Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên cúm a/h5n1 để chẩn đoán bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI *** NGUYỄN HOÀI NAM NGHI£N CøU S¶N XUÊT KH¸NG NGUY£N CóM A/H5N1 §Ó CHÈN §O¸N BÖNH LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : Thú y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. TÔ LONG THÀNH TS. TRẦN THỊ LAN HƯƠNG HÀ NỘI – 2012 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… i LỜI CAM ðOAN - Tôi xin cam ñoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược bảo vệ một học vị nào. - Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, viện Sau ñại học, khoa Thú y cùng các thầy cô giáo trong nhà trường ñã tạo ñiều kiện cho tôi ñược tiếp cận với những kiến thức khoa học về nông nghiệp trong hơn 2 năm học ở trường. ðể hoàn thành Luận văn này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi luôn nhận ñược sự giúp ñỡ tận tình của toàn thể cán bộ công nhân viên chức ở Trung tâm chẩn ñoán Thú y trung ương-Cục Thú y, trực tiếp là thầy giáo hướng dẫn khoa học PGS. TS. Tô Long Thành. Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc cô giáo hướng dẫn khoa học TS. Trần Thị Lan Hương hội Thú y Việt Nam và các thầy cô giáo trong bộ môn Vi sinh vật-Truyền nhiễm-khoa Thú y. Nhân dịp hoàn thành luận văn, một lần nữa tôi xin ñược bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới nhà trường, các thầy cô giáo, cơ quan, bạn bè ñồng nghiệp cùng người thân ñã ñộng viên, tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu thực hiện ñề tài. Hà Nội, ngày 15 tháng 9 năm 2012 Tác giả Nguyễn Hoài Nam Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iii MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH…………… …………… ……… ……….vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii PHẦN I: MỞ ðẦU 1 1.1. ðặt vấn ñề 1 1.2. Mục tiêu của ñề tài 2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Lịch sử bệnh cúm gia cầm 3 2.2. ðặc ñiểm sinh học của virus cúm type A 11 2.3. Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm 18 2.4. Triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm gia cầm 21 2.5. Bệnh tích 22 2.6. Chẩn ñoán bệnh cúm gia cầm 22 2.7. Khống chế bệnh cúm gia cầm 25 PHẦN 3. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1. Nội dung nghiên cứu 29 3.2. Nguyên liệu, dụng cụ, hoá chất 29 3.3. Phương pháp nghiên cứu 30 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 4.1. Kết quả xác ñịnh tính ổn ñịnh của giống vi rus cúm A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 39 4.2. Kiểm tra chỉ tiêu an toàn của giống virus trên gà 43 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iv 4.3. Kết quả vô hoạt virus bằng formaldehyde và ñánh giá hiệu giá kháng nguyên cúm 45 4.4. Kết quả kiểm tra ñộ vô trùng của sản phẩm kháng nguyên cúm 47 4.5. Kết quả ñánh giá ñộ nhạy chẩn ñoán và ñộ ñặc hiệu chẩn ñoán của sản phẩm kháng nguyên cúm 49 4.6. Kết quả so sánh sản phẩm kháng nguyên cúm với kháng nguyên của Anh 53 4.7. Kết quả xác ñịnh ñiều kiện bảo quản sản phẩm kháng nguyên cúm 62 PHẦN V: KẾT LUẬN-ðỀ NGHỊ 65 5.1. Kết luận 65 5.2. ðề nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 4.1. Kết quả xác ñịnh nồng ñộ pha loãng virus A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 40 Bảng 4.2. Kết quả kiểm tra tính ổn ñinh virus A/Vietnam/1203-H5N1clade 1 42 Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn virus A/Vietnam/1203-H5N1clade 1 44 Bảng 4.4. Kết quả vô hoạt formaldehyde và ñánh giá hiệu giá kháng nguyên cúm