3.1.1. Xác ựịnh tắnh ổn ựịnh giống virus cúm A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 3.1.2. Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên cúm A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1
- đánh giá ựộ an toàn của giống virus. - Vô hoạt virus bằng formaldehydẹ
- Kiểm tra hiệu lực của sản phẩm kháng nguyên cúm. - đánh giá ựộ vô trùng của sản phẩm kháng nguyên cúm.
- Kiểm tra ựộ ựặc hiệu và ựộ nhạy của sản phẩm kháng nguyên cúm.
3.1.3. Kiểm tra chất lượng kháng nguyên cúm A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1
- Xác ựịnh kháng thể cúm gia cầm khi sử dụng kháng nguyên cúm
A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 và kháng nguyên của Anh (A/Ck/Scot/59).
- đánh giá ựiều kiện bảo quản sản phẩm kháng nguyên cúm.
3.2. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT
- Virus: A/Vietnam /1203-H5N1 clade 1 cung cấp bởi Centre for Diseases Control (CDC) là giống virus ựược xóa ựộc bằng công nghệ gen, ựược lắp ráp nhân tạo và có khả năng thắch ứng nhân lên khi nuôi cấy trên phôi gà. để tạo ra chủng virus cúm nhân tạo nhược ựộc, người ta ựã tái tổ hợp hệ gen của giống virus A/Vietnam /1203-H5N1 clade 1 trên cơ sở sử dụng chủng gốc PR8/34 (A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)) cung cấp 6 gen khung là PA, PB1, PB2, NP, MA, NS làm nền, còn các gen kháng nguyên HA (H5) và NA (N1) ựược lấy từ chủng cúm cường ựộc gây bệnh phân lập năm 2004 tại Việt Nam (A/Vietnam/1194/2004(H5N1)). Bằng thao tác kỹ thuật gen, gen H5 ựã bị ựột biến làm mất hẳn 4 amino acid RRRL, cùng với một số ựột biến ựiểm ở các bộ mã ở hai ựầu của vùng ỘựộcỢ, làm thay ựổi 3 amino acid tại vùng gây ựộc. Như vậy về mặt miễn dịch học, mặc dù virus ựược xử lý làm mất ựộc tắnh gây bệnh nhưng vẫn giữ nguyên bản chất ựặc tắnh kháng nguyên bề mặt giống hệt như
virus cúm A/H5N1 ựã lấy mẫu ban ựầu, do vậy, có khả năng tạo kháng thể kháng lại kháng nguyên bề mặt loại virus H5N1 gây bệnh trong tự nhiên.
- Kháng nguyên H5N1 INACTIVATED ANTIGEN A/CK/SCOT/59 của Anh, sử dụng là kháng nguyên chuẩn ựể so sánh với sản phẩm kháng nguyên.
- Kháng huyết thanh chuẩn H5N1.
- Huyết thanh của gia cầm trong chương trình giám sát sau tiêm phòng lấy tại các tỉnh Hà Nội, Nam định và Vĩnh Phúc.
- động vật thắ nghiệm: gà khỏe mạnh không mắc bệnh cúm gia cầm, không có kháng thể cúm gia cầm H5.
- Trứng gà có phôi 9-10 ngày tuổị
- Kit Qiagen Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep chiết tách RNẠ - Kit Invitrogen Superscript One-step RT-PCR và primer/probe ựể kiểm tra sự bài thải virus bằng phương pháp Real time RT-PCR.
- Môi trường, hóa chất, dụng cụ cần thiết cho việc nuôi cấy virus, chế kháng nguyên.
