Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của lợn mắc PCV2 (porcine circovirus type 2) và áp dụng phương pháp hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - - MẠC THỊ YẾN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA LỢN MẮC PCV2 (PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2) VÀ ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP HĨA MƠ MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐỐN BỆNH CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y MÃ SỐ : 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS NGUYỄN HỮU NAM HÀ NỘI – 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Mọi giúp đỡ cảm ơn Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2014 Tác giả luận văn Mạc Thị Yến Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Hữu Nam tận tình hướng dẫn tơi q trình nghiên cứu xây dựng luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc, tập thể thầy giáo, cô giáo, Ban chủ nhiệm Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận văn Chân thành cảm ơn trại chăn nuôi lợn địa phương đội ngũ thú y viên sở địa bàn thành phố Hải Phịng tạo điều kiện giúp tơi thực tập có số liệu thực tế để xây dựng luận văn Nhân dịp xin trân trọng cảm ơn ban Lãnh đạo Cơ quan Thú y Vùng II, bạn bè, đồng nghiệp gia đình giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên q trình học tập hồn thành luận văn Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2014 Tác giả luận văn Mạc Thị Yến Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii MỞ ĐẦU i Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh PCV2 (Porcine Circovirus type 2) gây lợn 1.1.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.1.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 1.2 Virus PCV2 (Porcine Circovirus Type 2) 1.2.1 Lịch sử bệnh 1.2.2 Đặc điểm phân loại PCV2 1.2.3 Đặc điểm cấu trúc PCV2 1.2.4 Sức đề kháng PCV2 10 1.2.5 Cơ chế sinh bệnh 10 1.3 Bệnh PCV2 gây 11 1.3.1 Đặc điểm chung bệnh PCV2 gây 11 1.3.2 Triệu chứng lâm sàng bệnh tích 14 1.3.3 Chẩn đốn bệnh 15 1.3.4 Biện pháp phòng bệnh 17 1.4 Một số hiểu biết hóa mơ miễn dịch 19 1.4.1 Lịch sử phát triển kỹ thuật hoá mô miễn dịch 19 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii 1.4.2 Nội dung kỹ thuật hố mơ miễn dịch Chương ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 22 2.1 Đối tượng nguyên liệu nghiên cứu 22 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.1.2 Nguyên liệu nghiên cứu 22 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 22 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Phương pháp điều tra xác định bệnh 23 2.3.2 Nghiên cứu tiêu huyết học 23 2.3.3 Phương pháp mổ khám 24 2.3.4 Phương pháp làm tiêu vi thể 24 2.3.5 Phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry – IHC) 27 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 28 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Kết nghiên cứu tỷ lệ mắc PMWS 29 3.2 Kết khảo sát số tiêu huyết học lợn bệnh 31 3.2.1 Kết khảo sát số tiêu hệ hồng cầu lợn bệnh 32 3.2.2 Kết khảo sát số tiêu bạch cầu lợn bệnh 34 3.3 Kết xác định số triệu chứng lâm sàng chủ yếu 36 3.4 Kết bệnh tích đại thể số quan lợn mắc PMWS 39 3.5 Tổn thương vi thể 42 3.6 Kết phản ứng hóa mơ miễn dịch 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 Kết luận 53 Đề nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 55 Page iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ab-ELISA : Antibody Enzym Linked Immunosorbent Assay APP : Actinobacillus pleuropneumoniae CSFV : Classical Swine Fever Virus DNA : Deoxyribonucleic acid ELISA : Enzym Linked Immunosorbent Assay IFA : Indirect Immunofluorescense Assay IPMA : Immuno Peroxidae Monolayer Assay ISH : In Situ Hybridization MH : Mycoplasma hyopneumoniae nPCR : Nested Polymerase Chain Reaction ORF : Open Reading Frame PCR : Polymerase Chain Reaction PCV : Porcine Circovirus PCV1 : Porcine Circovirus type PCV2 : Porcine Circovirus type PCVAD : Porcine Circovirus Associated Disease PDNS : Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome PK15 : Pig