A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 46 Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra ñộ vô trùng của sản phẩm kháng nguyên cúm 48 Bảng 4.6. Kết quả kiểm tra ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu kháng nguyên cúm 50 Bảng 4.7. Kết quả ñánh giá ñộ ñặc hiệu của kháng nguyên cúm A/Vietnam/1203- H5N1 clade 1 với kháng thể thuộc một số subtype khác 52 Bảng 4.8. Kết quả xác ñịnh kháng thể cúm gia cầm một số tỉnh khi sử dụng kháng nguyên A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 và kháng nguyên của Anh 54 Bảng 4.9. Kết quả xác ñịnh kháng thể cúm gia cầm ở gà, vịt khi sử dụng kháng nguyên A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 và kháng nguyên của Anh 57 Bảng 4.10. Phân bố hiệu giá kháng thể khi sử dụng kháng nguyên A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 và kháng nguyên của Anh 60 Bảng 4.11. Kết quả xác ñịnh ñiều kiện bảo quản sản phẩm kháng nguyên cúm 63 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Cấu trúc virus cúm H5N1 12 Hình 3.1. Thao tác kiểm tra ñộ vô trùng của sản phẩm kháng nguyên 32 Hình 3.2. Thao tác làm phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu-HI 34 Hình 3.3. Thao tác làm phản ứng Real time RT-PCR………………………….37 Hình 4.1. Kết quả xác ñịnh kháng thể cúm gia cầm một số tỉnh khi sử dụng kháng nguyên A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 và kháng nguyên của Anh 55 Hình 4.2. Kết quả xác ñịnh kháng thể cúm gia cầm ở gà, vịt khi sử dụng kháng nguyên A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 và kháng nguyên của Anh 58 Hình 4.3 Phân bố hiệu giá kháng thể khi sử dụng kháng nguyên cúm A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 và kháng nguyên của Anh 61 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT A/Chicken/Scotland/59/H5N1: A/Ck/Scot/59 CPE: Cyto pathogen effect CDC: Center for Disease Control DNA: Deoxyribonucleic acid dATP: Deoxyadenosine triphosphate dGTP: Deoxyguanosine triphosphate dCTP: Deoxycytidine triphosphate dTTP : Deoxythymidine triphosphate ELISA: Emzyme Linked Immunosozbent Assay FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations HA: Haemagglutination test HI: Haemagglutination inhibitory test HPAI: Highly Pathogenic Avian Influenza LPAI: Low Pathogenic Avian Influenza MDCK: Madin – Darby – Canine - Kidney NP: Nucleoprotein-NP OIE: Office international des epizooties RNA : Ribonucleic acid RT-PCR: Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction WHO: World Health Organization Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 1 PHẦN I MỞ ðẦU 1.1. ðẶT VẤN ðỀ Chăn nuôi gia cầm là nghề truyền thống lâu ñời của người dân Việt Nam. Cùng với tiến bộ kỹ thuật về giống, quản lý, thú y và sự khuyến khích chăn nuôi của nhà nước ngày càng thúc ñẩy nghề chăn nuôi gia cầm phát triển, mang lại hiệu quả kinh tế cao. Tuy nhiên, song song với sự phát triển ñó kéo theo sự gia tăng và diễn biến ngày càng phức tạp của dịch bệnh, trong ñó phải kể ñến bệnh cúm gia cầm. Ở nước ta, dịch cúm gia cầm ñã gây ra những thiệt hại to lớn. Nhằm khống chế và tiến tới thanh toán bệnh cúm gia cầm, chúng ta ñã thực hiện các biện pháp phòng chống tổng hợp bao gồm: giám sát, chẩn ñoán bệnh, kiểm dịch vận chuyển, giết mổ gia cầm kết hợp với biện pháp an toàn sinh học, tiêu huỷ, tiêu ñộc, khử trùng các ổ dịch, tuyên truyền, giáo dục người dân về dịch bệnh và tiêm phòng bằng vắc xin. Trong ñó, sử dụng vắc xin ñược khuyến cáo là biện pháp triệt ñể làm giảm thiệt hại do bệnh gây ra ñối với ngành chăn nuôi gia cầm (Tô Long Thanh và Nguyễn Hoàng ðăng, 2008). Vì thế, từ năm 2005, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn ñã quy ñịnh tiêm phòng bắt buộc vắc xin cúm gia cầm ñối với tất cả các loại gia cầm (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2005). Việc ñánh giá hiệu quả của tiêm phòng và xây dựng lịch tiêm phù hợp ñã ñược tiến hành song song. Cho ñến nay giám sát sau tiêm phòng vẫn ñược thực hiện bằng biện pháp kiểm tra ñáp ứng kháng thể các ñàn gia cầm bằng phản ứng huyết thanh học-phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (HI). Hiện nay, tất cả các phòng thí nghiệm trong cả nước từ tuyến Trung ương, vùng và chi cục ñều sử dụng kháng nguyên H5N1 vô hoạt của Anh và vẫn phải phụ thuộc vào nguồn cung cấp từ nhập ngoại, ñiều này ñã làm cho chi phí xét nghiệm không ngừng tăng lên. Hơn nữa, loại kháng nguyên ñang sử dụng có tên Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 2 là A/Chicken/Scotland/59/H5N1 (A/Ck/Scot/59) là chủng virus cúm ñược phân lập ở Scotland về mặt kháng nguyên và di truyền không gần bằng chủng virus cúm lưu hành tại Việt Nam. Do vậy, chủ ñộng ñược nguồn nguyên liệu kháng nguyên H5N1 cho xét nghiệm là ñiều hết sức có ý nghĩa ñối với các phòng thí nghiệm trong ñiều kiện kinh tế hiện nay, ñồng thời tăng cường ñược khả năng giám sát sau tiêm phòng ñối với bệnh cúm gia cầm. Chính vì thế, chúng tôi thực hiện ñề tài: “Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên cúm A/H5N1 ñể chẩn ñoán bệnh”. 1.2. MỤC TIÊU CỦA ðỀ TÀI Sản xuất kháng nguyên cúm A/H5N1 vô hoạt sử dụng trong chẩn ñoán xét nghiệm kháng thể kháng kháng nguyên H5 của virus cúm gia cầm bằng phương pháp huyết thanh học. 1.3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ðỀ TÀI Hiện nay, hầu hết các nguyên liệu sử dụng cho chẩn ñoán xét nghiệm ở các phòng thí nghiệm thú y của Việt Nam ñều không có sẵn trong nước, ñiều này có thể do các doanh nghiệp sản xuất trong nước chưa nắm bắt ñược công nghệ, chi phí ñầu tư cho sản xuất tốn kém và thị trường ñầu ra rất hạn hẹp. Do vậy, ñề tài nghiên cứu sản xuất kháng nguyên H5N1 mang tính ứng dụng khoa học công nghệ ñể sản xuất nguyên liệu (kháng nguyên H5N1) trong ñiều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam mục ñích phục vụ cho công tác chẩn ñoán xét nghiệm, ñồng thời chứng minh khả năng tự chủ về nguyên liệu xét nghiệm trong một số trường hợp nhất ñịnh. [...]... 1992) 2.2.2 ð c tính kháng nguyên c a virus cúm type A Kháng nguyên c a virus cúm di n bi n h t s c ph c t p do hi n tư ng tái t h p các thành ph n c u trúc c a ch ng này v i ch ng khác ho c bi n ñ i t ch ng vô ñ c thành ch ng có ñ c l c cao hơn và gây b nh S ñ t bi n c a t ng thành ph n và lo i hình kháng nguyên trong t ng ch ng virus cúm cũng góp ph n t o nên c u trúc kháng nguyên m i, t o các lo... nông nghi p …………………… 13 Các lo i protein kháng nguyên: protein nhân (NP), protein ñ m (matrix protein-M1), protein HA, protein enzyme c t th th (NA) là nh ng protein kháng nguyên ñư c nghiên c u nhi u nh t M t trong ñ c tính kháng nguyên quan tr ng c a virus cúm là kh năng gây ngưng k t h ng c u c a nhi u loài ñ ng v t mà th c ch t là s k t h p gi a m u l i kháng nguyên HA trên b m t c a virus v i th... lý thuy t, khi xâm nh p vào cơ th ñ ng v t, virus cúm A s t o nên s hình thành c a các kháng th ñ c hi u, trong ñó quan tr ng hơn c là kháng th kháng HA, ch có lo i kháng th này m i có th trung hòa virus cho b o h mi n d ch M t s kháng th khác có tác d ng kìm hãm s nhân lên c a virus: kháng th kháng NA có