Thời kỳ ủ bệnh thường ngắn, từ vài giờ tới 3 ngày, tùy theo số lượng, ựộc lực của virus, ựường nhiễm bệnh, loài cảm nhiễm virus gây bệnh. Một số nghiên cứu cho thấy thời gian ủ bệnh trong nhiều trường hợp có thể dài hơn ựến 7 ngày và lâu nhất có thể ựến 14 ngày (Lê Văn Năm, 2004).
Biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố: chủng virus, số lượng virus, loài cảm nhiễm, tuổi, giới tắnh, ựiều kiện môi trường (nhiệt ựộ, ánh sáng, thành phần không khắẦ), chế ựộ dinh dưỡng, tình trạng miễn dịch của vật chủ trước khi nhiễm bệnh, sự bội nhiễm của một số vi sinh vật khác.
Nhìn chung, triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm gia cầm vô cùng phức tạp, ựa dạng trong các thể bệnh kể cả ngay trong cùng một loài gia cầm. Biểu hiện bệnh có thể từ không hoặc có rất ắt dấu hiệu lâm sàng nhưng chết ựột ngột ựến biểu hiện lâm sàng ựiển hình và các thể bệnh nhẹ hoặc ẩn tắnh.
2.4.1. Triệu chứng lâm sàng ựiển hình của bệnh cúm gia cầm chủng ựộc lực cao
Khi nhiễm các chủng virus ựộc lực cao (HPAI) gia cầm thường chết ựột ngột, tỷ lệ tử vong khá cao có khi lên ựến 100% trong vài ngàỵ Các triệu chứng về hô hấp thường xuất hiện ựầu tiên và khá ựiển hình như ho khẹc, hắt hơi, thở khò khè, vảy mỏ, chảy nhiều nước mắt, nước mũị Tiếp theo là mi mắt bị viêm, mặt phù nề, sưng mọng. Mào tắch dày lên do thủy thũng, tắm tái, có nhiều ựiểm xuất huyết. Thịt gà bị bệnh thường thâm xám, dưới da vùng chân có xuất huyết.
Bên cạnh các triệu chứng về hô hấp, gia cầm bị bệnh cúm còn có biểu hiện thần kinh: ựi lại không bình thường, run rẩy, mệt mỏi, nằm li bì tụ ựống với nhaụ Ngoài ra khi gia cầm mắc cúm thường tiêu chảy mạnh, phân loãng trắng hoặc xanh, năng suất trứng giảm mạnh.
Gia cầm bị nhiễm các chủng virus có ựộc lực yếu hơn cũng có những triệu chứng tương tự như ở bệnh do những chủng có ựộc lực cao gây ra, nhưng mức ựộ biểu hiện nhẹ hơn và tỷ lệ chết thấp hơn.
Tuy nhiên khi có sự cộng thêm với vi khuẩn hoặc virus khác có khả năng gây bệnh hoặc ựiều kiện môi trường bất lợi thì tỷ lệ tử vong có thể ựạt 60-70% và các triệu chứng lâm sàng cũng dần nặng hơn.
2.5. BỆNH TÍCH
Cũng như triệu chứng lâm sàng, mức ựộ tổn thương ựại thể của bệnh cúm gia cầm cũng rất ựa dạng, phụ thuộc rất nhiều vào ựộc lực của virus và quá trình diễn biến của bệnh.
Các biến ựổi ựặc trưng về tổ chức học bao gồm: phù nề, sung huyết, xuất huyết và thâm nhập lympho ựơn nhân ở cơ vân, cơ tim, lách, phổi, mào tắch, gan, thận, tổ chức thần kinh. Ngoài sự thâm nhiễm tế bào lympho ựơn nhân còn có các tế bào ựặc trưng cho phản ứng viêm.
