Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên cúm AH1N1, tinh chế và ứng dụng để đánh giá kháng thể ở động vật thí nghiệm

Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Long Từ viết tắt ADN Axit deoxyribonucleic ARN Axit ribonucleic BSA Albumin huyết thanh bò dH 2 O Nước khử ion HA Hemagglutinin HI Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu LB Lauria-Bertani mRNA ARN thông tin NA Neuraminidaza NP Nucleoprotein NST Nhiễm sắc thể OD Optical Density PBS Dung dịch đệm photphat PCR Polymerase Chain Reaction RNaza Ribonucleaza RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodecyl sulphate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamid gel electrophoresis ss RNA (-) RNA mạch đơn âm strep streptomicin v/p vòng/phút WHO Tổ chức Y tế Thế giới LỚP 0604 – KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 1 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Long MỞ ĐẦU Bệnh cúm A/H1N1 là bệnh nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính do chủng virus cúm A/H1N1 tái tổ hợp mới gây ra. Bệnh có khả năng lây nhiễm cao từ người sang người, có thể trở thành đại dịch và biến chứng hô hấp, gây tử vong. Hiện tại chưa có văcxin phòng chống. Cúm A/H1N1 lần đầu tiên được các cơ quan y tế phát hiện vào tháng 3 năm 2009. Sự bùng phát căn bệnh giống như bệnh cúm đã được phát hiện lần đầu ở 3 khu vực thuộc Mexico. Sau đó, nó tiếp tục lây lan ra rất nhiều nước trên thế giới ở các châu lục khác nhau. Tháng 6 năm 2009, Tổ chức y tế thế giới (WHO) đã chính thức công bố đại dịch cúm toàn cầu và nâng cấp báo động lến cấp 6 Tính từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2009, cũng theo Tổ chức Y tế Thế giới, đã có 29.669 trường hợp được xác định nhiễm cúm A/H1N1 tại 74 quốc gia. Bệnh cúm A/H1N1 xuất hiện ở Việt Nam lần đầu tiên vào ngày 30/05/2009, có nguy cơ lây lan trong cộng đồng và bùng phát thành đại dịch[7]. Để ngăn chặn dịch cúm, chúng ta phải có những biện pháp phát hiện bệnh, phòng chống hiệu quả và kịp thời, phương pháp hiệu quả nhất là sử dụng văcxin. Hiện nay việc nghiên cứu sản xuất văcxin đã và đang được Tổ chức Y tế thế giới khuyến khích và đã có bảng danh mục các loại văcxin do WHO khuyến cáo là có thể đưa vào ứng dụng. Sản xuất văcxin để phòng chống bệnh cúm A/H1N1 đang bước đầu được nghiên cứu tại Việt Nam. Ngoài ra, để đáp ứng nhu cầu phòng chống dịch ở thời điểm hiện tại, chúng ta còn phải nhập khẩu các loại văcxin từ nước ngoài. Vì vậy, việc kiểm tra và đánh giá văcxin bằng các kháng nguyên và kháng thể kháng virút cúm H1N1 chuẩn là hết sức quan trọng, mang tính cần thiết và cấp bách. Tuy nhiên hiện nay, các bộ sinh phẩm kháng nguyên, kháng thể chuẩn này đều phải nhập khẩu với giá thành rất cao. LỚP 0604 – KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 2 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Long Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài "Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên cúm A/H1N1, tinh chế và ứng dụng để đánh giá kháng thể ở động vật thí nghiệm“ để có thể tạo ra được những bộ sinh phẩm kháng