2.1. Đối tượng và nguyên liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Lợn sau cai sữa từ 4 đến 16 tuần tuổi nghi bị bệnh do Porcine circovirus type 2 (PCV2) tại một số trại ở Hải Phòng.
2.1.2. Nguyên liệu nghiên cứu
- Mẫu bệnh phẩm: gồm các loại mẫu lấy từ cơ thể lợn nhiễm hoặc nghi nhiễm PMWS bao gồm: máu, phổi, gan, thận, lách, hạch, ruột được thu tại địa điểm nghiên cứu.
- Dụng cụ, hóa chất + Dụng cụ
Ống nghiệm, lọ chứa formol 10%, dao, kéo, pank kẹp, cốc dựng hóa chất, phiến kính, lamen, máy đúc block, khuôn đúc, tủ ấm 560, tủ ấm 370, tủ lạnh, máy cắt mảnh microtom và một số dụng cụ khác liên quan.
+ Hóa chất
Nước cất, formol 10%, cồn, xylen, paraffin, dung dịch đệm PBS (photphat buffer salin), hóa chất phát màu DAB (3,3 Diamino benzidine tetrahydrochloride), H2O2 (hydro peroxyt).
Thuốc nhuộm: Eosin (nhuộm bào tương tế bào), Haematoxylin (nhuộm nhân tế bào).
Kháng thể kháng PCV2 chuẩn, kháng kháng thể tương ứng chẩn đoán PCV2. Muối NaHCO3 (natri bicacbonat)... và các hoá chất khác.
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
- Một số trại lợn tại Hải Phòng
- Bộ môn Bệnh lý – Khoa Thú y – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội
2.2. Nội dung nghiên cứu
+ Điều tra tình hình nhiễm Porcine Circovirus type 2( PCV2) + Xác định một số chỉ tiêu huyết học của lợn bệnh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23 + Xác định các triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn bị bệnh do Porcine Circovirus type 2 (PCV2) gây ra.
+ Xác định bệnh tích đại thể chủ yếu của lợn bị bệnh do Porcine Circovirus type 2 (PCV2).
+ Nghiên cứu bệnh tích vi thể một số cơ quan của lợn bị bệnh do Circovirus
(PCV2).
+ Ứng dụng phương pháp Hóa mô miễn dịch phát hiện sự có mặt của PCV2 trong một số loại mô của lợn bệnh
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp điều tra và xác định bệnh
- Dựa vào các số liệu theo dõi ghi chép trong thời gian thực tập
- Phương pháp quan sát: Đối với các triêu chứng lâm sàng, biến đổi bệnh lý đại thể.
- Phương pháp mổ khám toàn diện: Quá trình mổ khám được ghi chép lại và thực hiện theo quy trình nghiên cứu, để quan sát tổn thương đại thể và lấy mẫu bệnh phẩm.
- Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý vi thể : Để xác định được mức độ tổn thương ở mức độ vi thể của bệnh do PCV2 trên lợn.
2.3.2. Nghiên cứu các chỉ tiêu huyết học
- Chúng tôi tiến hành lấy máu lợn ở vị trí vịnh tĩnh mạch cổ. - Sử dụng máy đếm hồng cầu tựđộng CD – 3700.
- Nguyên lý: Máy sẽ tách riêng các dòng tế bào theo kích thước tế bào, có nhân hay không có nhân, theo hình dạng nhân... Đếm trên toàn bộống mẫu máu xét nghiệm mà không cần tách hay pha loãng mẫu.
- Chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số chỉ tiêu huyết học như sau: + Số lượng hồng cầu (RBC, triệu/µl), (1mm3= 1µl).
+ Hàm lượng huyết sắc tố ( HGB, g/l) + Tỷ khối huyết cầu (HCT, %)
+ Thể tích trung bình hồng cầu (MCV, fl)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24 + Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu (MCHC, g/l)
+ Số lượng bạch cầu (WBC, nghìn/µl) và công thức bạch cầu (%)
2.3.3. Phương pháp mổ khám
Lợn bệnh được cốđịnh trên bàn mổ hoặc khay mổ, mổ khám theo trình tự từ trên xuống dưới, bộc lộ tất cả các khí quan để quan sát, tìm ra những biến đổi bệnh tích đại thể.
2.3.4. Phương pháp làm tiêu bản vi thể
Phương pháp làm tiêu bản vi thể tẩm đúc bằng parafin theo Robert (1969) và Burn ( 1974). Chúng tôi sử dụng phương pháp làm tiêu bản đúc bằng parafin, nhuộm Hematoxylin- Eosin (HE).