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Phương pháp tiêm truyền virus trên trứng ựể nhân giống
Giống virus ựược pha thành nhiều nồng ựộ, tiêm trên trứng gà có phôi 9- 10 ngày tuổi, theo quy trình của OIẸ đặt trứng thẳng ựứng trên khay, buồng hơi hướng sát lên trên. Sát trùng vỏ trứng và ựục một lỗ trên buồng hơị Tiêm truyền giống virus qua lỗ ựục vào xoang niệm mô với lượng 0,1 ml/trứng. Mỗi nồng ựộ tiêm 5 trứng. Gắn lỗ ựục bằng keo gắn vỏ trứng hoặc parafin. Tiếp tục ấp trứng ở 370C từ 72-96 giờ. Cất trứng ở +40C trong 4 giờ hoặc -200C trong 30 phút. Mở nắp trứng ở phắa buồng hơi, thu dịch niệu mô từ trứng ựã nhiễm, chuẩn ựộ HA (phản ứng ngưng kết hồng cầu gà), lựa chọn nồng ựộ có hiệu giá HA cao nhất. Tiếp tục sử dụng nồng ựộ virus cho hiệu giá HA cao nhất tiêm tiếp trên trứng gà có phôị Thu hoạch dịch niệu mô và kiểm tra hiệu giá HẠ
3.3.2. Phương pháp ựánh giá chỉ tiêu an toàn của virus
Sau mỗi lần tiêm truyền phôi trứng gà, lấy dịch niệu mô tiêm cho gà khoẻ (0,5-1 ml), kiểm tra ựộ an toàn ựối với gà. Hàng ngày theo dõi tình hình sức khoẻ gà.
Lấy dịch ngoáy ổ nhớp vào thời ựiểm 3 ngày và 10 ngày sau khi tiêm ựể kiểm tra mức ựộ bài thải của virus.
3.3.3. Phương pháp vô hoạt virus bằng formaldehyde
Giống virus sau khi ựược nhân lên và ựảm bảo các ựiều kiện về tắnh an toàn, virus tiếp tục ựược vô hoạt bằng fomaldehyde ở các tỷ lệ 10/0, 10/00, và 10/000. Mục ựắch ựể chọn ra nồng ựộ vô hoạt thắch hợp.
Kiểm tra vô hoạt của virus bằng cách tiêm cho trứng gà có phôi 9-10 ngày tuổị Tiêu chuẩn phôi gà phát triển bình thường, dịch niệu mô sau khi tiêm truyền ựược kiểm tra và không có HẠ
3.3.4. Phương pháp kiểm tra ựộ vô trùng của sản phẩm kháng nguyên cúm
độ vô trùng của kháng nguyên ựược xác ựịnh bằng các kiểm tra tạp khuẩn. Kháng nguyên ựược kiểm tra trên các môi trường cơ bản theo ựúng quy trình kiểm tra ựộ vô trùng của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. Nuôi cấy trên các loại môi trường cơ bản: thạch nấm, thạch thường, thạch máu, nước thịt và nước thịt gan yếm khắ. Mỗi loại môi trường gồm 2 ống. Sau khi cấy, toàn bộ các ống môi trường kiểm tra ựược ủ ở nhiệt ựộ 370C và ựược theo dõi trong 7 ngày; riêng môi trường thạch nấm ựể ở nhiệt ựộ phòng. đến cuối quá trình theo dõi mà tất cả các ống thử không có vi sinh vật mọc, màu sắc môi trường không ựổi, kết quả là âm tắnh. Nếu một trong các ống môi trường có vi sinh vật mọc thì phải tiến hành kiểm tra lại lần 2 với số mẫu như trên. Nếu lần 2 âm tắnh thì mẫu ựược coi là âm tắnh. Nếu lần 2 cũng dương tắnh và cùng loại tạp khuẩn như lần 1 thì mẫu ựó ựược coi là dương tắnh. Loạt kháng nguyên kiểm tra phải loại bỏ. Nếu lần 2 dương tắnh nhưng với loại tạp khuẩn khác thì phải tiến hành thêm lần 3 với cách thức như trên.
Hình 3.1. Thao tác kiểm tra ựộ vô trùng của sản phẩm kháng nguyên
3.3.5. Phương pháp phát hiện kháng thể cúm gia cầm
Phát hiện kháng thể và xác ựịnh hiệu giá kháng thể cúm bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu-HỊ
Huyết thanh kiểm tra: huyết thanh gà không cần xử lý bằng RDE, huyết thanh vịt, ngan xử lý bằng RDE ựể chống hiện tượng ức chế ngưng kết không ựặc hiệu và xử lý hồng cầu ựể chống hiện tượng ngưng kết hồng cầu giả.