tác d ng ngăn c n gi i phóng virus, kháng th kháng M2 có tác d ng ngăn c n ch c năng protein M2... phát hi n tr c ti p và ñ nh tính c a kháng nguyên virus cúm type A và B có trong d ch r a h u h ng Phương pháp này ch có th phân bi t ñư c kháng nguyên cúm type A và type trong xét nghi m 2.7 KH NG CH B NH CÚM GIA C M Do s phân b và lưu hành c a cúm gia c m r t r ng v ñ a dư và ña d ng loài ñ ng v t c m nhi m nên vi c xác ñ nh chính xác s lưu hành và phân b c a virus cúm là ñi u c c kỳ khó khăn ði u ñó... LI U 2.1 L CH S B NH CÚM GIA C M 2.1.1 L ch s b nh cúm gia c m trên th gi i B nh cúm gia c m cũng như b nh cúm ngư i ñã xu t hi n t cách ñây r t lâu Năm 412 trư c Công nguyên, Hippocrates ñã mô t v b nh cúm Trong hơn 100 năm qua, ñã có 4 v ñ i d ch ngư i x y ra vào các năm 1889, 1918, 1957 và 1968 (Tr n H u C n và Bùi Quang Anh, 2004) Năm 1918, ñ i d ch cúm x y ra châu Âu do virus cúm type A H1N1 gây... u làm cho h ng c u ngưng k t v i nhau t o m ng ngưng k t qua các c u n i virus T ñ c tính kháng nguyên này có th s d ng các ph n ng ngưng k t h ng c u HA và ngăn tr ngưng k t h ng c u HI trong ch n ñoán cúm gia c m S ph c t p trong di n bi n kháng nguyên mà virus cúm có ñư c là do s bi n ñ i và trao ñ i kháng nguyên trong n i b gene và gi a gene hemagglutinin (HA) và gene neutraminidase (NA) (Ito và... …………………… 14 th i nhi u lo i virus cúm v i s lư ng l n trong cùng m t không gian và th i gian kéo dài M t ñi u không th không nói ñ n trong nghiên c u v ñ c tính kháng nguyên c a virus cúm là gi a các bi n th tái t h p và bi n ch ng subtype v huy t thanh h c không ho c r t ít có ph n ng chéo Vì th ñ c ñi m này s gây m t tr ng i l n cho các nghiên c u nh m t o ra v c xin cúm cho ngư i và ñ ng v t (Ito và... c dùng ñ nh n bi t các kháng th có t 710 ngày sau khi nhi m virus Tính ña d ng c a kháng nguyên b m t c a virus cúm type A ñã nh hư ng r t l n ñ n vi c áp d ng các phương pháp huy t thanh h c truy n th ng ñ ch n ñoán b nh Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p …………………… 24 Trong th c t có th s d ng các ph n ng huy t thanh sau ñ tìm kháng th cúm: HI, ELISA, AGP * S... cúm gia c m t i Beltsville, M (1981) Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p …………………… 3 ñã thay th tên này b ng tên b nh cúm truy n nhi m cao gia c m hay b nh cúm gia c m th ñ c l c cao (Highly Pathogenic Avian Influenza-HPAI) (B Nông nghi p và Phát tri n nông thôn, 2005) T khi phát hi n ra virus cúm type A, các nhà khoa h c ñã tăng cư ng nghiên c u và th y virus cúm. .. bi t ñư c gia c m tiêm v c xin và gia c m nhi m cúm th c ñ a khi ki m tra kháng th - V c xin d ch ng Là nh ng v c xin ñư c s n xu t tương t như v c xin ñ ng ch ng, ñi m khác bi t là các ch ng virus v c xin có cùng kháng nguyên H v i ch ng virus Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p …………………… 27 th c ñ a nhưng có kháng nguyên N d ch ng, nh th có th phân bi t ñư c cá . ñịnh kháng thể cúm gia cầm ở gà, vịt khi sử dụng kháng nguyên A/ Vietnam/1203 -H5N1 clade 1 và kháng nguyên c a Anh 58 Hình 4.3 Phân bố hiệu giá kháng thể khi sử dụng kháng nguyên cúm A/ Vietnam/1203 -H5N1. sát sau tiêm phòng ñối với bệnh cúm gia cầm. Chính vì thế, chúng tôi thực hiện ñề tài: Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên cúm A/ H5N1 ñể chẩn ñoán bệnh . 1.2. MỤC TIÊU C A ðỀ TÀI Sản xuất kháng. Nations HA: Haemagglutination test HI: Haemagglutination inhibitory test HPAI: Highly Pathogenic Avian Influenza LPAI: Low Pathogenic Avian Influenza MDCK: Madin – Darby – Canine - Kidney NP: