Trong chương trình hợp tác giữa Trung tâm chẩn ựoán Thú Y trung ương và CDC từ năm 2003 Ờ 2008, CDC ựã chuyển giao cho chủng vi rút A/Anhui05-H5N1. Vi rút A/Anhui/05-H5N1 là chủng vi rút cúm gia cầm có ựộc lực cao ựược phân lập năm 2005. Vi rút ựã ựược xóa gen ựộc bằng công nghệ gen và lắp giáp nhân tạo bằng kỹ thuật di truyền. Tuy vi rút ựã mất tắnh ựộc nhưng vẫn giữ nguyên bản chất ựặc tắnh kháng nguyên.
Vi rút có khả năng thắch ứng nhân lên khi nuôi cấy trên phôi gà.
Giống vi rút cúm gia cầm A/Anhui/05-H5N1 ựược sử dụng làm giống gốc trong nghiên cứu chế kháng nguyên H5N1 sử dụng trong phản ứng xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng kháng nguyên H5.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 25
PHẦN III
NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung
3.1.1. Tiêm truyền xác ựịnh nồng ựộ pha loãng tốt nhất cho nhân giống vi rút cúm A/H5N1 rút cúm A/H5N1
3.1.2. đánh giá ựộ an toàn (tắnh không ựộc) của vi rút 3.1.3. Vô hoạt vi rút bằng formaldehyde. 3.1.3. Vô hoạt vi rút bằng formaldehyde.
3.1.4. đánh giá ựộ thuần khiết của sản phẩm kháng nguyên.
3.1.5. Kiểm tra tắnh sinh miễn dịch của sản phẩm kháng nguyên.
3.1.6. Kiểm tra ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu của chế phẩm kháng nguyên tự chế bằng phản ứng HI. chế bằng phản ứng HI.
3.1.7 So sánh ựánh giá ựộ nhạy của kháng nguyên tự chế với kháng nguyên của Anh bằng mẫu giám sát sau tiêm phòng lấy từ Hà Nội, Nam định và nguyên của Anh bằng mẫu giám sát sau tiêm phòng lấy từ Hà Nội, Nam định và Vĩnh Phúc.
3.1.8 Xác ựịnh thời gian bảo quản kháng nguyên tự chế.
3.2. Nguyên liệu
- Kháng nguyên do Anh sản xuất từ chủng vi rút A/Chicken/Scotland/59/H5N1, nhận từ phòng thắ nghiệm tham chiếu cúm gia cầm của Weibridge (Anh Quốc).
- Chủng vi rút A/Anhui/05-H5N1 nhận từ Centre for Disease Control- CDC(USA).
- Trứng gà có phôi 9-10 ngày tuổi.
- Kháng huyết thanh chuẩn H5N1 nhận từ phòng thắ nghiệm tham chiếu cúm gia cầm của Weibridge (Anh Quốc).
- Huyết thanh của gia cầm ựã ựược tiêm phòng vắc xin H5N1-Re1 và H5N1-Re5 ựược thu thập từ 3 tỉnh Hà Nội, Nam định và Vĩnh Phúc.
- Phầm mềm phân tắch các thông số dịch tễ - thống kê R, phiên bản 2.14.2 R Development Core Team (2012) và Bộ công thức tắnh toán các thông số dịch tễ - thống kê epiR, phiên bản 09.34 (Stevenson., 2012).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 26 - Môi trường, dụng cụ, hóa chất, nguyên liệu, phòng thắ nghiệm Trung Tâm Chẩn đoán Thú Y Trung Ương.
Kháng nguyên H5N1 INACTIVATED ANTIGEN A/CK/SCOT/59. - Kit Qiagen Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep chiết tách RNA. - Kit Invitrogen Superscript One-step RT-PCR và primer/probe ựể kiểm tra sự bài thải vi rút bằng phương pháp Real time PCR.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp tiêm truyền trên trứng ựể nhân giống vi rút (theo quy trình phân lập vi rút cúm gia cầm của CDC/WHO). trình phân lập vi rút cúm gia cầm của CDC/WHO).