nguyên, kháng thể đạt tiêu chuẩn với giá thành rẻ để phục vụ cho việc đánh giá chất lượng vacxin và nhiều mục đích khác. Đề tài được thực hiện tại Phòng Vi sinh vật học phân tử – Viện Công nghệ sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. LỚP 0604 – KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 3 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Long CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Bệnh cúm A/H1N1 1.1. Lịch sử Bệnh cúm A/H1N1 là bệnh nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính do virut cúm A/H1N1 gây nên. Bệnh có khả năng lây nhiễm cao và lây lan nhanh trong cộng đồng. Trong ba thế kỉ qua, cứ khoảng 30 đến 40 năm thế giới lại chứng kiến một đại dịch cúm. Trước khi có vắc-xin, mỗi đợt dịch giết chết hàng triệu người. Một vài chủng cúm virut H1N1 đã gây nên đại dịch ở người như năm 1918, đã có 100 triệu người chết trên toàn thế giới. Người bệnh tử vong rất nhanh chỉ sau vài ngày nhiễm bệnh và hơn nửa là người trẻ tuổi. Tuy nhiên cho tới nay vẫn còn 1 vài chủng H1N1 ít độc tính vẫn tồn tại và chúng gây nên các đợt cúm thường trên người và gây bệnh thành đại dịch trên lợn và 1 số loài chim[7, 8, 10, 11]. Lần đầu tiên vào năm 1918, người ta nhận thấy ở lợn mắc chứng bệnh mà triệu chứng giống như bệnh cúm ở người trong đại dịch cúm 1918. Do thương tổn thể hiện giống nhau nên bác sĩ Koen đã gọi tên bệnh mới này cho lợn là cúm (flu). Nhưng mãi đến năm 1930, các nhà khoa học mới phân lập được loại virut này trên lợn và xác nhận là dòng H1N1. Năm 1977 – 1978 vụ dịch do cúm A/ H1N1 gây ra tại Nga đã gây ảnh hưởng chủ yếu đến trẻ em và ngưởi trẻ tuổi, chủng gây bệnh tương tự chủng gây bệnh ở năm 1947-1957[7]. Chủng virut này đã được dùng để sản xuất vắc-xin. Đến năm 1933, virut dòng H1N1 của người cũng được phân lập. Giữa 2 dòng H1N1 trên lợn và người có phần rất giống nhau, vì vậy các nhà khoa học đưa ra giả thuyết rằng H1N1 gây bệnh ở lợn và người có thể có cùng 1 nguồn gốc. Đến năm 1974, các nhà khoa học mới phân lập được virut cúm của lợn ở người, ca bệnh đầu tiên ở Mỹ. Sau đó các xét nghiệm huyết thanh học ở người cũng cho thấy sự hiện diện của virut cúm H1N1, các điều tra dịch tễ học trên diện rộng về sau cho thấy mức độ vụ dịch lớn hay nhỏ tùy thuộc vào lượng kháng thể chống virut cúm H1N1 ở người cao hay thấp; ngoài ra LỚP 0604 – KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 4 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Long người ta cũng thấy có một mối liên quan giữa quy mô nuôi lợn với tỷ lệ bệnh cúm trong vùng đó và vì thế các nhà khoa học suy luận rằng chính virut cúm ở lợn có thể là nguồn lây bệnh dịch tiềm tàng cho con người. Từ nhóm virut H1N1 cổ đó, các đợt dịch sau này người ta còn phát hiện ra các dòng hỗn hợp và lai tạp khác của virut cúm như có thể tìm thấy H1N1 ở loài chim, H3N2 có nguồn gốc từ người và dạng tái kết hợp H1N2 giữa chủng H1N1 cổ ở lợn với H3N2 ở lợn (giống với H3N2 ở người). Năm 1990 người ta phân lập được ở các con lợn bị cúm là cùng H4N6 có nguồn gốc từ chim (được cách ly). Đến năm 1998 thì virut cúm lợn dạng tái hợp mới