Kidney 15 PMWS : Postweaning multisystemic wasting syndrome PNP : Proliferating Necrotizing Pneumonia PPV : Porcine parvovirus PRDC : Porcine Respiratory Disease Complex PRRS : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism RNA : Ribonucleic Acid ssDNA : Single-stranded DNA TGEV : Transmissible Gastro Enteritis Virus Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Các vắc xin tiêm phòng PCV2 sử dụng giới 17 3.1 Tỷ lệ mắc PMWS số trại Hải Phòng 29 3.2 Kết xác định nguyên nhân bệnh phản ứng PCR 30 3.3 Kết khảo sát số tiêu hệ hồng cầu lợn bệnh 32 3.4 Kết khảo sát tiêu bạch cầu lợn mắc PMWS 35 3.5 Triệu chứng lâm sàng lợn mắc PMWS 37 3.6 Biến đổi bệnh tích đại thể lợn mắc PMWS 39 3.7 Biến đổi bệnh tích vi thể lợn mắc PMWS 43 3.8 Kết nhuộm hóa mô miễn dịch xác định phân bố virus quan Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 50 Page vi DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Phân loại thành viên họ Circoviridae 1.2 Cấu trúc PCV2 theo Hamel cs (1998) 1.3 Tình hình nhiễm PMWS giới (Allan Ellis, 2000) 13 3.1 Lợn cịi cọc, xù lơng 38 3.2 Lợn bị viêm da 38 3.3 Lợn ủ rũ, mệt mỏi, lười vận động 38 3.4 Hạch hàm, hạch màng treo ruột sưng, xuất huyết 41 3.5 Gan sưng, tụ máu 41 3.6 Phổi xuất huyết 41 3.7 Hạch màng treo ruột sưng, xuất huyết; Thành ruột mỏng 41 3.8 Thận sưng, xuất huyết 42 3.9 Lách sưng, nhồi huyết 42 3.10 Thâm nhiễm tế bào viêm gan (H.E 10X) 47 3.11 Thâm nhiễm tế bào viêm gan (H.E 40X) 47 3.12 Thâm nhiễm bạch cầu toan lợn nhiễm Circovirus (H.E 20X) 47 3.13 Thâm nhiễm bạch cầu toan lợn nhiễm Circovirus(H.E 40X) 47 3.14 Tế bào khổng lồ nhiều nhân gan lợn nhiễm Circovirus (H.E 40X) 3.15 47 Tế bào khổng lồ nhiều nhân lách lợn nhiễm Circovirus (H.E 40X) 47 3.16 Tăng sinh bạch cầu toan hạ niêm mạc ruột (H.E 20X) 48 3.17 Tăng sinh bạch cầu toan ruột (H.E 20X) 48 3.18 Phối sung huyết, xuất huyết, vách phế nang dày (H.E 10X) 48 3.19 Tim thâm nhiễm tế bào viêm, sung huyết (H.E 10X) 48 3.20 Ruột sung huyết, xuất huyết (H.E 10X) 48 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii 3.21 Hạch lâm ba sung huyết, xuất huyết (H.E 10X) 48 3.22 Virus phân bố lách (IHC 10X) 52 3.23 Virus phân bố lách (IHC 40X) 52 3.24 Virus phân bố phổi (IHC 10X) 52 3.25 Virus phân bố gan 52 3.26 Virus phân bố hạch (IHC 10X) 52 3.27 Virus phân bố hạch (IHC 40X) 52 (IHC 40X) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ngành chăn nuôi giữ vai trò quan trọng sản xuất nông nghiệp nước ta, chiếm 27% – 28% tổng giá trị toàn ngành Để đáp ứng tốt nhu cầu ngày cao xã hội sản phẩm chăn nuôi, xu hướng chăn nuôi chuyển từ nhỏ lẻ, phân tán sang tập trung, trang trại Trong đó, chăn ni lợn khơng phải ngoại lệ với sản lượng đáp ứng khoảng 75% – 80% nhu cầu xã hội Tuy nhiên, bên cạnh bất ổn giá cả, nguồn gốc thức ăn sử dụng chăn nuôi, chất tồn dư sản phẩm chăn ni dịch bệnh bùng phát khiến cho ngành chăn ni lợn gặp nhiều khó khăn thách thức Một bệnh gây thiệt hại lớn lưu hành với tỷ lệ cao đàn lợn Việt Nam nhiều nơi giới bệnh Porcine Circovirus type (PCV2) gây PCV2 có cấu tạo DNA (single-stranded DNA) (với khoảng 1,76 – 1,77 kilobase) (Meehan cs., 1998) PCV2 gây suy giảm hệ thống miễn dịch (suy giảm tế bào lympho), với tác nhân gây bệnh kế phát khác gây nên hội chứng bệnh liên quan với PCV2 (PCVAD) gồm có: Hội chứng suy đa tạng lợn sau cai sữa (PMWS), hội chứng Viêm da sưng thận (PDNS), rối loạn sinh sản lợn, phức hợp bệnh hô hấp lợn (PRDC), viêm phổi hoại tử tăng sinh (PNP) Hội chứng suy đa tạng lợn sau cai sữa (PMWS) phát lần miền Tây Canada vào năm 1991, sau tìm thấy Bắc Mỹ, châu Âu, châu Á (Harding cs., 1998) với đặc điểm như: giảm khối lượng thể, còi cọc, chậm lớn, suy hơ hấp, khó thở, hồng đản, hạch lympho sưng to, tiêu chảy lợn giai đoạn – 12 tuần tuổi Hiện nay, PMWS trở nên phổ biến gây thiệt hại lớn kinh tế ảnh hưởng xấu đến sức khỏe đàn lợn chăn nuôi quy mô công nghiệp giới PCV2 phân lập từ lợn mắc PMWS nhiều nơi tồn giới có mức độ tương đồng trình tự nucleotide 94,6% – 99,0% (Fenaux cs., 2000) Ở nước ta năm gần đây, hội chứng bệnh liên quan tới PCV2 hội chứng