đi sâu nghiên cứu, nhiều tác giả ựã nêu lên một số khác biệt về ựặc ựiểm tổn thương do từng chủng virus cúm gây rạ Khi bị nhiễm H9N5, có hoại tử nặng ở hệ lâm ba và xuất hiện ựốm hoại tử ở lách nhưng khi nhiễm H5N2, H5N1 lại không có hoại tử ở hệ lâm bạ Hay hoại tử ở cơ tim, viêm cơ tim thường thấy ở các gia cầm mắc chủng H5N3. Những chủng virus gây ra các triệu chứng thần kinh thì tổn thương thấy mạch vành xưng, hoại tử các tế bào thần kinh mà ắt thấy tụ huyết, xuất huyết ở các mô thần kinh.
2.6. CHẨN đOÁN BỆNH CÚM GIA CẦM
Việc chẩn ựoán cúm gia cầm do nhiễm virus type A chủ yếu là phải phân lập và ựịnh danh virus kết hợp với chẩn ựoán dựa trên triệu chứng lâm sàng, xác ựịnh tổn thương ựại thể, vi thể, dịch tễ học và một số phản ứng huyết thanh học. Theo chẩn ựoán thường quy của Trung tâm chẩn ựoán thú y Trung ương-Cục thú y, sơ ựồ chẩn ựoán phòng thắ nghiệm của bệnh cúm hiện nay như sau:
* Phân lập virus
Là một chẩn ựoán cơ bản, có ý nghĩa quyết ựịnh. để phân lập virus, thường sử dụng mẫu bệnh phẩm là phổi, khắ quản, não, lách. Việc phân lập ựược thực hiện trên môi trường tế bào dòng thận chó MDCK hoặc trên phôi trứng gà.
-Subtype H -Subtype H -ELISA
-Subtype N -Subtype N -AGP
-HI Giám ựịnh Phân lập virus: trên trứng hoặc tế bào HI test Bệnh phẩm Tìm kháng thể cúm Phủ tạng: Phổi, khắ quản, ganẦ Huyết thanh RT-PCR Dịch họng, ổ nhớp Xét nghiệm nhanh: BD Dir hoặc Quickvue NI test
* Phân lập virus trên môi trường tế bào
để có thể lây nhiễm bệnh phẩm trên môi trường tế bào, trước hết phải thực hiện nuôi cấy tế bào trên chai T-25 trong môi trường phát triển tế bào với các hóa chất, nguyên vật liệu cần thiết. Sau khi thảm tế bào mọc từ trên 90% sau 24-72h có thể sử dụng phân lập virus bằng việc tiêm truyền huyễn dịch bệnh phẩm ựã xử lý kháng sinh hoặc qua lọc trên bề mặt tế bàọ Quá trình lây nhiễm bệnh phẩm ựược bổ sung môi trường nuôi cấy virus (D-MEM với TCPK treaed trypsine) trong tủ ấm CO2. Tiến hành quan sát bệnh tắch tế bào CPE hàng ngàỵ
Có thể thu hoạch dịch nổi trong chai tế bào ựã cấy virus sau 1-7 ngày ựể kiểm tra bằng phản ứng HẠ Nếu âm tắnh có thể cấy chuyển trên tế bào thêm 2-3 lần. Mẫu phân lập trên tế bào ựược bảo quản trong tủ -700C.
* Phân lập virus trên phôi trứng
Sử dụng trứng gà 9-11 ngày tuổi ựể phân lập virus. Mỗi mẫu bệnh phẩm tiêm cho 3 trứngvà ựược ấp ở 37oC trong 7 ngàỵ
Trước khi thu hoạch nước trứng phải cất trứng vào tủ lạnh 40C trong 4giờ hoặc ựể ở tủ âm trong 20 phút ở nhiệt ựộ -200C. Nước trứng (nước niệu mô phôi trứng) ựược cho vào ống nghiệm 10ml và bảo quản ở tủ -70oC.
Mẫu phân lập ựược kiểm tra bằng phản ứng HA, nếu âm tắnh có thể cấy chuyển trên phôi trứng gà thêm 2-3 ựợt.
* định danh virus
Sau khi phân lập ựược virus từ môi trường tế bào hoặc trên phôi trứng gà, có thể giám ựịnh virus bằng các HI test ựể giám ựịnh subtype H; NI test ựể xác ựịnh subtype N hoặc bằng phương pháp RT-PCR ựể xác ựịnh subtype H, N.