là H3N2 (lợn -người và chim- lợn -người) đã bắt đầu xuất hiện ở Mỹ. Như vậy đến nay các phân typ virut cúm A được biết đến là H1N1, H1N2, H3N1, H3N2 và H2N3. H1N1; H1N2 và H3N2 là 3 loại phổ biến nhất[7]. Qua đó chúng ta thấy rằng virut cúm A với sự biến đổi và truyền chéo giữa động vật và con người, cứ mỗi lần chuyển dạng kháng nguyên như vậy có khả năng gây ra dịch cúm lớn và có nguy cơ thành đại dịch. Ngày 11/6/2009 WHO tuyên bố đại dịch H1N1 mới toàn cầu. 29/11/2009 WHO công bố thế giới có 207 quốc gia và vùng lãnh thổ xác nhận có trường hợp nhiễm cúm A/H1N1 và có ít nhất 8768 người chết. Và đến tháng 1/2010 WHO đã xác nhận là 208 quốc gia và vùng lãnh thổ có trường hợp nhiễm cúm A/ H1N1 và có ít nhất 13554 người chết. Trong đại dịch cúm năm 2009, virut được phân lập từ bệnh nhân ở Hoa Kì được xây dựng nên bởi các yếu tố di truyền từ 4 loại cúm khác nhau: cúm lợn Bắc Mỹ; cúm gia cầm ở bắc Mỹ; cúm ở người và virut cúm lợn thưởng được tìm thấy ở Châu Âu và Châu á. Nó rất giống với sự kết hợp lại vật chất di truyền (reassortment) của cúm người và cúm lợn trong tất cả 4 chủng khác nhau của phân typ H1N1[7, 8]. 1.2. Tình hình dịch bệnh LỚP 0604 – KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 5 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Long 1.2.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới Đại dịch cúm A/H1N1 lần đầu tiên được các cơ quan y tế phát hiện vào tháng 3 năm 2009 ở Mexico. Sau đó bệnh dịch này bắt đầu lây lan rộng ra toàn thế giới. Ngày 28/4/2009, những ca nhiễm virút H1N1 đầu tiên tại châu Âu được xác nhận. Hai người Anh phải nhập viện, một người đàn ông Tây Ban Nha có kết quả dương tính với cúm lợn và 17 người khác bị nghi nhiễm. Ngoài Mexico, Anh và Tây Ban Nha, cũng đã có những trường hợp mắc bệnh được ghi nhận ở Mỹ và Canada. Các ca nghi nhiễm khác đang được điều tra tại Brasil, Israel, Úc và Tân Tây Lan[7]. Các bộ trưởng Y tế của các nước châu Âu gặp nhau vào ngày 30/4/2009 để bàn về đại dịch. Các quan chức khuyên người dân không nên du lịch đến những nơi bị nhiễm bệnh, đề phòng lây lan căn bệnh. Bộ trưởng Y tế Anh Alan Johnson cũng nói trong số 25 ca nghi nhiễm ở Anh, 8 người có kết quả âm tính, 3 người nữa chờ kết quả xét nghiệm và 14 người được theo dõi. Ngày 5/5/2009, Tổ chức Y tế Thế giới tính đến khả năng nâng mức báo động dịch cúm A H1N1 lên mức cao nhất. Tổ chức Y tế Thế giới sử dụng 6 mức báo động để đánh giá nguy cơ y tế đối với thế giới. Tính đến 00:00 ngày 5/5/2009, số ca mắc cúm A H1N1 đã vượt qua con số 1.000 ca tại 20 nước trên 5 châu lục[8]. Theo thông báo của Cục Y tế Dự phòng và Môi trường Bộ Y tế ngày 17 tháng 3 năm 2010 về tình hình dịch cúm A/H1N1, tính đến ngày 07/3/2010 trên toàn Thế giới có trên 213 quốc gia và vùng lãnh thổ ghi nhận bệnh nhân dương tính cúm A/H1N1, trong đó có 16.713 trường hợp tử vong (theo thông báo của Tổ chức y tế Thế giới - WHO)[8]. Tại khu vực nam bán cầu, một số nước ghi nhận số ca tử vong cao như: • Australia (186), • Chilê (136), • Argentina (585), LỚP 0604 – KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 6 