suy đa tạng lợn sau cai sữa coi vấn đề gây thiệt hại đáng kể Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page hóa chất tế bào gây Miền vỏ thận: quan sát tiểu thể Malpighi, cá tháp thận cột Ferrin Cầu mao quản tiểu thể Malpighi có tượng teo, kích thước cầu mao quản nhỏ nhiều so với bình thường Các ống lượn gần, ống lượn xa bị thối hóa với dịch nhày chèn ép, tế bào thành ống hoại tử Bởi xâm nhập vào thể lợn gây bệnh, số tế bào đích PCV2 tế bào biểu mô ống thận, khiến cấu trúc thận viêm thối hóa d Hạch: Bệnh tích đáng ý suy giảm tế bào lympho, đặc biệt nang lympho Hạch lympho xuất huyết, đứt nát, khơng cịn rõ cấu trúc nang lympho trung tâm sinh trưởng, vách ngăn dày lên Các tế bào lympho bị thối hóa thâm nhiễm tế bào viêm e Ruột: Xuất huyết, sung huyết, lông nhung ruột đứt nát, tế bào biểu mơ ruột thối hóa Thâm nhiễm tế bào viêm: bạch cầu đa nhân trung tính f Tim: Cơ tim giãn rộng (thối hóa tim), giải thích q trình viêm phổi gây rối loạn hơ hấp, lợn khó thở, suy hơ hấp, ảnh hưởng tới q trình trao đổi khí, vận chuyển oxy tới mơ bào, tim phải tăng cường co bóp, hoạt động bù để đảm bảo đủ oxy cho mô bào Lâu dần dẫn tới viêm tim, nên có tượng thâm nhiễm tế bào viêm, tim giãn rộng g Lách: Có tượng sung huyết thâm nhiễm tế bào viêm, đặc biệt có xuất tế bào khổng lồ, dấu hiệu đặc trưng bệnh PCV2 gây (Chae,2005) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 46 MỘT SỐ HÌNH ẢNH QUAN SÁT VI THỂ Hình 3.10 Thâm nhiễm tế bào viêm Hình 3.11 Thâm nhiễm tế bào viêm gan (H.E 10X) gan (H.E 40X) Hình 3.12 Thâm nhiễm bạch cầu Hình 3.13 Thâm nhiễm bạch cầu toan lợn nhiễm Circovirus (H.E 20X) toan lợn nhiễm Circovirus(H.E 40X) Hình 3.14 Tế bào khổng lồ nhiều Hình 3.15 Tế bào khổng lồ nhiều nhân gan lợn nhiễm Circovirus nhân lách lợn nhiễm Circovirus (H.E 40X) (H.E 40X) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page 47 Hình 3.16 Tăng sinh bạch cầu toan Hình 3.17 Tăng sinh bạch cầu toan hạ niêm mạc ruột (H.E 20X) ruột (H.E 20X) Hình 3.18 Phối sung huyết, xuất Hình 3.19 Tim thâm nhiễm tế bào huyết, vách phế nang dày (H.E 10X) viêm, sung huyết (H.E 10X) Hình 3.20 Ruột sung huyết, xuất Hình 3.21 Hạch lâm ba sung huyết, huyết (H.E 10X) xuất huyết (H.E 10X) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 48 3.6 Kết phản ứng hóa mơ miễn dịch Từ bệnh phẩm lợn dương tính với PCV2 qua phản ứng PCR, chúng tơi tiến hành làm hóa mơ miễn dịch, khẳng định tính xác phương pháp xác định phân bố virus quan tổ chức lợn nghiên cứu Kết nghiên cứu giúp cho việc chẩn đốn xác, kịp thời, góp phần phịng chống Circovirus type nhanh, hiệu quả, giảm thiệt hại cho người chăn nuôi, đặc biệt trang trại quy mô công nghiệp Chúng tiến hành lợn Ở lợn nghiên cứu, chọn quan là: phổi, hạch lympho, lách gan Mỗi quan lợn, chọn block vùng có tổn thương đại thể để làm hóa mơ miễn dịch Kết nhuộm hóa mô miễn dịch thể bảng 3.8 Phương pháp nhuộm hóa miễn dịch tổ chức thực nguyên tắc kết hợp kháng nguyên kháng thể, phương pháp cho phép xác định có mặt virus tổ chức bệnh lý Theo Boenisch (2001), có mặt virus tổ chức đem làm hóa miễn dịch cho kết dương tính với xuất màu nâu vàng lát cắt tổ chức (màu DAB) Như vậy, dựa vào xuất màu nâu vàng tiêu chúng tơi đánh giá vị trí virus cư trú mật độ virus phân bố Quan sát tiêu nhuộm IHC thấy có phân bố virus quan sau: Virus cư trú nhân lên tế bào gan, tế bào biểu mô ống mật tế bào Kuffer gan quan sát thông qua phát có mặt kháng nguyên PCV2 (Rosell cs, 1999) (hình 3.25) Ở phổi, virus phát bên phế quản, cuống phổi, tế bào biểu mô phế nang dịch tiết tế bào viêm phế quản, phế nang (Rosell cs, 1999) Tại phổi, tế bào đích chúng cơng đại thực bào phế nang (hình 3.24) Tại hạch lympho, diện virus rõ ràng Tại đây, virus công vào tế bào miễn dịch nằm bên nang lympho (hình 3.26, 3.27) Khơng giống quan khác, kháng nguyên PCV2 phát phân bố rải rác lách (hình 3.22, 3.23) Kết nghiên cứu dựa tiêu dương tính điển hình tổng hợp bảng sau: Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 49 Bảng 3.8 Kết nhuộm hóa mơ miễn dịch xác định phân bố virus quan Cơ quan STT Phổi Lợn Hạch lympho