* Chuẩn bị kháng nguyên cho phản ứng HỊ
- Sau khi làm phản ứng HA, xác ựinh ựược ựơn vị HẠ Tiến hành pha kháng nguyên 4 HA/25ộl. Tắnh lượng kháng nguyên cần dùng cho số mẫu huyết thanh ựể ựảm bảo lượng kháng nguyên dùng cho phản ứng.
- Chuẩn ựộ kháng nguyên 4HA: sau khi pha, kháng nguyên 4HA phải ựược chuẩn ựộ lạị Tiến hành:
- Nhỏ 25ộl PBS 0,01M vào ựĩa 96 giếng chữ V từ giếng 1 ựến giếng 6 của mỗi hàng.
- Cho 25ộl kháng nguyên 4HA vào giếng thứ 1.
- Pha loãng kháng nguyên bằng cách chuyển 25ộl kháng nguyên 4HA từ giếng thứ 1 sang giếng thứ 2 và tuần tự ựến giếng 5 thì bỏ ựi 25ộl.
- Nhỏ 25ộl hồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng trên. - Lắc ựĩa bằng máỵ
- Ủ ựĩa phản ứng ở nhiệt ựộ phòng khoảng 40 phút.
Pha chuẩn: kết quả ngưng kết hồng cầu xảy ra ở giếng thứ 2. Pha không chuẩn:
- Kháng nguyên ựặc: nếu ngưng kết ựến giếng thứ 3 tức là thừa kháng nguyên. Như vậy, kháng nguyên phải ựược pha loãng ựể có ngưng kết ựến giếng thứ 2.
- Kháng nguyên loãng: nếu ngưng kết ựến giếng thứ 1 tức là thiếu kháng nguyên, có thể thêm một lượng kháng nguyên ựể có ngưng kết ựến giếng thứ 2.
* Tiến hành phản ứng HỊ
- Nhỏ 25ộl PBS vào các giếng của ựĩa 96 giếng. - Nhỏ tiếp 25ộl kháng huyết thanh vào giếng ựầu tiên.
- Pha loãng kháng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cách chuyển 25ộl kháng huyết thanh từ giếng 1 sang giếng 2 và tuần tự ựến giếng 11 và bỏ ựi 25ộl cuối cùng.
- Nhỏ 25ộl kháng nguyên 4HA ựã chuẩn bị vào các giếng từ giếng 1-11. Thêm 25ộl PBS vào hàng ựối chứng hồng cầu (giếng 12).
- Lắc ựĩa và ủ ở nhiệt ựộ phòng 30 phút.
- Nhỏ 25ộl dung dịch hồng cầu vào tất cả các giếng của ựĩa, lắc ựềụ đọc kết quả:
- Phản ứng dương tắnh: hồng cầu lắng xuống ựáy thành cục tròn ựỏ.
Hiệu giá HI ựược tắnh ở ựộ pha loãng huyết thanh cao nhất còn có hiện tượng ức chế ngưng kết hồng cầụ Huyết thanh có khả năng bảo hộ khi hiệu giá HI ≥ 1/16.
- Phản ứng âm tắnh: hồng cầu bị ngưng kết nằm rải ựều ở ựáy giếng. Khi kiểm tra huyết thanh các loài khác không phải là gà phải có 1 giếng chỉ có huyết thanh và hồng cầu ựể kiểm tra hiện tượng ngưng kết hồng cầu không ựặc hiệụ Nếu phát hiện thấy có ngưng kết hồng cầu không ựặc hiệu xảy
ra với mẫu huyết thanh nào cần xử lý lại mẫu huyết thanh ựó và kiểm tra lại bằng phản ứng HỊ
Hình 3.2. Thao tác làm phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu-HI
3.3.6. Phương pháp Real time RT-PCR:
Chiết tách RNA bằng kit Qiagen Rneasy Extraction
- Cho 600ộl dung môi RLT ựã bổ sung 1% β-ME vào ống 1,5ml. - Chuyển 200ộl mẫu sang ống 1,5ml.