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Long • Brazil (1.368), • Peru (162), • Colombia (118). Tại khu vực Châu Á, tình hình dịch tiếp tục diễn biến phức tạp: • Ấn Độ đã ghi nhận 430 trường hợp tử vong do cúm A(H1N1); • Nhật Bản (tử vong: 27); • Hàn Quốc (tử vong: 20); • Thái Lan (tử vong: 176). Một số nước đã ngừng thông báo các trường hợp tử vong do cúm A(H1N1) như: Philippine (tử vong: 28); Singapore (tử vong: 18); Malaysia (tử vong: 77); Indonesia (tử vong: 10)[7]. Hình1. Sơ đồ phân bố đại dịch cúm A/H1N1 trên thế giới 1.2.2.Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam Đại dịch cúm A/H1N1 được ghi nhận ở Việt Nam ngày 30/5/2009. Bệnh nhân đầu tiên là một sinh viên nam từ Mỹ trở về nước ngày 26/5/2009.Vào lúc 9 giờ, ngày 1 tháng 6 (giờ địa phương) đã phát hiện thêm 2 trường hợp nhiễm cúm; bệnh nhân là hai mẹ con từ Hoa Kỳ về Việt Nam, nâng số ca bị nhiễm H1N1 tại Việt Nam lên con số 3[8]. LỚP 0604 – KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 7 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Long Ngày 3/6/2009 ca nhiễm cúm đầu tiên của Việt Nam đã được xuất viện. Đến ngày 5/6 tại Việt Nam đã xác nhận thêm 2 ca nhiễm cúm, đây là 2 bệnh nhân mang quốc tịch Mỹ nâng số ca bị nhiễm cúm lên con số 5.Số ca nhiễm cúm tại Việt Nam đến ngày 6/6/2009 đã tăng lên con số 10.Con số ca nhiễm cúm tại Việt Nam tăng nhanh từng ngày, đế ngày 7/6/2009 số ca dương tính đã lên 13 ca và đến ngày 24/6 đã lên đến 32 ca[11]. Ngày 18/7/2009, ghi nhận 5 trường hợp đầu tiên tại 01 trường trung học củaTP. Hồ Chí Minh, dịch bắt đầu lây lan tại cộng đồng. Tiếp đó dịch nhanh chóng lan rộng ra các tỉnh, thành phố trên phạm vi cả nước. Tính đến 17h00 ngày 03/8/2009, Việt Nam đã ghi nhận 971 trường hợp dương tính, không có tử vong. Số bệnh nhân đã ra viện là 470; 501 trường hợp còn lại hiện đang được cách ly, điều trị tại các bệnh viện, cơ sở điều trị, giám sát cộng đồng trong tình trạng sức khỏe ổn định, không có biến chứng nặng. Đến ngày 22/10/2009, Việt Nam ghi nhận 10. 349 trường hợp dương tính với cúm A/H1N1. 27 trường hợp tử vong. Số khỏi ra viện: 9.941[8,11]. Các địa phương trong cả nước vận tiếp tục ghi nhận rải rác trường hợp nhiễm virus cúm A(H1N1), không ghi nhận các ổ dịch lớn trong cộng đồng. Theo Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương tính đến ngày 16/3/2010 cả nước đã ghi nhận 11.202 trường hợp dương tính cúm A(H1N1), trong đó có 58 trường hợp tử vong. 1.3. Dịch tễ học 1.3.1. Con đường lây nhiễm cúm A/H1N1 Đây là loại virut có thể lây lan từ người sang người nhưng hiện nay vẫn chưa rõ mức độ của sự lây lan dễ dàng như thế nào. Sự lan truyền của virut cúm A/H1N1 mới này gần giống sự lây lan của cúm mùa. Cúm lây lan từ người sang người thông qua ho và hắt hơi, sờ, cầm vào đồ vật có chứa virut LỚP 0604 – KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 8 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Long rồi đưa tay lên mũi, miêng, mắt. Cúm A/H1N1 là bệnh lây chủ yếu qua đường hô hấp nên cúm A/H1N1 không lây qua thực phẩm làm từ thịt lợn. Đôi khi mắc bệnh do tay bị dính chất