủy, gây thiệt hại lớn cho nền kinh tế (Cục Thú y, 2012). Bệnh ñặc biệt nghiêm trọng do bệnh ñã lây nhiễm và làm chết nhiều người. Nhà nước ñã và ñang áp dụng một cách ñồng bộ các biện pháp phòng bệnh và khống chế không cho dịch bệnh lây lan nhằm, làm giảm thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi. ðể tiêu diệt ñược bệnh thì chúng ta còn gặp nhiều khó khăn. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 2 ðể khống chế bệnh, một trong số các biện pháp ñó là tiêm phòng và tiêm phòng phải giám sát huyết thanh xem hiệu giá kháng thể sau tiêm, muốn giám sát ñược ta cần phải có nguyên liệu làm phản ứng và muốn có nguyên liệu thì phải mua hoặc tự chế. Ở các phòng thí nghiệm Việt Nam trong hệ thống chẩn ñoán vẫn dùng nguyên liệu kháng nguyên nhập của Weibridge – Anh. Tuy nhiên, kháng nguyên này rất ñắt hơn nữa chủng virút A/Chicken/Scotland/59/H5N1 là loại vi rút cúm ñược phân lập tại Scotland từ năm 1959, nên về mặt kháng nguyên và di truyền hẳn có những sai khác với các chủng vi rút ñang lưu hành tại việt Nam. Bên cạnh ñó, các chủng vi rút cúm H5N1 lưu hành tại Việt Nam thường xuyên biến ñổi, xuất hiện nhiều nhánh mới (Nguyễn Tùng và Ken Inui, 2011). Chủ ñộng ñược nguồn nguyên liệu kháng nguyên H5N1 cho xét nghiệm là ñiều hết sức có ý nghĩa ñối với các phòng thí nghiệm trong ñiều kiện kinh tế hiện nay, ñồng thời tăng cường ñược khả năng giám sát sau tiêm phòng ñối với bệnh cúm gia cầm khi có nhiều nhánh vi rút lưu hành. ðứng trước tình hình thiệt hại về mặt kinh tế hàng năm do dịch bệnh H5N1 gây ra, sự nguy hại ñối với sức khỏe con người, sự biến chủng của virus, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên chẩn ñoán bệnh Cúm A H5N1 bằng Virus A/Anhui/05-H5N1” 1.2 Mục tiêu của ñề tài Nghiên cứu, sản xuất kháng nguyên H5N1 vô hoạt sử dụng trong chẩn ñoán xét nghiệm kháng thể kháng kháng nguyên H5 của vi rút cúm gia cầm bằng phương pháp HI. 1.3 Ý nghĩa khoa học và thục tiễn của ñề tài. -Ứng dụng sản xuất kháng nguyên H5N1 phục vụ cho việc chản ñoán bệnh cúm A H5N1. - Chủ ñộng ñược nguồn nguyên liệu kháng nguyên H5N1 cho xét nghiệm tiết kiệm chi phí do giảm nhập nguyên liệu kháng nguyên chuẩn. [...]... a s n ph m kháng nguyên 3.1.5 Ki m tra tính sinh mi n d ch c a s n ph m kháng nguyên 3.1.6 Ki m tra ñ nh y và ñ ñ c hi u c a ch ph m kháng nguyên t ch b ng ph n ng HI 3.1.7 So sánh ñánh giá ñ nh y c a kháng nguyên t ch v i kháng nguyên c a Anh b ng m u giám sát sau tiêm phòng l y t Hà N i, Nam ð nh và Vĩnh Phúc 3.1.8 Xác ñ nh th i gian b o qu n kháng nguyên t ch 3.2 Nguyên li u - Kháng nguyên do Anh... năm 1918 - 1819 làm ch t 40 50 tri u ngư i mà tác nhân gây b nh là virus H1N1 t l n lây sang ngư i k t h p v i virus cúm ngư i t o ra ch ng virus m i có ñ c l c r t m nh Do h t virus cúm A có c u trúc là 8 ño n gen nên v lý thuy t t 2 virus có th xu t hi n 256 ki u t h p c a virus th h sau Khi nghiên c u v ñ c tính kháng nguyên c a virus cúm th y gi a các bi n th tái t h p và bi n ch ng subtyp v huy t... ñi m tr ng i l n cho vi c nghiên c u nh m t o ra vaccine cúm ñ phòng b nh cho ngư i và ñ ng v t Khi xâm nh p vào cơ th ñ ng v t, virus cúm A kích thích cơ th s n sinh ra kháng th ñ c hi u, trong ñó quan tr ng hơn c là kháng th kháng HA, ch có kháng th này m i có vai trò trung hòa virus cho b o h mi n d ch M t s kháng th khác có tác d ng kìm hãm s nhân lên c a virus, kháng th kháng M2 ngăn c n ch c năng... ñang phát tri n ñ c bi t là kháng nguyên H5N1 c a VLA (nư c