Lách Gan Block Block Block Block Block Block Block Block 2 2 Lợn ++ ++ +++ +++ ++ ++ ++ +++ Lợn ++ ++ +++ ++ - + ++ ++ Lợn +++ + ++ ++ ++ ++ +++ ++ Lợn - + ++ ++ - + ++ + Lợn + ++ +++ ++ + ++ +++ ++ Trong đó: +++ Đám, hạt bắt màu nâu vàng nhiều ++ Đám,hạt bắt màu nâu vàng trung bình + Đám, hạt bắt màu nâu vàng - Khơng có đám, hạt bắt màu nâu vàng Qua bảng 3.8 ta thấy, tiêu khác cho kết không giống Tùy thời gian virus xâm nhập vào thể lợn diễn biến bệnh mà lượng virus cư trú quan khác Nhìn chung, hạch lympho gan hai quan có số lượng virus tồn nhiều tiêu có nhiều vị trí bắt màu nhiều Điều giải thích PCV2 thích ứng với đại thực bào nằm bên hạch lâm ba nên sau xâm nhập vào thể đến cơng vào đại thực bào sau cơng đến đại thực bào quan khác Ở kết IHC lợn, quan sát thấy khác biệt kết nhuộm màu IHC quan hai vị trí khác Ở lợn lứa tuổi sau cai sữa 1, tiêu gan có kết IHC (++), tiêu có kết IHC (+++) Cịn tổ chức phổi lợn 3, tiêu có kết IHC (+++) tiêu có kết IHC (+) Ở lợn lợn 4, tổ chức lách, tiêu IHC có kết (-), tiêu IHC có kết (+) Nếu theo dõi Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 50 thời điểm virus công vào quan ta đưa chế sinh bệnh cụ thể PCV2 Kết IHC lợn có khác mức độ biểu bệnh lợn không đồng Điều giải thích cá thể có sức đề kháng với bệnh điều kiện ngoại cảnh khác nên mức độ trầm trọng bệnh khác Mặt khác, lợn lấy trại khác nên có chế độ chăm sóc ni dưỡng, vệ sinh chuồng trại, khả điều kiện tiếp xúc với mầm bệnh lợn không giống Mức độ biểu bệnh nặng hay nhẹ phụ thuộc vào số lượng, độc lực virus, đường xâm nhập thời gian virus xâm nhập vào thể lợn… Tất kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu C.Rosell cs (1999); Kim Chae (2004) Qua kết chúng tơi có nhận xét: Trong số 40 block lợn chọn làm thí nghiệm (mỗi lợn lấy quan phổi, gan, hạch, lách quan làm block vị trí khác nhau) có 37 block lợn quan sát virus tập trung đại thực bào phế nang, tế bào kuffer nang lympho đặc biệt gan hạch lympho Tại gan hạch lympho, kết nhuộm hóa mơ miễn dịch cho kết dương tính rõ, có nhiều đám bắt màu nâu vàng (hình 3.25, 3.27) Hai quan khác phổi lách, tiêu cho kết dương tính số lượng đám bắt màu nâu vàng không nhiều (hình 3.24, 3.23) Bên cạnh có block không thấy xuất virus tế bào tổ chức Điều lý giải sau, q trình làm tiêu nhuộm hóa miễn dịch không lấy phần tổ chức có virus cơng tổ chức hoại tử khơng cịn virus nên khơng có kết hợp kháng nguyên kháng thể, tiêu không xuất màu đặc trưng Kết nhuộm IHC cho thấy hạch lympho gan cho kết dương tính tất tiêu nhuộm chúng tơi, vậy, hạch gan quan có giá trị chẩn đoán tốt nghiên cứu PCV2 đối tượng lợn sau cai sữa Như vậy, bước đầu sử dụng kỹ thuật hóa mơ miễn dịch với kháng thể PCV2 chất nhuộm màu DAB chẩn đốn PCV2 cho kết xác Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page 51 MỘT SỐ HÌNH ẢNH NHUỘM HĨA MƠ MIỄN DỊCH (IHC) Hình 3.22 Virus phân bố lách Hình 3.23 Virus phân bố lách (IHC 10X) (IHC 40X) Hình 3.24 Virus phân bố phổi Hình 3.25 Virus phân bố gan (IHC 10X) (IHC 40X) Hình 3.26 Virus phân bố hạch Hình 3.27 Virus phân bố hạch (IHC 10X) (IHC 40X) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Tỷ lệ mắc bệnh PMWS trại lợn trung bình 4,21%; tỷ lệ tử vong trung bình 25,01% Số lượng hồng cầu, hàm lượng Hb, tỷ khối huyết cầu lợn bệnh giảm so với lợn khỏe Số lượng hồng cầu giảm từ 6,65 triệu/µl lợn đối chứng xuống cịn 4,53 triệu/µl lợn bệnh Có giảm rõ rệt số lượng bạch cầu, từ 15,25 nghìn/µl lợn đối chứng, cịn 11,83 nghìn/µl lợn bệnh, cơng thức bạch cầu thay đổi: bạch cầu đa nhân trung tính bạch cầu toan tăng, bạch cầu đơn nhân lympho bào giảm Suy giảm tế bào lympho đặc trưng bệnh PMWS Triệu chứng lâm sàng điển hình bệnh PMWS viêm da, cịi cọc, chậm lớn; ỉa chảy; khó thở hạch bẹn nơng sưng Bệnh tích đại thể chủ yếu biểu đường hơ hấp, tiêu hóa hệ bạch huyết: hạch lympho sưng to, xuất huyết; phổi xuất huyết, xen kẽ vùng lành vùng tổn thương, thành ruột mỏng, niêm mạc ruột xuất huyết Bệnh tích vi thể: quan gan, phổi, lách, thận ruột điều bị tổn thương, chủ yếu xuất huyết, xung huyết, thâm nhiễm tế bào viêm, thoái hóa tế bào