Mỗi lợn bệnh chúng tôi tiến hành lấy mẫu ở mỗi cơ quan hai miếng bệnh phẩm rồi đúc thành hai block. Mỗi block chúng tôi tiến hành cắt, nhuộm tiêu bản rồi chọn ra 5 tiêu bản đẹp, sau đó tiến hành soi dưới kính hiển vi để đọc kết quả bệnh tích vi thể. Nếu block nào có 2 tiêu bản có bệnh tích trở lên thì chúng tôi coi là dương tính.
Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất: Lọ chứa formol 10%, dao, kéo, pank kẹp, cốc đựng hóa chất, phiến kính, máy đúc block, khuôn đúc, tủ ấm 37ºC, máy cắt mảnh microtom, nước ấm 48-52ºC, xylen, paraffin, thuốc nhuộm Hematoxylin, Eosin…
Lấy bệnh phẩm: dạ dày, ruột, tim, gan, thận, lách, hạch lympho…
Quy trình làm tiêu bản vi thể:
Cốđịnh bệnh phẩm: Ngâm miếng bệnh phẩm vào dung dịch formol 10% (chú ý thể tích formol phải gấp 10 lần bệnh phẩm và bệnh phẩm phải ngập trong formol).
- Khử formol
Sau khi cố định bệnh phẩm trong dung dịch formol 10% từ 7 – 10 ngày lấy bệnh phẩm ra khỏi bình formol 10%, cắt thành miếng có độ dày 4-5 mm rồi xâu thành một dây sao cho các miếng bệnh phẩm cách nhau 0,5 cm. Trên đầu dây có gắn một mẩu giấy ghi tên bệnh phẩm. Sau đó đem rửa nước chảy nhẹ tối thiểu 24 giờ.
- Khử nước
Bệnh phẩm sau khi khử formol thấm nhẹ trên giấy lọc, rồi cho qua hệ thống gồm 4 lọ cồn nhằm mục đích để khử nước ra khỏi mô.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25 Cồn I: 3 giờ Cồn II: 3 giờ Cồn III: 3 giờ Cồn IV: 12 giờ - Khử cồn
Lấy bệnh phẩm ra khỏi hệ thống cồn thấm nhẹ trên giấy lọc, rồi cho vào hệ thống 3 cốc đựng xylen.
Xylen I: 3 giờ Xylen II: 3 giờ Xylen III: 4 giờ Mục đích: khử hết cồn ra khỏi mô.
Yêu cầu: Khi nào miếng bệnh phẩm trong như cục thạch là được. Nếu để quá lâu tổ chức sẽ giòn, dễ vỡ và khó cắt.
- Khử xylen
Cho qua hệ thống paraffin đã ổn định ( paraffin có từ 3- 5% sáp ong đã nấu, đảo nhiều lần thành môi trường đồng nhất ổn định, đặc chắc, không lẫn tạp chất, không bọt), gồm 3 lọ.
Parafin I: 12 giờ trong tủấm 56ºC Parafin II: 3 giờ trong tủấm 56ºC Parafin III: 4 giờ trong tủấm 56ºC
Mục đích: để khử hết xylen trong mô. Trong mô chỉ còn paraffin thấm đều trong các kẽ mô bào.
Nếu nhiệt độ trên 56ºC thì miếng mô sẽ giòn và dễ vỡ, khó cắt.
- Đúc Block
+ Mục đích: Đưa bệnh phẩm vào trong khối parafin tạo thành một thể thống nhất. + Chuẩn bị: Máy đúc block, parafin.
+ Phương pháp tiến hành:
Đặt miếng bệnh phẩm nằm vào chính giữa khuôn block, đổ nhanh parafin lỏng vào khuôn block. Sau đó, đặt khuôn đã đúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block. Để nguội đến khi block đông cứng, đặc chắc là được.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26
- Cắt tãi mảnh
+ Chuẩn bị: Máy cắt, dao cắt, nước ấm 48- 52ºC, phiến kính, pank kẹp… + Cắt mảnh: Cắt bằng máy microtom với độ dày khoảng 3- 5µm, sao cho mảnh cắt không rách, nát phần mô.
+ Tãi mảnh: Dùng pank kẹp mảnh cắt đặt vào nước lạnh, dàn nhẹ sao cho mặt dưới của mảnh cắt ướt đều, lấy phiến kính hớt mảnh cắt cho sang nước ấm 48- 52ºC rồi vớt mảnh cắt sao cho vị trí mảnh cắt ở 1/3 phiến kính. Sau đó để ở tủ ấm