Giống virus A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 ựã ựược cắt bỏ ựoạn gen có ựộc lực cao do vậy ựánh giá chỉ tiêu an toàn của giống virus trên gà là chỉ tiêu rất quan trọng.
Kiểm tra chỉ tiêu an toàn của giống virus A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1
ựược ựánh giá trên gà 4 tuần tuổị Sau mỗi lần tiêm truyền trên trứng gà có phôi, dịch niệu mô ựược thu hoạch và tiếp tục tiêm lên gà khỏe mạnh ựể kiểm tra chỉ tiêu an toàn ựối với gà.
Sử dụng 30 gà khỏe cho mỗi lần thử nghiệm, giống Lương Phượng. Trong ựó 10 gà ựược tiêm virus (tiêm vào cơ lườn) với liều tiêm 1 ml/gà, và 10 gà ựối chứng tiêm nước sinh lý.
Toàn bộ số gà thắ nghiệm, gồm gà ựược tiêm virus cũng như gà ựối chứng ựược theo dõi trong vòng 10 ngàỵ
Tiến hành lấy dịch ngoáy ổ nhớp vào thời ựiểm 3 và 10 ngày sau khi tiêm ựể kiểm tra sự bài thải của virus bằng phương pháp Real time RT-PCR.
Giống virus chế kháng nguyên cúm ựược coi là an toàn khi toàn bộ số gà ựược tiêm virus ựều phải sống khỏe mạnh, không có các phản ứng không mong muốn và không có sự bài thải virus.
Quy trình tiêm truyền kiểm tra chỉ tiêu an toàn ựược lặp lại 2 lần. Kết quả ựược trình bày bảng 4.3.
Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn virus
A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 Gà thắ nghiệm Chỉ tiêu Lần TN 1 Lần TN 2 Gà ựối chứng (2 lần TN) Số lượng gà thắ nghiệm 10 10 20
đường tiêm Tiêm bắp Tiêm bắp Tiêm bắp
Thời gian theo dõi 10 ngày 10 ngày 10 ngày
Biểu hiện lâm sàng Khỏe Khỏe Khỏe
Số gà chết (con) 0 0 0
Tỷ lệ chết (%) 0 0 0
3 ngày Âm tắnh Âm tắnh Âm tắnh
Kiểm tra bài thải virus
10 ngày Âm tắnh Âm tắnh Âm tắnh
Từ số liệu tổng hợp trong bảng 4.3 có thể nhận thấy:
Sau 10 ngày theo dõi, tất cả gà tiêm virus và gà ựối chứng ựều hoàn toàn khỏe mạnh, không có biểu hiện bệnh lý lâm sàng, ựạt tỷ lệ 100%.
đồng thời, kiểm tra sự bài thải virus H5N1 bằng phương pháp Real time RT-PCR cho kết quả âm tắnh, chứng tỏ virus không nhân lên trên cơ thể gà và không bài thải ra môi trường.
Như vậy, giống virus A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 ựạt yêu cầu về chỉ tiêu an toàn, không gây bệnh cho gà và không có sự bài thải virus ra môi trường.
4.3. KẾT QUẢ VÔ HOẠT VIRUS BẰNG FORMALDEHYDE VÀ đÁNH GIÁ HIỆU GIÁ KHÁNG NGUYÊN CÚM
để phục vụ cho mục ựắch làm kháng nguyên xét nghiệm, ựảm bảo không gây ô nhiễm môi trường, ựồng thời bảo vệ bản quyền sản phẩm, virus cần ựược vô hoạt.
Có rất nhiều phương pháp vô hoạt virus, chúng tôi sử dụng phương pháp vô hoạt virus bằng formaldehyde theo tài liệu hướng dẫn vô hoạt virus của CDC (CDC Avian Influenza Training Course, 2004).
Giống virus A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 sau khi xác ựịnh ựược ựảm bảo ựược ựiều kiện về tắnh an toàn, virus ựược vô hoạt bằng formaldehyde ở các tỷ lệ nồng 10/0, 10/00 và 10/000, thời gian tiếp xúc trong 30 phút. Việc này nhằm xác ựịnh ựược nồng ựộ formaldehyde thắch hợp ựảm bảo vô hoạt 100% virus trong sản phẩm kháng nguyên mà không làm thay ựổi quá lớn hiệu giá virus.