xuất tế bào khổng lồ nhiều nhân Phương pháp hóa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry) cho phép chẩn đốn nhanh xác bệnh PCV2 Đề nghị PCV2 liên quan đến nhiều hội chứng khác nhau, gây bệnh cho lợn nhiều lứa tuổi khác nhau, nhiên điều kiện không cho phép nghiên cứu hội chứng PMWS gây lợn từ - 16 tuần tuổi PCV2 cịn gây nhiễm mơ, quan khác gan, phổi, thận, lách, ruột Để nghiên cứu hoàn thiện đưa đề nghị: - Nghiên cứu hội chứng khác PCV2 gây lứa tuổi khác, mở rộng phạm vi nghiên cứu nhiều địa phương Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 53 - Tiếp tục nghiên cứu biến đổi bệnh tích vi thể quan khác ứng dụng phương pháp hóa mơ miễn dịch rộng - Tiến hành giải trình tự gen virus để phát biến chủng virus, nhằm chế tạo vacxin phòng bệnh đạt hiệu cao Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt Trần Thị Dân, Nguyễn Tất Toàn, Nguyễn Thị Thu Năm, Võ Thị Trà An (2010) Biến đổi tiêu huyết học bệnh tích heo ni thịt tiêm chủng vacxin thể ORF2 phòng ngừa hội chứng gầy còm viêm da thận Circovirus type Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y 17, 114-120 Lê Tiến Dũng (2006) Phát vi rút PCV2 phương pháp PCR phân lập địch danh số vi khuẩn gây bệnh hô hấp heo nghi mắc hội chứng còi cọc sau cai sữa Luận văn Thạc sỹ Đại học Nơng lâm Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Tiến Hà (2008) Ghi nhận tình hình nhiễm, phân lập giám định porcine circovirus typ (PCV2) heo số tỉnh thành phía Nam Luận văn Thạc sỹ Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Thu Hồng, Phan Hồng Dũng, Đặng Hùng, Nguyễn Tiến Hà, Chirs Morrissy (2006) Bước đầu khảo sát tình hình nhiễm PCV2 đàn heo ni số tỉnh phía Nam Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y 3, 67-69 Nguyễn Thị Thu Hồng, Lê Thị Thu Phương, Đặng Hùng, Nguyễn Tiến Hà, Nguyễn Ngọc Hải, Chris J Morrissy, Darren Schafer (2008) Phân tích di truyền porcine circovirus typ (PCV2) lợn khu vực Nam Bộ Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y tập XV số 2, 6 Nguyễn Thị Lan Trần Thị Ánh (2012) Triệu chứng lâm sàng, biến đổi bệnh lý lợn sau cai sữa mắc Circovirus type (PCV2) ứng dụng kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) để chẩn đoán bệnh lợn vùng phụ cận Hà Nội Tạp chí Khoa học kỹ thuật chăn ni, số (159), trang 2-8 Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Nguyễn Văn Giáp, Đặng Hữu Anh, Trần Thị Hương Giang, Mai Thị Ngân, Vũ Thị Ngọc, Lê Văn Trường, Ngô Minh Hà Bong Kyun Park (2012) Ứng dụng kỹ thuật nested-PCR phát định type Porcine circovirus type (PCV2) đàn lợn nuôi số tỉnh miền Bắc Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, tập XIX, số 5, trang 18-25 II Tài liệu tiếng Anh Allan, G.M., Meehan, B.M., Todd, D., Kennedy, S., McNeilly, F., Ellis, J.A., Clark, E.G., Harding, J., Espuna, E., Botner, A., Charreyre, C.E., (1998) Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes Vet Rec 142 (17), 467468 Allan, G.M & Ellis J.A Porcine circovirus: a review (2000) J Vet Diagn Investing 12, 3-14 Allan, G.M., McNeilly, F., Kennedy, S., Meehan, B., Ellis, J., Krakowka, S., (2000b) Immunostimulation, PCV-2 and PMWS Vet Rec 147, 170-171 Allan G, McNeilly F (2006) PMWS/PCVD: diagnosis, disease, and control: what we know? In: Proceedings of the 19th International Pig Veterinary Society Congress, Copenhagen, Denmark, pp 1-9 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 55 Carl A.Gagnon et al.,(2007) The emergence of porcine circovirus 2b genotype (PCV-2b) in swine in Canada Can Vet J 48 Chae C (2005) A review of porcine circovirus 2-associated syndromes and diseases Veterinary Journal, 3, 326-336 Chianini, F., Majo, N., Segales, J., Dominguez, J., Domingo, M., (2003) Immunohistochemical characterisation of PCV2 associate lesions in lymphoid and non-lymphoid tissues of pigs with natural postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) Vet Immunol Immunopathol 94, 63-75 Choi, C., Chae, C., (2000) Distribution of porcine parvovirus in porcine circovirus 2infected pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome as shown