Anh) s n xu t và ñư c s d ng ph bi n Vi t Nam Vì v y, vi c nghiên c u s n xu t ñ t ch lo i nguyên li u này là c n thi t ñ i v i nh ng nư c ñang phát tri n, do v y chúng tôi l a ch n gi ng vi rút A/Anhui0 5-H5N1 cho vi c nghiên c u s n xu t kháng nguyên cho ch n ñoán b nh cúm A/H5N1 2.6.9 Ngu n g c c a vi rút A/Anhui0 5-H5N1 Trong chương trình... t h ng c u (HI) ñư c s d ng trong ch n ñoán cúm gia c m Theo Ito và Kawaoka (1998), s ph c t p trong di n bi n kháng nguyên c a virus cúm là s bi n ñ i và trao ñ i trong n i b gen d n ñ n s bi n ñ i liên t c v tính kháng nguyên Có 2 cách bi n ñ i kháng nguyên c a virus cúm: + ð t bi n ñi m (ñ t bi n ng u nhiên hay hi n tư ng trôi trư t, l ch l c v kháng nguyên - antigenic drift) ðây là ki u ñ t bi... và M1 là protein thu c lo i hình kháng nguyên ñ c hi u gi ng (genusspecific antigen), kí hi u là gs kháng nguyên; HA và NA là protein thu c lo i hình kháng nguyên ñ c hi u typ và dư i typ (typ - specific antigen), ký hi u là ts kháng nguyên M t ñ c tính quan tr ng là virus cúm có kh năng gây ngưng k t h ng c u c a nhi u loài ñ ng v t ðó là s k t h p gi a m u l i kháng nguyên HA trên b Trư ng ð i h c... a virus cúm v i th th có trên b m t h ng c u, làm cho h ng c u ngưng k t v i nhau t o thành m ng ngưng k t thông qua c u n i virus, g i là ph n ng ngưng k t h ng c u HA (Hemagglutination test) Kháng th ñ c hi u c a kháng nguyên HA có kh năng trung hòa các lo i virus tương ng, chúng là kháng th trung hòa có kh năng tri t tiêu virus gây b nh Nó có th phong t a s ngưng k t b ng cách k t h p v i kháng nguyên. .. cho ch ng vi rút A/Anhui0 5-H5N1 Vi rút A/Anhui/ 05-H5N1 là ch ng vi rút cúm gia c m có ñ c l c cao ñư c phân l p năm 2005 Vi rút ñã ñư c xóa gen ñ c b ng công ngh gen và l p giáp nhân t o b ng k thu t di truy n Tuy vi rút ñã m t tính ñ c nhưng v n gi nguyên b n ch t ñ c tính kháng nguyên Vi rút có kh năng thích ng nhân lên khi nuôi c y trên phôi gà Gi ng vi rút cúm gia c m A/Anhui/ 05-H5N1 ñư c s d ng... ñư c s d ng làm gi ng g c trong nghiên c u ch kháng nguyên H5N1 s d ng trong ph n ng xét nghi m phát hi n kháng th kháng kháng nguyên H5 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p …………………… 24 PH N III N I DUNG, NGUYÊN LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 3.1 N i dung 3.1.1 Tiêm truy n xác ñ nh n ng ñ pha loãng t t nh t cho nhân gi ng vi rút cúm A/H5N1 3.1.2 ðánh giá ñ an toàn... nhi u amino acid cơ b n T i H i th o th gi i l n ñ u tiên v b nh cúm gà 1981, Bankowski và c ng s thông báo virus cúm gà có kháng nguyên b m t H7 thu c lo i có ñ c l c cao Nhưng Pensyvania (M ) ñã ch ng ki n tr n d ch cúm gà gây ch t 75% s gà, khi phân l p virus có kháng nguyên b m t H5 mà không ph i là H7 ð ñánh giá ñ c l c c a virus cúm m t cách khoa h c, các nhà khoa h c s d ng phương pháp gây b . của virus, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên chẩn ñoán bệnh Cúm A H5N1 bằng Virus A/Anhui /05-H5N1 1.2 Mục tiêu của ñề tài Nghiên cứu, sản xuất kháng nguyên. HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI *** NGUYỄN THỊ HÀ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG NGUYÊN CHẨN ðOÁN BỆNH CÚM A/H5N1 BẰNG VIRUS A/ANHUI 05-H5N1 LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành. ðến nay, tôi ñã hoàn thành Luận Văn Thạc sĩ với ñề tài Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên chẩn ñoán bệnh Cúm A H5N1 bằng Virus A/Anhui /05-H5N1 . Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn trường