Kết quả vô hoạt virus ựược kiểm tra bằng cách tiêm virus ựã ựược vô hoạt bằng formaldehyde ở mỗi nồng ựộ vào xoang niệu mô của trứng gà có phôi 9-10 ngày tuổi với liều 0,1 ml/phôi, mỗi nồng ựộ formaldehyde sử dụng 10 phôị Theo dõi trong 5 ngàỵ Kiểm tra hiệu giá HA dịch niệu mô thu hoạch, nếu âm tắnh tức là 100% virus ựã chết sau vô hoạt. Kết quả ựược trình bày ở bảng 4.4.
Bảng 4.4. Kết quả vô hoạt formaldehyde và ựánh giá hiệu giá kháng nguyên cúm A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 Nồng ựộ Formaldehyde Hiệu giá HA trước vô hoạt (log2) Hiệu giá HA sau vô hoạt (log2) Số lượng phôi Liều tiêm (ml) Tỷ lệ phôi chết (%) Hiệu giá HA dịch niệu mô sau tiêm (log2) 10/0 10 7 10 0,1 100 0 10/00 10 8 10 0,1 70 0 10/000 10 10 10 0,1 0 0 Từ bảng 4.4 cho thấy:
Nồng ựộ formaldehyde 10/0 toàn bộ số phôi kiểm tra chết (tỷ lệ chết 100%), kết quả kiểm tra HA của dịch niệu mô thu hoạch là âm tắnh-không có virus nhân lên. Như vậy ở nồng ựộ này virus ựã chết nhưng formaldehyde lại gây ựộc và làm chết phôị đồng thời hiệu giá HA của virus sau khi vô hoạt giảm từ 10 log2 xuống 7 log2.
Nồng ựộ formaldehyde 10/00 tỷ lệ phôi chết là 70%, kết quả kiểm tra HA âm tắnh, virus không nhân lên. Tỷ lệ formaldehyde/dịch niệu mô như vậy cũng ựã giết hết virus nhưng vẫn gây ựộc cho phần lớn số phôị Nồng ựộ formaldehyde 10/00 cũng làm giảm hiệu giá HA của kháng nguyên cúm sau vô hoạt (còn 8 log2 so với 10 log2 trước vô hoạt).
Nồng ựộ formaldehyde 10/000 tỷ lệ phôi chết là 0%, kết quả kiểm tra HA dịch niệu mô thu hoạch âm tắnh, chứng tỏ virus ựã bị vô hoạt hoàn toàn, không có khả năng nhân lên. đồng thời kết quả mổ khám phôi cho thấy phôi gà phát triển bình thường, chứng tỏ nồng ựộ formaldehyde sử dụng không gây ảnh hưởng ựến phôị Hiệu giá HA của kháng nguyên cúm không thay ựổi sau vô hoạt, ổn ựịnh ở 10 log2.
Như vậy, sử dụng formaldehyde với tỷ lệ 10/000 ựã hoàn toàn vô hoạt ựược virus A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1, ựồng thời không làm thay ựổi hiệu giá HA của kháng nguyên cúm. đó là nồng ựộ tối ưu ựể áp dụng cho việc chế kháng nguyên cúm A/H5N1.
4.4. KẾT QUẢ KIỂM TRA đỘ VÔ TRÙNG CỦA SẢN PHẨM KHÁNG NGUYÊN CÚM
độ vô trùng của kháng nguyên cúm ựược xác ựịnh bằng các kiểm tra việc nhiễm tạp khuẩn.
Sản phẩm kháng nguyên cúm A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 vô hoạt lần lượt ựược kiểm tra vô trùng trên các môi trường thạch nấm Sarbourad, thạch thường, thạch máu, nước thịt, nước thịt gan yếm khắ, mỗi loại môi trường gồm 2 ống, với liều kiểm tra là 0,1 ml/ống.
Sau khi cấy, toàn bộ các ống môi trường kiểm tra ựược ủ ở nhiệt ựộ 370C và theo dõi trong 7 ngày; riêng môi trường thạch nấm ựể ở nhiệt ựộ phòng.
Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra ựộ vô trùng của sản phẩm kháng nguyên cúm Lần TN 1 Lần TN 2 Môi trường kiểm tra Nhiệt ựộ (0C) Liều kiểm tra (ml) Số ống kiểm tra Số ống (+) Số ống kiểm tra Số ống (+) Thạch nấm Nhiệt ựộ phòng 0,1 2 0 2 0 Thạch thường 37 0,1 2 0 2 0 Nước thịt 37 0,1 2 0 2 0 Nước thịt gan yếm khắ 37 0,1 2 0 2 0 Thạch máu 37 0,1 2 0 2 0
Qua bảng 4.5. cho thấy:
Sau khi theo dõi trong 7 ngày, ở nhiệt ựộ 370C, toàn bộ số ống môi trường kiểm tra (thạch nấm Sarbourad, thạch thường, thạch máu, nước thịt, nước thịt gan yếm khắ) ựều âm tắnh. Lặp lại ở lần thắ nghiệm thứ 2 cho kết quả giống lần 1.
Như vậy, sản phẩm kháng nguyên cúm A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 vô hoạt ựảm bảo ựộ vô trùng.
4.5. KẾT QUẢ đÁNH GIÁ đỘ NHẠY CHẨN đOÁN VÀ đỘ đẶC HIỆU CHẨN đOÁN CỦA SẢN PHẨM KHÁNG NGUYÊN CÚM.
Sản phẩm kháng nguyên cúm ựược coi là ựạt yêu cầu cho sử dụng trong chẩn ựoán xét nghiệm phải ựảm bảo phát hiện chắnh xác các mẫu huyết thanh dương tắnh và âm tắnh.
Do vậy, kháng nguyên cúm A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 cần ựược kiểm tra và so sánh kết quả với kháng nguyên chuẩn về ựộ nhạy chẩn ựoán và ựộ ựặc hiệu chẩn ựoán.
Ngoài ra, sản phẩm kháng nguyên cúm cần ựược kiểm tra với các loại huyết thanh của các subtype virus cúm khác, ựể tránh hiện tượng gây phản ứng chéọ
4.5.1. đánh giá ựộ nhạy chẩn ựoán và ựộ ựặc hiệu chẩn ựoán với huyết thanh dương và huyết thanh âm
Xác ựịnh ựộ nhạy chẩn ựoán của sản phẩm kháng nguyên cúm nhằm mục ựắch ựánh giá khả năng phát hiện các mẫu huyết thanh gia cầm ựược tiêm phòng vắc xin cúm H5N1 có kháng thể kháng virus cúm H5.
Xác ựịnh ựộ ựặc hiệu chẩn ựoán của sản phẩm kháng nguyên cúm nhằm ựánh giá khả năng phát hiện chắnh xác các mẫu huyết thanh gia cầm không có kháng thể kháng virus cúm H5.
Sử dụng 30 mẫu huyết thanh chuẩn H5N1 (hiệu giá kháng thể ≥ 4log2) của gia cầm ựã ựược xác ựịnh là có kháng thể kháng virus cúm gia cầm bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu-HI với kháng nguyên của Anh
(A/Ck/Scot/59) và 30 mẫu huyết thanh chuẩn âm tắnh ựược xác ựịnh bằng phản
ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu-HI không có kháng thể kháng virus cúm gia cầm H5N1.
Qua 2 lần lặp lại kiểm tra ựánh giá ựộ nhạy chẩn ựoán và ựộ ựặc hiệu chẩn ựoán. Kết quả ựược trình bày ở bảng 4.6.
Bảng 4.6. Kết quả kiểm tra ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu kháng nguyên cúm Huyết thanh chuẩn
Huyết thanh chuẩn dương Huyết thanh chuẩn âm Loại kháng nguyên Lần TN Số mẫu HI (+) HI (-) Số mẫu HI (+) HI (-) A/Ck/Scot/59 30 30 0 30 0 30 A/Vietnam/1203- H5N1 Lần 1 30 28 2 30 0 30
đánh giá độ nhạy (%) = 93,33 % độ ựặc hiệu (%) = 100%
A/Ck/Scot/59 30 30 0 30 0 30
A/Vietnam/1203- H5N1
Lần 2
30 29 2 30 0 30
đánh giá độ nhạy (%) = 96,67 % độ ựặc hiệu (%) = 100%
Qua bảng 4.6. cho thấy:
Lần thử nghiệm 1, trong 30 mẫu huyết thanh chuẩn dương tắnh, khi thực hiện phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu-HI, sản phẩm kháng nguyên cúm
A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 cho kết quả dương tắnh 28/30 (mẫu kiểm tra), kháng nguyên cúm có ựộ nhạy 93,33%.