by insitu hybridization Journal of Comparative Pathology 123, 302-305 Clark, E., (1997) Postweaning multisystemic wasting syndrome In: Proceedings of the Annual Meeting of the American Association of Swine Practitioners, Quebec City, Canada, pp 499-501 10 Dupont, K., Nielsen, E.O., Baekbo, P., Larsen, L.E., (2008) Genomic analysis of PCV2 isolates from Danish archives and a current PMWS case–control study supports a shift in genotypes with time Veterinary Microbiology 128, 56-64 11 Ellis et al.,(1998) Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome Can Vet J Volume 44-51 12 Ellis, J.A., Konoby, C., West, K.H., Allan, G.M., Krakowka, S., McNeilly, F., Meehan, B., Walker, I., (2001) Lack of antibodies to porcine circovirus type virus in beef and dairy cattle and horses in western Canada Canadian Veterinary Journal 42, 461-464 13 Ellis, J., Spinato, M., Yong, C., West, K., McNeilly, F., Meehan, B., Kennedy, S., Clark, E., Krakowka, S., Allan, G., (2003) Porcine circovirus 2-associated disease in Eurasian wild boar Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 15, 364-368 14 Fenaux, M., Halbur, P.G., Gill, M., Toth, T.E., Meng, X.-J., (2000) Genetic characterization of type porcine circovirus (PCV-2) from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome in different geographic regions of North America and development of a differential PCR-restriction fragment length polymorphism assay to detect and differentiate between infections with PCV-1 and PCV-2 J Clin Microbiol 38, 2494-2503 15 Fraile, L., Crisci, E., Weenberg, J., Armadans, M., Mendoza, L., Ruiz, L., Bernaus, S., Montoya, M., (2009) Effect of treatment with phytosterols in three herds with porcine respiratory disease complex Journal of Swine Health and Production 17, 32-41 16 Gillespie, J., Opriessnig, T., Meng, X.J., Pelzer, K., Buechner-Maxwell, V., (2009) Porcine circovirus type and porcine circovirus-associated disease J Vet Intern Med 23 (6), 1151-1163 17 Hamel, A.L., Lin, L.L., Nayar, G.P.S., (1998) Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs Journal of Virology 72, 5262-5267 18 Harding, J., (1996) Post weaning multisystemic wasting syndrome: preliminary Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 56 epidemiology and clinical findings In: Proceedings of the Western Canadian Association of Swine Practitioners, Saskatoon, Canada, p.21 19 Harding, J.C.S., Clark, E.G., (1997) Recognizing and diagnosing postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) Swine Health Prod 5, 201-203 20 Harding JCS, Clark EG, Strokappe JH, Willson PI, Ellis JA (1998) Postweaning multisystemic wasting syndrome: epidemiology and clinical presentation Journal of Swine Health and Production, 6, 249-254 21 Harrach, B., (2003) Characterisation of Hungarian Porcine Circovirus genomes associated with PMWS and PDNS cases Acta Veterinaria Hungarica 51, 551-562 22 Hines, R.K., Lukert, P.D., (1994) Porcine circovirus as a cause of congenital tremors in newborn pigs Proceeding of the American Association of Swine Practitioners 25, 344-345 23 Jaret Bogdan (2011) Association of porcine cicrovirus with reproductive failure in pigs: a retrospective study J Vet Diagn Invest 1995-1998 24 Kim, J., Chung, H.K., Chae, C., (2003) Association of porcine circovirus with porcine respiratory disease complex The Veterinary Journal 166, 251-256 25 Kim, D., Ha, Y., Oh, Y., Chae, C., (2011) Prevalence of porcine circovirus types 2a and b in pigs with and without post-weaning multi-systemic wasting syndrome Vet J 188, 115-117 26 Krakowka S, Ellis JA, Meehan B, Kennedy S, McNeilly F, Allan G (2000) Viral wasting syndrome of swine: experimental reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic swine by coinfection with porcine circovirus and porcine parvovirus Vet Pathol 37(3):254-63 27 Krakowka, S., Ellis, J., McNeilly, F., Gilpin, D.F., Meehan, B., McCullough, K.C., Allan, G., (2002) Immunologic features of porcine circovirus type infection Viral Immunol 15, 567-582 28 