Phản ứng huyết thanh học ựược dùng ựể nhận biết các kháng thể có từ 7- 10 ngày sau khi nhiễm virus. Tắnh ựa dạng của kháng nguyên bề mặt của virus cúm type A ựã ảnh hưởng rất lớn ựến việc áp dụng các phương pháp huyết thanh học truyền thống ựể chẩn ựoán bệnh.
Trong thực tế có thể sử dụng các phản ứng huyết thanh sau ựể tìm kháng thể cúm: HI, ELISA, AGP.
* Sử dụng xét nghiệm nhanh BD Dir hoặc Quickvue
Phương pháp BD Direc-antigene TM Flu A+B là phương pháp xét nghiệm màng miễn dịch nhanh ựể phát hiện trực tiếp và ựịnh tắnh của kháng nguyên virus cúm type A và B có trong dịch rửa hầu họng. Phương pháp này chỉ có thể phân biệt ựược kháng nguyên cúm type A và type trong xét nghiệm.
2.7. KHỐNG CHẾ BỆNH CÚM GIA CẦM
Do sự phân bố và lưu hành của cúm gia cầm rất rộng về ựịa dư và ựa dạng loài ựộng vật cảm nhiễm nên việc xác ựịnh chắnh xác sự lưu hành và phân bố của virus cúm là ựiều cực kỳ khó khăn. điều ựó cũng có nghĩa là ựể kiểm soát ựược dịch cúm gia cầm ựòi hỏi phải xây dựng ựồng bộ hệ thống chắnh sách quản lý của nhà nước và hệ thống biện pháp kỹ thuật. Tuy nhiên vì ựiều kiện kinh tế xã hội của mỗi nước có ựặc thù riêng nên khó có thể hoạch ựịnh ựược một chắnh sách chung về khống chế cúm gia cầm cho tất cả các quốc giạ
Bên cạnh ựó, mặc dù có những ựặc ựiểm riêng về dịch tễ học so với các bệnh truyền nhiễm, nhưng nhìn chung sự bùng phát cúm gia cầm vẫn tuân theo những quy luật chung của quá trình sinh dịch, thực chất là sự tác ựộng qua lại giữa 3 khâu: nguồn bệnh, ựộng vật cảm thụ, yếu tố truyền lây của bệnh truyền nhiễm nói chung. Vì thế, nguyên tắc của khống chế bệnh cúm gia cầm chắnh là sự tác ựộng vào các khâu trên của quá trình sinh dịch. điều ựó chắnh là việc phá vỡ vòng truyền lây của tác nhân gây bệnh và hiệu quả nhất là sự tác ựộng vào ựiểm yếu nhất của quá trình truyền lâỵ
Theo khuyến cáo của OIE thì ựó là các hoạt ựộng:
- Loại trừ tác nhân gây bệnh: tiêu hủy gia cầm nhiễm bệnh, sát trùng tiêu ựộc.
- Giảm tiếp xúc giữa tác nhân và vật chủ: sử dụng vắc xin phòng bệnh, tăng cường chăm sóc nuôi dưỡng.
- Thay ựổi môi trường sống: thực hiện an toàn sinh học, ngăn chặn tác nhân gây bệnh xâm nhập môi trường.
Cụ thể hoạt ựộng kiểm soát cúm gia cầm bao gồm một số ựiểm cơ bản: - Xây dựng chắnh sách về kiểm soát bệnh mà thực chất là ban hành khung pháp lý ựể ựảm bảo hoạt ựộng phòng chống dịch có hiệu quả. đó là việc áp dụng các biện pháp ngăn chặn sự xâm nhập của virus cúm thông qua ựường thương mại với các nước khác và thực hiện việc giết hủy hàng loạt gia cầm nhiễm bệnh.
- Áp dụng các biện pháp an toàn sinh học nghiêm ngặt nhằm khống chế sự lây nhiễm virus cúm gia cầm xâm nhập ban ựầụ
- Thực hiện chiến lược tiêm phòng vắc xin hợp lý cho ựàn gia cầm.