Trong 30 mẫu huyết thanh chuẩn âm tắnh, khi thực hiện phản ứng HI, sản phẩm kháng nguyên cúm cho kết quả âm tắnh 30/30 (mẫu kiểm tra), kháng nguyên cúm có ựộ ựặc hiệu 100%.
Lần thử nghiệm 2, trong 30 mẫu huyết thanh chuẩn dương tắnh, khi thực
hiện phản ứng-HI, sản phẩm kháng nguyên cúm A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1
cho kết quả dương tắnh 29/30 (mẫu kiểm tra), kháng nguyên cúm có ựộ nhạy 96,67%.
Trong 30 mẫu huyết thanh chuẩn âm tắnh, khi thực hiện phản ứng HI, sản phẩm kháng nguyên cúm cho kết quả âm tắnh 30/30 (mẫu kiểm tra), kháng nguyên cúm có ựộ ựặc hiệu 100%.
Như vậy, kháng nguyên cúm A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 có ựộ nhạy và ựặc hiệu tương ựối cao, gần tương ựương với kháng nguyên của Anh
A/Ck/Scot/59.
Sản phẩm kháng nguyên cúm có khả năng phát hiện ựược kháng thể kháng virus cúm gia cầm H5 có trong huyết thanh chuẩn dương tắnh, cũng như không có hiện tượng âm tắnh giả khi xét nghiệm các mẫu huyết thanh chuẩn âm tắnh.
4.5.2. đánh giá ựộ ựặc hiệu của kháng nguyên cúm A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 với các kháng thể cúm subtype khác
Sản phẩm kháng nguyên cúm A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 ựược kiểm tra ựộ ựặc hiệu với kháng thể cúm gia cầm thuộc một số subtype khác (H4N1, H6N2, H7N7 và H9N2) bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu-HỊ
Mỗi loại kháng thể cúm của các subtype khác sử dụng 10 mẫu kiểm trạ Kết quả ựược trình bày tại bảng 4.7.
Bảng 4.7: Kết quả ựánh giá ựộ ựặc hiệu của kháng nguyên cúm
A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 với kháng thể thuộc một số subtype khác.
Kết quả phản ứng HI Lần TN Loại Kháng nguyên Loại kháng thể Số mẫu kiểm tra HI (+) HI (-) H4N1 10 0 10 H6N2 10 0 10 H7N7 10 0 10 Lần 1 A/Vietnam/1203- H5N1 clade 1 H9N2 10 0 10 H4N1 10 0 10 H6N2 10 0 10 H7N7 10 0 10 Lần 2 A/Vietnam/1203- H5N1 clade 1 H9N2 10 0 10
Bảng 4.7 cho thấy: Tất cả mẫu của kháng thể cúm gia cầm thuộc các subtype khác khi khác kiểm tra với kháng nguyên cúm A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 ựều cho kết quả âm tắnh qua 2 lần thử nghiệm.
Như vậy, kháng nguyên cúm A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 chỉ ựặc hiệu phát hiện kháng thể cúm H5 và không có phản ứng chéo giữa sản phẩm kháng nguyên cúm với kháng thể của các subtype H4N1, H6N2, H7N7 và H9N2.
4.6. KẾT QUẢ SO SÁNH SẢN PHẨM KHÁNG NGUYÊN CÚM VỚI KHÁNG NGUYÊN CỦA ANH NGUYÊN CỦA ANH
4.3.1. Kết quả xác ựịnh kháng thể cúm gia cầm khi sử dụng sản phẩm kháng nguyên cúm và kháng nguyên của Anh
Sản phẩm kháng nguyên A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 sau khi ựảm bảo tất cả các yêu cầu về ựộ vô trùng, ựộ nhạy, ựộ ựặc hiệụ để ựánh giá chất lượng của sản phẩm kháng nguyên, chúng tôi tiến hành so sánh sản phẩm kháng
nguyên A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 với kháng nguyên của Anh
(A/Ck/Scot/59) bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu-HỊ
đây là một trong những tiêu chắ quan trọng. Sản phẩm kháng nguyên cúm phải có kết quả tương ựương với kháng nguyên của Anh ựang ựược sử dụng ở hệ thống phòng thắ nghiệm thú y trong nước.