Kristensen, C.S., Baekbo, P., Bille-Hansen, V., Botner, A., Vigre, H., Enoe, C., Larsen, L.E., (2009) Induction of porcine post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in pigs from PMWS unaffected herds following mingling with pigs from PMWS-affected herds Veterinary Microbiology 138(3-4): 244-250 29 Kwang Soo Lyoo (2009) Inpartial fulfillmett of the requirement for the degree of doctore of philosophy Korea PhDThesis 30 Lang, H.W., Zhang, G.C., Wu, F.Q., Zhang, C.G., (2000) Detection of serum antibody against postweaning multisystemic wasting syndrome in Pigs Chin J Vet Sci Tec 30 (3), 3-5 31 Li, Y.F., Wang, X.W., Jiang, P., (2003) Occurrence of porcine circovirus type and porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Shanghai area Chin J Vet Sci 23 (5), 442-444 32 Li, W.J., Li, W.T., Yan, W.D., Chen, H.C., He, Q.G., (2009) Survey on molecular epidemiology of porcine circovirus type isolates collected from some area of China with a PCR Acta Vet Zootech Sin 40 (9), 1358-1362 33 Madson, D.M., Patterson, A.R., Ramamoorthy, S., Pal, N., Meng, X.J., Opriessnig, T., Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 57 (2009) Effect of natural or vaccine-induced porcine circovirus type (PCV2) immunity on fetal infection after artificial insemination with PCV2 spiked semen Theriogenology 72, 747-754 34 Marruchella, G., Paoletti, B., Speranza, R., Di, G.G., (2011) Fatal bronchopneumonia in a Metastrongylus elongatus and porcine circovirus type coinfected pig Res Vet Sci (June 11, Epub ahead of print) 35 Martin, H., Le Potier, M.F., Maris, P., (2008) Virucidal efficacy of nine commercial disinfectants against porcine circovirus type The Veterinary Journal 177, 388393 36 McCullough, K.C., Summerfield, A., (2009) Targeting the porcine immune systemparticulate vaccines in the 21st century Dev Comp Immunol 33, 394-409 37 McNeilly, F., Kennedy, S., Moffett, D., Meehan, B.M., Foster, J.C., Clarke, E.G., Ellis, J.A., Haines, D.M., Adair, B.M., Allan, G.M., (1999) A comparison of in situ hybridization and immunohistochemistry for the detection of a new porcine circovirus in formalin-fixed tissues from pigs with post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) J Virol Meth 80, 123-128 38 McNeilly, F., McNair, I., O’Connor, M., Brockbank, S., Gilpin, D., Lasagna, C., Boriosi, G., Meehan, B., Ellis, J., Krakowka, S., Allan, G.M., (2002) Evaluation of a porcine circovirus type 2-specific antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs: comparison with virus isolation, immunohistochemistry, and the polymerase chain reaction J Vet Diagn Invest 14 (2), 106-112 39 Meehan B.M, Creenlan J.L, McNulty M.S., Todd D (1997) Sequence of porcine circovirus AND: affinities with plant circovirus Journal virology 78, 221-227 40 Meehan, B.M., McNeilly, F., Todd, D., Kennedy, S., Jewhurst, V.A., Ellis, J.A., Hassard, L.E., Clark, E.G., Haines, D.M., Allan, G.M., (1998) Characterization of novel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs Journal of General Virology 79, 2171-2179 41 Opriessnig, T., Fenaux, M., Thomas, P., Hoogland, M.J., Rothschild, M.F., Meng, X.J., Halbur, P.G., (2006) Evidence of breed-dependent differences in susceptibility to porcine circovirus type associated disease and lesions Veterinary Pathology 43, 281-293 42 Opriessnig T, Halbur PG (2012) Concurrent infections are important for expression of porcine circovirus associated disease Virus Research 164 (1-2) 20-32 43 Pallares, F.J., Halbur, P.G., Opriessnig, T., Sorden, S.D., Villar, D., Janke, B.H., Yaeger, M.J., Larson, D.J., Schwartz, K.J., Yoon, K.J., Hoffman, L.J., (2002) Porcine circovirus type (PCV-2) coinfections in US field cases of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) J Vet Diagn Invest 14, 515-519 44 Park, J.-S., Kim, J., Ha, Y., Jung, K., Choi, C., Lim, J.-K., Kim, S.