- Tiêm truyền ổn ựịnh giống vi rút A/Anhui/05-H5N1 trên trứng gà có phôi 9-10 ngày tuổi. Quy trình này ựược lập ựi lập lại 3 lần nhằm chọn ra nồng ựộ và liều tiêm hợp lý.
*Phương pháp tiêm truyền:
- Giống vi rút ựược pha thành nhiều nồng ựộ (10-3 - 10-7). - Chọn trứng gà có phôi 9-10 ngày tuổi.
- Sát trùng vỏ trứng và ựục một lỗ trên buồng hơi.
- Tiêm truyền giống vi rút qua lỗ ựục vào xoang niệu mô với lượng 100 ộl/trứng ( Mỗi nồng ựộ tiêm 5 trứng)
- Gắn lỗ ựục bằng keo gắn vỏ trứng .
-Tiếp tục ấp trứng ở 370C tới 96giờ (với tiêu chuẩn phôi trứng không chết). Cất trứng ở +40C trong 4h. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Mở nắp trứng ở phắa buồng hơi, thu dịch niệu mô từ trứng ựã nhiễm, chuẩn ựộ HA (phản ứng ngưng kết hồng cầu gà), lựa chọn nồng ựộ có hiệu giá HA cao nhất. Tiếp tục sử dụng nồng ựộ vi rút cho hiệu giá HA cao nhất tiêm tiếp trên trứng gà có phôi.
- Thu dịch niệu mô từ trứng ựã nhiễm, chuẩn ựộ HA (phản ứng ngưng kết hồng cầu gà) lựa chọn nồng ựộ có hiệu giá HA cao nhất (8log2).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 27 - Tiếp tục sử dụng nồng ựộ vi rút có hiệu giá HA cao nhất nêu trên ựể tiêm tiếp trên trứng gà có phôi, thu hoạch dịch niêu mô và kiểm tra hiệu giá vi rút bằng phản ứng HA.
3.3.2. Phương pháp tiêm truyền cho gà ựể ựánh giá ựộ an toàn (tắnh không ựộc) của vi rút ựối với gà (theo hướng dẫn của USDA) ựộc) của vi rút ựối với gà (theo hướng dẫn của USDA)
- Sau mỗi lần tiêm truyền phôi trứng gà, thu hoạch dịch niệu mô và tiêm cho gà khỏe (0,5-1 ml) và kiểm tra ựộ an toàn ựối với gà (không có bệnh lý lâm sàng và không chết).
- Lấy dịch ổ nhớp vào thời ựiểm 3 ngày và 10 ngày sau khi nhiễm ựể kiểm tra sự bài bải thải vi rút.
3.3.3. Phương pháp vô hoạt vi rút bằng formaldehyde
- Giống vi rút sau khi ựược nhân lên và thu hoạch, sẽ ựược vô hoạt ựảm bảo các ựiều kiện về tắnh an toàn, vi rút tiếp tục ựược vô hoạt bằng formaldehyde với các tỷ lệ 1%, 10/00 và 10/000. Mục ựắch của thắ nghiệm này là ựể chọn ra nồng ựộ formaldehyde thắch hợp dùng ựể vô hoạt vi rút.
- Kiểm tra tắnh vô hoạt của vi rút bằng cách tiêm cho phôi gà 9-10 ngày tuổi. Tiêu chuẩn ựánh giá là phôi gà phát triển bình thường, sau ựó dịch niệu mô ựược kiểm tra bằng phản ứng HA với kết quả âm tắnh.
3.3.4. Phương pháp kiểm tra vô trùng ựối với sản phẩm kháng nguyên (theo quy trình kiểm nghiệm thông thường) quy trình kiểm nghiệm thông thường)
Thu hoạch kháng nguyên H5N1 A/Anhui/05-H5N1 sau khi ựạt yêu cầu vô hoạt. Mỗi loại kháng nguyên ựược tiếp tục kiểm tra vô trùng trên các môi trường thạch máu, nước thịt, yếm khắ và môi trường nấm theo quy trình kiểm nghiệm thông thường. Tiêu chuẩn là không có vi khuẩn/nấm phát triển trên các môi trường kiểm tra.
* Phương pháp kiểm tra tắnh an toàn:
độ vô trùng của kháng nguyên ựược xác ựịnh bằng cách kiểm tra tạp khuẩn. Kháng nguyên ựược kiểm tra trên các môi trường cơ bản theo ựúng quy
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 28 trình kiểm tra ựộ vô trùng ựối với theo quy chuẩn của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. Nuôi cấy trên các loại môi trường cơ bản: thạch nấm, thạch máu, nước thịt và thịt yếm khắ. Mỗi loại môi trường gồm 2 ống. Sau khi cấy, toàn bộ các ống môi trường kiểm tra ựược ủ ở nhiệt ựộ 370C và ựược theo dõi trong 7 ngày; riêng môi trường thạch nấm ựể ở nhiệt ựộ phòng. đến cuối quá trình theo dõi mà tất cả các ống thử ựều trong suốt, màu sắc môi trường không ựổi, kết quả là âm tắnh. Nếu có một trong các ống thử có biểu hiện nhiễm trùng thì phải tiến hành ựồng thời kiểm tra lại lần 2 với số mẫu như trên. Nếu lần 2 âm tắnh thì mẫu ựược coi là âm tắnh. Nếu lần 2 cũng dương tắnh và cùng loại tạp khuẩn như lần 1 thì mẫu ựó ựược coi là dương tắnh. Loạt kháng nguyên kiểm tra phải loại bỏ. Nếu lần 2 dương tắnh nhưng với loại tạp khuẩn khác thì phải tiến hành thêm lần 3 với cách thức như trên.
3.3.5. Kiểm tra tắnh sinh miễn dịch của sản phẩm kháng nguyên.
Sử dụng phương pháp HA, HI ựể kiểm tra tắnh sinh miễn dịch bằng cách ựánh giá kháng thể. Kiểm tra kháng thể ựược thực hiện theo quy trình chẩn ựoán bệnh Cúm gia cầm của Cục Thú y.
Phát hiện kháng thể và xác ựịnh hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu-HI.
* Phương pháp HI
Huyết thanh kiểm tra: huyết thanh gà không cần xử lý bằng RDE, huyết thanh vịt, ngan có thể xử lý bằng RDE ựể chống hiện tượng ức chế ngưng kết không ựặc hiệu và xử lý hồng cầu ựể chống hiện tượng ngưng kết hồng cầu giả.
a. Chuẩn bị kháng nguyên-phản ứng ngưng kết hồng cầu HA xác ựịnh
hiệu giá kháng nguyên.
Pha kháng nguyên 4 HA/25ộl. Tắnh lượng kháng nguyên cần dùng cho số mẫu huyết thanh ựể ựảm bảo lượng kháng nguyên dùng cho phản ứng.
Chuẩn ựộ kháng nguyên 4HA: sau khi pha, kháng nguyên 4HA phải ựược chuẩn ựộ lại.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 29 Tiến hành:
- Nhỏ 25ộl PBS 0,01M vào ựĩa 96 giếng chữ V từ giếng 1 ựến giếng 6 của mỗi hàng.
- Cho 25ộl kháng nguyên 4HA vào giếng thứ 1.
- Pha loãng kháng nguyên bằng cách chuyển 25ộl kháng nguyên 4HA từ giếng thứ 1 sang giếng thứ 2 và tuần tự ựến giếng 5 thì bỏ ựi 25ộl.
- Nhỏ thêm 25ộl PBS vào các giếng.
- Nhỏ 25ộl hồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng trên. - Lắc ựĩa bằng máy.
- Ủ ựĩa phản ứng ở nhiệt ựộ phòng khoảng 40 phút. Pha chuẩn: kết quả ngưng kết xảy ra ở 2 giếng ựầu. Pha không chuẩn: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Kháng nguyên ựặc: nếu ngưng kết ựến giếng thứ 3 tức là thừa kháng nguyên. Như vậy kháng nguyên 8HA phải ựược pha loãng ựể có ngưng kết ựến giếng thứ 2.