* Phòng bệnh
Hiện nay chưa có thuốc ựặc hiệu ựể trị bệnh cúm gia cầm. Việc sử dụng Amantadin hydrochorid và Rimantadine hydrochorid tuy có làm giảm tỷ lệ chết nhưng không thay ựổi tỷ lệ nhiễm và gia cầm vẫn tiếp tục bài thải virus. Ngoài các thuốc ựiều trị cơ bản trên, người ta còn sử dụng các biện pháp ựiều trị hỗ trợ khác như chống suy hô hấp, dùng kháng sinh ựể giảm tác ựộng của vi khuẩn cộng nhiễm. Tuy nhiên, trong thực tế những thuốc chống virus trên ựều bị kháng tương ựối nhiều và còn có nhiều tác dụng phụ kể cả những thuốc chống cúm mới nhất là những loại có tác dụng ức chế neuraminadase như Tamiflu hay Zanamivir.
Chắnh vì thế, một trong những chắnh sách phòng bệnh có tắnh chủ ựộng hiện nay là việc sử dụng vắc xin tiêm phòng cho gia cầm ựã ựem lại những kết quả khả quan trong phòng bệnh:
- Tạo ựược kháng thể cho gia cầm, có tác dụng làm giảm số nhiễm và số chết nhờ việc làm giảm tình trạng mẫn cảm của gia cầm với chủng virus gây bệnh.
- Giảm bài thải virus 1000 lần so với gia cầm không tiêm và ngừng hẳn sự bài thải virus sau 13-18 ngày tiêm phòng, nhờ vậy làm giảm khả năng lây truyền bệnh.
- Giảm thiểu việc loại thải những ựàn gia cầm khỏe mạnh, giảm thiệt hại về kinh tế cho chăn nuôi gia cầm công nghiệp.
Tuy nhiên việc sử dụng vắc xin phòng cúm cho gia cầm hiện nay vẫn còn một số hạn chế:
- Hiệu lực và ựộ dài miễn dịch chưa ựược nghiên cứu ựầy ựủ. - Có thể gây trở ngại cho chẩn ựoán huyết thanh học.
- Do thời gian nung bệnh của cúm gia cầm ngắn (1-3 ngày) nên việc sử dụng vắc xin khó ựạt ựược hiệu quả khi dùng trong các ổ dịch.
Các hạn chế khi tiêm phòng vắc xin ựang dần ựược tháo gỡ bằng việc hiện nay ựã sản xuất ựược một số loại vắc xin cho phép phân biệt ựược kháng thể do mắc virus cúm thực ựịa hay kháng thể do vắc xin do vắc xin sản sinh ra hoặc sử dụng việc nuôi chung gia cầm không tiêm phòng (gia cầm chỉ báo) vào ựàn ựược tiêm phòng ựể theo dõi giám sát.
Một số vắc xin cúm gia cầm ựược ghi nhận hiện nay (Ilaria capua và stefano Maragon, 2004):
- Vắc xin vô hoạt ựồng chủng:
Là vắc xin ựược sản xuất chứa chủng virus gây bệnh cúm thực ựịa (auto genous) hay còn gọi là vắc xin tự phát sinh, vắc xin này ựược sử dụng tại Mexico, Pakistan và gần ựây là ở Trung Quốc. Một trong những vắc xin thuộc loại này ựang ựược sử dụng hiện nay là vắc xin của Aventis Pasteur, Nobilis, và Weike Harbin. Nhược ựiểm cơ bản của vắc xin này là không thể phân biệt ựược gia cầm tiêm vắc xin và gia cầm nhiễm cúm thực ựịa khi kiểm tra kháng thể.
- Vắc xin dị chủng
Là những vắc xin ựược sản xuất tương tự như vắc xin ựồng chủng, ựiểm khác biệt là các chủng virus vắc xin có cùng kháng nguyên H với chủng virus
thực ựịa nhưng có kháng nguyên N dị chủng, nhờ thế có thể phân biệt ựược cá thể tiêm phòng với cá thể nhiễm virus khi thực hiện giám sát huyết thanh học. Vắc xin loại này ựang ựược sử dụng tại Trung Quốc, một số nước Châu Âu và Châu Mỹ.