tiết có virut sau đó đưa lên miệng, mũi. Khi một người bị nhiễm virut cúm thì khoảng 7 ngày sau sẽ có triệu chứng. Trẻ em, đặc biệt là trẻ nhỏ có thời gian phát bệnh lâu hơn. Một nghiên cứu mới tháng 12/2009 chi tiết về cúm H1N1 cho thấy đây là dịch bệnh nguy hiểm. Các nhà khoa học đã xác định được hình ảnh chi tiết của virut cúm H1N1 cũng như độc tính của nó. Khác với các virut cúm theo mùa thông thường chỉ tấn công các tế bào thuộc phần trên của hệ hô hấp, H1N1 có khả năng tấn công sâu vào các tế bào phổi, nó gây ra chứng viêm phổi và nguy hiểm hơn dẫn đến tử vong. Để đánh giá độc tính của virut H1N1 các nhà khoa học đã thử lây nhiễm virut này cùng 1 virut cúm mùa thông thường cho đàn chuột, chồn sương và động vật linh trưởng. Kết quả cho thấy virut H1N1 sao chép nhanh hơn nhiều trong hệ hô hấp so với virut cúm mùa và gây ra thương tổn nghiêm trọng cho phổi[3]. Virut cúm A/H1N1 tồn tại khá lâu ngoài môi trường, có thể sống từ 24-48 giờ trên các bề mặt như bàn, ghế, tủ,…, tồn tại trong quần áo từ 8-12 giờ và duy trì được 5 phút trong lòng bàn tay. Loại virut này đặc biệt sống lâu trong môi trường nước; có thể sống 4 ngày trong nước ở nhiệt độ khoảng 22 độ C và đến 30 ngày ở nhiệt độ 0 độ C[9,2]. Vì vậy thời điểm mùa đông là thời tiết thuận lợi cho virut phát triển. Người mang virut cúm A/H1N1 có khả năng truyền virut cho những người xung quanh trong thời gian 1 ngày trước tới 7 ngày sau, kể từ khi có triệu chứng của bệnh. Bệnh lây lan càng nhanh và càng mạnh khi có sự tiếp xúc với người bệnh, đặc biệt ở nơi tập trung đông người như trường học, nơi công cộng. LỚP 0604 – KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 9 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Long Hình 2: Mối quan hệ lây nhiễm virus cúm A 1.3.2. Triệu chứng bệnh Virut xâm nhập vào cơ thể bằng đường hô hấp. Khi virut cúm theo những hạt tế bào li ti của người bệnh truyền sang người lành qua đường hô hấp, nó sẽ chui vào bên trong tế bào biểu mô hô hấp và phát triển nhanh chóng gây xưng huyết, phù nề dọc cơ quan hô hấp từ mũi họng cho đến phế quản, lúc này các triệu chứng của bệnh cúm A/H1N1 ở người gần giống với bệnh cúm thường như cơ thể sốt nhẹ, ho, chảy nước mũi, ớn lạnh, hắt hơi. Thường sau khi nhiễm cúm khoảng 2-3 ngày người bệnh gần như bình thường. Đến thời kì phát bệnh, đột ngột xuất hiện sốt cao, có thể kèm theo rét run, nhức đầu, buồn nôn, đau mỏi toàn thân, người mệt mỏi. Sau đó một số bệnh nhân chuyển sang các triệu chứng nặng nề hơn như toàn thâm mệt mỏi, đau cơ, đau khớp dọc theo sống lưng, đau ngang thắt lưng, đau đầu kèm theo hoa mắt, chóng mặt, ù tai. Dấu hiệu nhiễm độc, nhiễm trùng rất rõ. Có nhiều dấu hiệu tổn thương đường hô hấp như viêm long đường hô hấp trên, ngạt tắc mũi, ho khan, mắt đỏ…Khoảng gần 50% bệnh nhân còn có đau bụng, buồn nôn hay tiêu chảy. Nhưng ở Việt nam có nhiều ca nhiễm virut cúm A/H1N1 nhưng không có một triệu chứng nào, chỉ khi xét nghiệm mới thấy. Vì vậy mà nguy cơ gây lây lan trong cộng đồng rất lớn. Khác với cúm A/H5N1 ở chỗ, LỚP 0604 – KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 10