Chúng tôi tiến hành thu thập 3000 mẫu huyết thanh gia cầm (gà, vịt) tại một số ựịa phương (Hà Nội, Nam định, Vĩnh Phúc) thực hiện phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu-HỊ
Kết quả xác ựinh kháng thể cúm gia cầm bằng phản ứng-HI khi sử dụng kháng nguyên A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 với kháng nguyên cúm của Anh
Bảng 4.8. Kết quả xác ựịnh kháng thể cúm gia cầm một số tỉnh khi sử dụng kháng nguyên A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 và kháng nguyên của Anh
Kháng nguyên địa ựiểm Kết quả
kiểm tra
A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 A/Ck/Scot/59
Số mẫu xét nghiệm 2635 2635 Số mẫu HI ≥ 4 log2 1737 1842 Hà Nội Tỷ lệ bảo hộ (%) 65,92 69,91 Số mẫu xét nghiệm 142 142 Số mẫu HI ≥ 4 log2 81 86 Nam định Tỷ lệ bảo hộ (%) 57,04 60,56 Số mẫu xét nghiệm 223 223 Số mẫu HI ≥ 4 log2 217 217 Vĩnh Phúc Tỷ lệ bảo hộ (%) 97,31 97,31 Số mẫu xét nghiệm 3000 3000 Số mẫu HI ≥ 4 log2 2035 2145 Tổng số Tỷ lệ bảo hộ (%) 69,83 71,50
0 20 40 60 80 100 Hà Nội Nam định Vĩnh Phúc Tổng số A/Vietnam/1203-H5N1 A/Chicken/Scotland/59/H5N1 Hình 4.1. Kết quả xác ựịnh kháng thể cúm một số tỉnh khi sử dụng kháng nguyên A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 và kháng nguyên của Anh
Từ bảng 4.8 và hình 4.1 cho thấy:
Mẫu huyết thanh thu thập ở Hà Nội có tỷ lệ bảo hộ là 65,92% với kháng nguyên A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 so với tỷ lệ bảo hộ 69,91% với kháng nguyên A/Ck/Scot/59.
Huyết thanh thu thập ở Nam định có tỷ lệ bảo hộ là 57,04% với kháng nguyên A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 so với tỷ lệ bảo hộ 60,56% với kháng nguyên A/Ck/Scot/59.
Huyết thanh thu thập ở Vĩnh Phúc có tỷ lệ bảo hộ là 97,31% với kháng nguyên A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 tương ựương với tỷ lệ bảo hộ 97,31% với kháng nguyên A/Ck/Scot/59.
Tổng hợp tất cả các mẫu huyết thanh thu thập ở các ựịa phương trên, chúng tôi thấy, trong 3000 mẫu xét nghiệm với kháng nguyên A/Vietnam/1203- H5N1 clade 1 có số mẫu HI ≥ 4 log2 là 2035 mẫu, tương ứng với tỷ lệ bảo hộ là 67,83% và kháng nguyên A/Ck/Scot/59 có số mẫu HI ≥ 4 log2 là 2145 mẫu, tương ứng với tỷ lệ bảo hộ 71,50%.
Như vậy, khi so sánh 2 loại kháng nguyên có chênh lệch về tỷ lệ bảo hộ. Tuy nhiên, về mặt thống kê, tỷ lệ bảo hộ khi sử dụng kháng nguyên
A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 và khi sử dụng kháng nguyên chuẩn của Anh
A/Ck/Scot/59 là không có sự sai khác (kiểm ựịnh χ2 với khoảng tin cậy 95%).
điều này cho thấy, sản phẩm kháng nguyên cúm (A/Vietnam/1203-H5N1
clade 1) cho kết quả xét nghiệm tương ựương với kháng nguyên của Anh (A/Ck/Scot/59).
để có ựánh giá toàn diện hơn về chất lượng của sản phẩm kháng nguyên chúng tôi tiến hành so sánh kết quả xét nghiệm mẫu huyết thanh của gà và vịt khi sử dụng 2 loại kháng nguyên A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 và
Bảng 4.9. Kết quả xác ựịnh kháng thể cúm gia cầm ở gà, vịt khi sử dụng kháng nguyên A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 và kháng nguyên của Anh
Kháng nguyên đối
tượng
Kết quả
kiểm tra A/Vietnam/1203-H5N1 clade 1 A/Ck/Scot/59
Số mẫu xét nghiệm 2163 2163 Số mẫu HI ≥ 4 log2 1650 1710