- Lắc ựều (Votex) trong 15 giây và ly tâm nhanh (Spindown).
- Cho 400ộl cồn ETOH 100% (cồn tuyệt ựối), lắc mạnh bằng Votex trong 15 giâỵ
- đặt ống cột lọc (spin column) và hệ thống hút chân không. - Chuyển tất cả dung dịch mẫu sang cột lọc.
- Rửa lần 1: cho 700ộl dung môi RW1 vào cột lọc.
- Rửa lần 2: Cho 500ộl dung môi RPE vào cột lọc và bật máy hút, cho tiếp 500 ộl dung môi RPE vào cột lọc và bật máy hút.
- đặt cột lọc vào ống thu mới (collection tube).
- Ly tâm cột lọc trong 2 phút ở tốc ựộ 14.000 vòng/phút. - Thu RNA: chuyển cột lọc sang ống 1,5ml mớị
- Ly tâm trong 1 phút ở tốc ựộ 10.000 vòng/phút. - Chuyển mẫu RNA ựã thu sang ống 1,5ml mớị
- Cất giữ RNA ở 40C trong vài giờ nếu sử dụng ngaỵ Cất giữ ở -200C nếu chưa dùng ngay trong ngàỵ
Tiến hành phản ứng Real time RT-PCR
* Khái quát Real time PCR
Real time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA ựắch trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch ựại trong ống phản ứng ựược hiển thị cùng lúc với phản ứng khuyếch ựại xảy ra ựể có thể ựọc ựược sau mỗi chu kỳ nhiệt.
Sự phát hiện sản phẩm PCR sẽ dựa vào cường ựộ huỳnh quang của bình phản ứng. Hàm lượng chất phát huỳnh quang sẽ tăng dần theo chu kỳ nhiệt và tỷ lệ thuận với sản phẩm ựược nhân bản. Cường ựộ phát huỳnh phụ thuộc vào hàm lượng chất phát huỳnh quang (Phạm Hùng Vân, 2008).
Phương pháp Real time RT-PCR là kỹ thuật ựể phát hiện với virus có nhân là RNA, như virus cúm H5N1. Phản ứng cần qua bước phiên mã ngược (Reverse transcription) ựể chuyển RNA của virus thành DNA, làm khuôn mẫu cho quá trình PCR.
* Nguyên liệu phương pháp Real time RT-PCR dùng cho xác ựịnh lượng virus cúm H5N1.
- Khuôn RNA là ựoạn cần nhân bản. - Nước cất vô trùng (Rnase-free).
- RNA ựối chứng dương tắnh M, H5, H7 của virus cúm H5N1. - Hai ựoạn mồi oligonucleotit (primer), và probe (mẫu dò). - Enzym DNA polymerase chịu nhiệt.
- Các nucleotit tự do: dATP, dGTP, dCTP, dTTP. - Dung dịch ựệm, Mg2+...
* Thực hiện kỹ thuật Real time RT-PCR:
- Công thức pha hỗn hợp nhân gen cho Real time RT-PCR (Invitrogen Superscript One-step RT-PCR) : H2O 5.5ộl 2X Reaction mix 12.5ộl Primer forward 0.5ộl Primer reverse 0.5ộl Probe 1.5ộl
Enzym Taq Polymerase 0.5ộl
- Chuyển Master mix sang buồng cho mẫu RNA và cho hỗn dịch phản ứng (20ộl) vào ống Smart Cycler.
- Cho 5ộl mẫu RNA vào ống Smart Cycler. đóng nắp ống, số ống phản ứng tương ứng với với mẫu xét nghiệm.