- Kháng nguyên loãng: nếu ngưng kết ựến giếng thứ 1 tức là thiếu kháng nguyên, có thể thêm một lượng kháng nguyên (bằng với lượng kháng nguyên pha ban ựầu) ựể có ngưng kết ựến giếng thứ 2.
b. Tiến hành phản ứng HI:
Trên 1 ựĩa có thể tiến hành phản ứng HI với nhiều kháng huyết thanh của các subtype khác nhau.
- Nhỏ 25ộl PBS vào các giếng của ựĩa 96 giếng. - Nhỏ tiếp 25ộl kháng huyết thanh vào giếng ựầu tiên.
- Pha loãng kháng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cách chuyển 25ộl kháng huyết thanh từ giếng 1 sang giếng 2 và tuần tự ựến giếng 11 và bỏ ựi 25ộl cuối cùng.
- Nhỏ 25ộl kháng nguyên 4HA ựã chuẩn bị vào các giếng từ giếng 1-11. Thêm 25ộl vào hàng ựối chứng hồng cầu (giếng 12).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 30 - Lắc ựĩa và ủ ở nhiệt ựộ phòng 30 phút.
- Nhỏ 25ộl dung dịch hồng cầu vào tất cả các giếng của ựĩa, lắc ựều.
c. đọc kết quả:
- Phản ứng dương tắnh: hồng cầu lắng xuống ựáy.
Hiệu giá HI của mẫu ựược tắnh ở ựộ pha loãng huyết thanh cao nhất còn có hiện tượng ức chế ngưng kết hồng cầu. Huyết thanh ựược coi là dương tắnh khi có hiệu giá huyết thanh ≥1/16. Huyết thanh ựối chứng âm tắnh phải có hiệu giá ≤1/4.
- Phản ứng âm tắnh: hồng cầu bị ngưng kết.
Chú ý: khi kiểm tra huyết thanh các loài khác không phải là gà nên có 1 giếng chỉ có huyết thanh và hồng cầu ựể kiểm tra hiện tượng ngưng kết hồng cầu không ựặc hiệu. Nếu phát hiện thấy có ngưng kết hồng cầu không ựặc hiệu xảy ra với mẫu huyết thanh nào cần xử lý lại mẫu huyết thanh ựó và kiểm tra lại bằng phản ứng HI.
Tương tự, phương pháp Real time PCR ựể kiểm tra vi rút H5N1 bài thải ựược thực hiện theo quy trình chẩn ựoán bệnh Cúm gia cầm của Cục Thú y.
*Phương pháp Real time PCR
Chiết tách RNA bằng kit Qiagen Rneasy Extraction
- Cho 600ộl dung môi RLT ựã bổ sung 1% β-ME vào ống 1,5ml. - Chuyển 200ộl mẫu sang ống 1,5ml.
- Lắc ựều trong 15 giây và ly tâm nhanh.
- Cho 400ộl cồn ETOH 100% (cồn tuyệt ựối), lắc mạnh bằng Votex trong 15 giây.
- đặt ống cột lọc và hệ thống hút chân không. - Chuyển tất cả dung dịch mẫu sang cột lọc.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31 - Rửa lần 2: Cho 500ộl dung môi RPE vào cột lọc và bật máy hút, cho tiếp 500 ộl dung môi RPE vào cột lọc và bật máy hút.
- đặt cột lọc vào ống thu mới (collection tube). - Ly tâm cột lọc trong 2 phút ở tốc ựộ 14.000rpm. - Thu RNA: chuyển cột lọc sang ống 1,5ml mới.
- Cho 50ộl RNase free H2O vào cột lọc. Ủ ở nhiệt ựộ phòng 1 phút. - Ly tâm trong 1 phút ở tốc ựộ 10.000rpm.
- Chuyển mẫu RNA ựã thu sang ống 1,5ml mới.
- Cất giữ RNA ở 40C trong vài giờ nếu sử dụng ngay. Cất giữ ở nhiệt ựộ - 200C nếu chưa dùng ngay trong ngày.