- Vắc xin tái tổ hợp
Một vài loại vắc xin tái tổ hợp virus cúm với virus ựậu gà ựã ựược sử dụng. Với vắc xin này, virus gây bệnh ựậu ựược sử dụng như một vector ựể ghép gene mã hóa cho kháng nguyên H và N của virus cúm vì vậy sử dụng vắc xin này cho phép phân biệt ựược gia cầm tiêm vắc xin và gia cầm nhiễm cúm.
Vắc xin này chủ yếu ựược sử dụng rộng rãi ở Mexico và bắt ựầu ựược sử dụng ở Trung Quốc từ tháng 1 năm 2005 (Tô Long Thành, 2005).
Mặc dù biện pháp sử dụng vắc xin tiêm phòng ựã bước ựầu ựược ghi nhận như một công cụ khống chế bệnh cúm. Tuy nhiên chương trình tiêm phòng vắc xin chỉ thực sự hiệu quả khi ựược ựồng thời thực hiện cùng hàng loạt các biện pháp khác: thực hiện an toàn sinh học triệt ựể, chương trình kiểm tra huyết thanh học ựịnh kỳ (Trần Xuân Hạnh, 2004).
PHẦN 3. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.1.1. Xác ựịnh tắnh ổn ựịnh giống virus cúm A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 3.1.2. Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên cúm A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1
- đánh giá ựộ an toàn của giống virus. - Vô hoạt virus bằng formaldehydẹ
- Kiểm tra hiệu lực của sản phẩm kháng nguyên cúm. - đánh giá ựộ vô trùng của sản phẩm kháng nguyên cúm.
- Kiểm tra ựộ ựặc hiệu và ựộ nhạy của sản phẩm kháng nguyên cúm.
3.1.3. Kiểm tra chất lượng kháng nguyên cúm A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1
- Xác ựịnh kháng thể cúm gia cầm khi sử dụng kháng nguyên cúm
A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 và kháng nguyên của Anh (A/Ck/Scot/59).
- đánh giá ựiều kiện bảo quản sản phẩm kháng nguyên cúm.
3.2. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT
- Virus: A/Vietnam /1203-H5N1 clade 1 cung cấp bởi Centre for Diseases Control (CDC) là giống virus ựược xóa ựộc bằng công nghệ gen, ựược lắp ráp nhân tạo và có khả năng thắch ứng nhân lên khi nuôi cấy trên phôi gà. để tạo ra chủng virus cúm nhân tạo nhược ựộc, người ta ựã tái tổ hợp hệ gen của giống virus A/Vietnam /1203-H5N1 clade 1 trên cơ sở sử dụng chủng gốc PR8/34 (A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)) cung cấp 6 gen khung là PA, PB1, PB2, NP, MA, NS làm nền, còn các gen kháng nguyên HA (H5) và NA (N1) ựược lấy từ chủng cúm cường ựộc gây bệnh phân lập năm 2004 tại Việt Nam (A/Vietnam/1194/2004(H5N1)). Bằng thao tác kỹ thuật gen, gen H5 ựã bị ựột biến làm mất hẳn 4 amino acid RRRL, cùng với một số ựột biến ựiểm ở các bộ mã ở hai ựầu của vùng ỘựộcỢ, làm thay ựổi 3 amino acid tại vùng gây ựộc. Như vậy về mặt miễn dịch học, mặc dù virus ựược xử lý làm mất ựộc tắnh gây bệnh nhưng vẫn giữ nguyên bản chất ựặc tắnh kháng nguyên bề mặt giống hệt như
virus cúm A/H5N1 ựã lấy mẫu ban ựầu, do vậy, có khả năng tạo kháng thể kháng lại kháng nguyên bề mặt loại virus H5N1 gây bệnh trong tự nhiên.
- Kháng nguyên H5N1 INACTIVATED ANTIGEN A/CK/SCOT/59 của Anh, sử dụng là kháng nguyên chuẩn ựể so sánh với sản phẩm kháng nguyên.