-H., Chae, C., (2005) Birth abnormalities in pregnant sows infected intranasally with porcine circovirus Journal of Comparative Pathology 132, 139-144 45 Rodríguez-Arrioja, G.M., Segalés, J., Calsamiglia, M., Resendes, A.R., Balasch, M., Plana-Duran, J., Casal, J., Domingo, M., (2002) Dynamics of porcine circovirus Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 58 type infection in a herd of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome Am J Vet Res 63 (3), 354–357 46 Rodríguez-Arrioja, G.M., Segalés, J., Rosell, C., Rovira, A., Pujols, J., Plana-Duran, J., Domingo, M., (2003) Retrospective study on porcine circovirus type infection in pigs from 1985 to 1997 in Spain J Vet Med B: Infect Dis Vet Public Health 50 (2), 99-101 47 Ronald Magar, Peter Muller, & Renee Larochelle (2000) Retrospective serological survey of antibodies to porcine circovirus type and type The Canadian Journal of Veterinary Research 64, 184-186 48 Rosell, C., Segales, J., Plana-Duran, J., Balasch, M., Rodriguez-Arrioja, G.M., Kennedy, S., Allan, G.M., McNeilly, F., Latimer, K.S., Domingo, M., (1999) Pathological, immunohistochemical, and in-situ hybridization studies of natural cases of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in pigs J Comp Pathol 120, 59-78 49 Royer, R.L., Nawagitgul, P., Halbur, P.G., Paul, P.S., (2001) Susceptibility of porcine circovirus type to commercial and laboratory disinfectants Journal of Swine Health and Production 281-284 50 Sebastian Knell, Hermann Willems, Barbara Hertrampf, Gerald Reiner (2005) Comparative genetic characterization of Porcine Circovirus type samples from German wild boar populations Veterinary Microbiology 109, 169-177 51 Segalés J, Allan GM, Domingo M (2005) Porcine circovirus diseases Animal Health Research Reviews, 6, 119-142 52 Segalés, J., Domingo, M., (2002) Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in pigs A review Veterinary Quarterly 24, 109-124 53 Shibahara, T., Sato, K., Ishikawa, Y., Kadota, K., (2000) Porcine circovirus induces B cell depletion in pigs with wasting disease syndrome Journal of Veterinary Medical Science 62, 1125–1131 54 Taner Karao (2011) Porcine circovirus type infection in Turkey Vet Fak Derg 58, 93-97 55 Tippawan Jantafong (2011) Genetic characterization of porcine circovirus type in piglets from PMWS-affected and negative farms in Thailand Virol J 8, 88 56 Tischer, I., Gelderblom, H., Vettermann, W., Koch, M.A., (1982) A very small porcine virus with circular single-stranded DNA Nature 295, 64-66 57 Wang, Z.T., Yang, H.C., Guo, X., (2002) Epidemiological investigation on infection of PCV2 in intensive swine farms Chin J Vet Med 38 (10), 3-6 58 Wang, Z.T., Guo, X., Yang, H.C., Cha, Z.L., Chen, Y.H., (2005) Sequencing and analysis of the complete genome of six porcine circovirus type isolates in China J Agric Biotechnol 13 (1), 56-60 59 Wang, F., Guo, X., Ge, X.N., Wang, Z.T., Chen, Y.H., Cha, Z.L., Yang, H.C., (2009) Genetic variation analysis of Chinese strains of porcine circovirus type Virus Res 145 (1), 151-156 60 Welch, J., Bienek, C., Gomperts, E., Simmonds, P., (2006) Resistance of porcine Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 59 circovirus and chicken anemia virus to virus inactivation procedures used for blood products Transfusion 46, 1951-1958 61 Wen, L.B., Guo, X., Yang, H.C., (2005) Genotyping of porcine circovirus type from a variety of clinical conditions in China Vet Microbiol 110 (1-2), 141-146 62 Yunus M., T.1989, Scramble is on to solve mystery disease, Swine Pract (July), http://www.sciencedirect.com Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 60 ... lý chủ yếu lợn mắc PCV2 (Porcine Circovirus type 2) áp dụng phương pháp hóa mơ miễn dịch chẩn đoán bệnh? ?? Mục tiêu đề tài - Làm rõ triệu chứng lâm sàng, biến đổi bệnh lý đại thể vi thể lợn mắc. .. sàng chủ yếu lợn bị bệnh Porcine Circovirus type (PCV2) gây + Xác định bệnh tích đại thể chủ yếu lợn bị bệnh Porcine Circovirus type (PCV2) + Nghiên cứu bệnh tích vi thể số quan lợn bị bệnh Circovirus. .. bệnh Circovirus (PCV2) + Ứng dụng phương pháp Hóa mơ miễn dịch phát có mặt PCV2 số loại mơ lợn bệnh 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp điều tra xác định bệnh - Dựa vào số liệu theo