- Cho 5ộl RNA ựối chứng dương vào ống ựối chứng dương tắnh và 5ộl nước sạch RNase vào ống ựối chứng âm tắnh.
- đặt ống phản ứng vào máy chu kỳ nhiệt và chọn chương trình chạy PCR, bắt ựầu chạy, nhập ký hiệu mẫu kiểm tra cùng với mẫu ựối chứng dương tắnh, âm tắnh và phần ký hiệu mẫu trong bảng kết quả. Lưu chương trình chạy máỵ
- Cài ựặt chương trình phân tắch dữ liệu cho máy chu kỳ nhiệt Smart Cycler và chạy chương trình.
Phân tắch kết quả xét nghiệm: phân tắch kết quả dựa vào chu kỳ ngưỡng Ct (threshold cycle). Chu kỳ ngưỡng hay Ct là chu kỳ nhiệt mà ở tại thời ựiểm này thiết bị real-time ghi nhận ựược tắn hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt ựầu vượt qua cường ựộ huỳnh quang nền. để có thể xác ựịnh ựược cường ựộ huỳnh quang nền, thiết bị real-time thường ghi nhận cường ựộ tắn hiệu huỳnh quang xuất hiện trong ống phản ứng trong một số chu kỳ ựầu, chúng ta
gọi là các chu kỳ nền, và lấy trung bình cộng của các cường ựộ huỳnh quang này làm cường ựộ huỳnh quang nền. đường cắt ngang ựi qua cường ựộ huỳnh quang nền này ựược gọi là ựường nền. Chu kỳ ngưỡng là trị số ựược xác ựịnh bằng số chu kỳ mà ở ựó ựường nền cắt ựường biểu diễn khuếch ựạị
Hình 3.3. Thao tác làm phản ứng Real time RT-PCR
3.3.7. Phương pháp kiểm tra ựộ nhạy chẩn ựoán và ựộ ựặc hiệu chẩn ựoán của sản phẩm kháng nguyên:
Phương pháp ựánh giá ựộ nhạy chẩn ựoán
độ nhạy của phương pháp miễn dịch học nói lên khả năng phát hiện một số lượng nhỏ kháng nguyên hoặc kháng thể. Về mặt dịch tễ học, ựiều ựó có liên quan ựến khả năng của phản ứng tạo nên một kết quả xét nghiệm dương tắnh khi mẫu ựược xét nghiệm có nguồn gốc từ con vật bị bệnh hoặc bị nhiễm trùng, nghĩa là có khả năng phát hiện các trường hợp dương tắnh thực. Một xét nghiệm ựược coi là có ựộ nhạy cao khi nó không có khuynh hướng cho các kết quả âm tắnh giả, nghĩa là xét nghiệm có thể phát hiện ựược tất cả các mẫu dương tắnh.
Công thức tắnh ựộ nhạy chẩn ựoán của một xét nghiệm:
Số dương tắnh (trong số các kết quả dương tắnh thực)
độ nhạy (%) = --- x 100 Số dương tắnh thực
Phương pháp ựánh giá ựộ ựặc hiệu chẩn ựoán
độ ựặc hiệu của một phương pháp miễn dịch nói lên khả năng của phương pháp phát hiện kháng thể ựã phản ứng với kháng nguyên. độ ựặc hiệu mô tả khả năng của phương pháp xác ựịnh ựược các giá trị âm tắnh khi mẫu bệnh phẩm dùng trong xét nghiệm là âm tắnh thực. Một phương pháp ựược coi là ựặc hiệu nếu nó không tạo nên các kết quả dương tắnh giả, nghĩa là mẫu bệnh phẩm âm tắnh thực không ựược phát hiện một cách sai lệch là dương tắnh.
Công thức tắnh ựộ ựặc hiệu của một xét nghiệm:
Số âm tắnh (trong số các kết quả âm tắnh thực)
độ ựặc hiệu (%) = --- x 100 Số kết quả âm tắnh thực
3.3.8. Phương pháp xử lý số liệu:
Các số liệu thắ nghiệm ựược xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học sử