Tiến hành phản ứng Real time PCR a. Khái quát Real time PCR
Real time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA ựắch trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa quang vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch ựại trong ống phản ứng ựược hiển thị cùng lúc với phản ứng khuyếch ựại xảy ra ựể có thể ựọc ựược sau mỗi chu kỳ nhiệt.
Sự phát hiện sản phẩm PCR sẽ dựa vào cường ựộ huỳnh quang của bình phản ứng. Hàm lượng chất phát huỳnh quang sẽ tăng dần theo chu kỳ nhiệt và tỷ lệ thuận với sản phẩm ựược nhân bản. Cường ựộ phát huỳnh phụ thuộc vào hàm lượng chất phát huỳnh quang (Phạm Hùng Vân, 2008).
Phương pháp Real time PCR ựịnh lượng khắc phục ựược một số hạn chế của PCR cổ ựiển như: ựộ ựặc hiệu và nhạy cảm cao hơn, thời gian phát hiện kết quả phản ứng ngắn, không cần chạy ựiện di kiểm tra sản phẩm PCR, có thể ựịnh lượng chắnh xác ựược sản phẩm PCR, trong khi sử dụng PCR cổ ựiển việc phân biệt dựa vào ựộ lớn của vạch thu ựược sau ựiện di. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương pháp Real time PCR là kỹ thuật ựể phát hiện với vi rút có nhân là RNA, như vi rút cúm H5N1. Phản ứng cần qua bước phiên mã ngược
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32 (Reverse transcription) ựể chuyển RNA của vi rút thành DNA, làm khuôn mẫu cho quá trình PCR.
b. Nguyên liệu phương pháp Real time PCR.
Dùng cho xác ựịnh lượng vi rút cúm H5N1. - Khuôn RNA là ựoạn cần nhân bản.
- Nước cất vô trùng (Rnase-free).
- RNA ựối chứng dương tắnh M, H5, H7 của vi rút cúm H5N1. - Hai ựoạn mồi oligonucleotit (primer), và probe (mẫu dò). - Enzym DNA polymerase chịu nhiệt.
- Các nucleotit tự do: dATP, dGTP, dCTP, dTTP. - Dung dịch ựệm, Mg2+...
c. Thực hiện kỹ thuật Real time PCR:
Phải thực hiện trong ựiều kiện sạch sẽ gồm có buồng cấy vô trùng, tủ âm, các dụng cụ và khu vực nhân gen. Không ựược ựể các chất có RNA vào khu vực làm thắ nghiệm và phải luôn thay găng tay trước khi vào làm thao tác thắ nghiệm .
- Trong buồng vô trùng, chuẩn bị hỗn hợp nhân gen (master mix) với các thành phần ựủ dùng cho số lượng mẫu cần xét nghiệm.
- Phản ứng Real time PCR ựược tiến hành với những thành phần sau cùng với cặp mồi và chu kỳ thắch hợp.
- Công thức pha hỗn hợp nhân gen cho Real time PCR (Invitrogen Superscript One-step RT-PCR) :
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33 H2O 5.5ộl 2X Reaction mix 12.5ộl Primer forward 0.5ộl Primer reverse 0.5ộl Probe 1.5ộl Enzym Taq Polymerase 0.5ộl
- Chuyển Master mix sang buồng cho mẫu RNA và cho hỗn dịch phản ứng (20ộl) vào ống Smart Cycler.
- Cho 5ộl mẫu RNA vào ống Smart Cycler. đóng nắp ống, số ống phản ứng tương ứng với với mẫu xét nghiệm.
- Cho 5ộl RNA ựối chứng dương vào ống ựối chứng dương tắnh và 5ộl nước sạch RNase vào ống ựối chứng âm tắnh.
- đặt ống phản ứng vào máy chu kỳ nhiệt và chọn chương trình chạy PCR, bắt ựầu chạy, nhập ký hiệu mẫu kiểm tra cùng với mẫu ựối chứng dương tắnh,