nhất cho nhân giống vi rút
Vi rút A/Anhui/05-H5N1 ựược cung cấp bởi CDC, ựây là chủng vi rút cúm gia cầm có ựộc lực cao ựược phân lập năm 2005. Vi rút ựã ựược xóa gen ựộc bằng công nghệ gen và lắp giáp nhân tạo bằng kỹ thuật di truyền. Tuy vi rút ựã mất tắnh ựộc nhưng vẫn giữ nguyên bản chất ựặc tắnh kháng nguyên. Vi rút có khả năng thắch ứng nhân lên khi nuôi cấy trên phôi gà.
Giống vi rút cúm gia cầm A/Anhui/05-H5N1 ựược sử dụng làm giống gốc trong nghiên cứu chế kháng nguyên H5N1 sử dụng trong phản ứng xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng kháng nguyên H5.
để chọn ựược nồng ựộ pha loãng thắch hợp cho giống vi rút chúng tôi ựã tiến hành pha loãng giống vi rút cúm gia cầm A/Anhui/05-H5N1 thành nhiều nồng ựộ từ 10-3 - 10-7, sau ựó huyễn dịch vi rút ở các nồng ựộ này ựược tiêm vào xoang niệu mô của trứng gà có phôi 9-10 ngày tuổi, với liều 0.1ml/phôi, sử dụng 5 phôi cho mỗi nồng ựộ pha loãng.
Phôi trứng ựược ấp tiếp tục ựến 96 giờ, với tiêu chuẩn phôi trứng không chết. Mục tiêu của thắ nghiệm này là ựể chọn ra nồng ựộ pha loãng thắch hợp dùng tiêm cho phôi ựể nhân lên ựược lượng vi rút nhiều nhất hay nói cách khác là thu họach ựược huyễn dịch vi rút cho kết quả HA cao nhất. Hỗn dịch vi rút này sẽ sử dụng cho giống vi rút ựể chế kháng nguyên. Kết quả sau 3 lần thử nghiệm ựã xác ựịnh nồng ựộ pha loãng thắch hợp ựược trình bày trên bảng 4.1.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 38
Bảng 4.1: Kết quả nhân giống vi rút H5N1 A/Anhui/05-H5N1 Nồng ựộ pha loãng vi rút Giống vi rút Hiệu giá HA (log2) 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 trước tiêm 2 1 (-) (-) (-) (-) A/Anhui/05- H5N1 (lần 1) sau tiêm 5 8 6 6 6 (-) trước tiêm 2 1 (-) (-) (-) (-) A/Anhui/05- H5N1 (lần 2) sau tiêm 5 8 6 6 6 (-) trước tiêm 2 1 (-) (-) (-) (-) A/Anhui/05- H5N1 (lần 3) sau tiêm 5 8 6 6 6 (-) [ * (-) Âm tắnh Từ bảng 4.1 cho thấy:
Lần thử nghiệm 1. Trước khi tiêm ựể gây nhiễm, ở nồng ựộ pha loãng 10-3 ,10-4 cho hiệu giá 2log2 và 1log2 còn các nồng ựộ khác cho kết quả HA âm tắnh.
Sau khi tiêm ựể gây nhiễm ở nồng ựộ pha loãng vi rút 10-3 hiệu giá HA là 5log2, ở nồng ựộ 10-4 hiệu giá HA 8log2, ở các nồng ựộ (10-5, 10-6, 10-7 ) cho hiệu giá 6 log2, ở nồng ựộ 10-8 cho kết quả âm tắnh.
Lần thử nghiệm 2,3 cho kết quả tương tự như lần thử nghiệm 1.
Như vậy ta thấy, ở nồng ựộ pha loãng 10-4, giống vi rút A/Anhui/05-H5N1 ựược nhân lên với hàm lượng tối ưu, thể hiện bằng hiệu giá HA cao nhất 8 log2. Với các nồng ựộ thấp hơn hoặc cao hơn, lượng vi rút thu ựược trong dịch niệu mô ựều thấp hơn lượng vi rút thu ựược khi tiêm trứng với nồng ựộ 10-4 .
Giống vi rút A/Anhui/05-H5N1 ựã ựược CDC thử nghiệm tắnh ổn ựịnh. Tuy nhiên, khi nghiên cứu ựể sản xuất kháng nguyên cúm tại Việt Nam chúng tôi
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 39 vẫn kiểm tra lại tắnh ổn ựịnh của giống vi rút này với mục ựắch xác ựịnh giống vi rút không thay ựổi ựộc lực và tắnh kháng nguyên.
Sử dụng vi rút pha loãng ở nồng ựộ 10-4 ựể xác ựịnh tắnh ổn ựịnh của vi rút qua các lần tiêm truyền. Kiểm tra lại hiệu giá HA của nồng ựộ này. Mục ựắch ựể xác ựịnh vi rút giống gốc không thay ựổi ựộc lực và tắnh kháng nguyên qua 5 ựời nhân giống.
Xác ựịnh tắnh ổn ựịnh của vi rút chúng tôi tiến hành theo sơ ựồ 4.1.sau:
Huyễn dịch Vi rút
Nồng ựộ 10-4
Thu nước niệu
Thu nước niệu
Thu nước niệu
Tiêm phôi trứng 1: Kiểm tra HA: 8log2
Tiêm phôi trứng 2,3,4: Kiểm tra HA: 8log2
Tiêm phôi trứng 5: Kiểm tra HA: 8log2
Huyễn dịch Vi rút Huyễn dịch Vi rút
Nồng ựộ 10-4
Thu nước niệu
Thu nước niệu
Thu nước niệu
Tiêm phôi trứng 1: Kiểm tra HA: 8log2
Tiêm phôi trứng 2,3,4: Kiểm tra HA: 8log2
Tiêm phôi trứng 5: Kiểm tra HA: 8log2
Huyễn dịch Vi rút Huyễn dịch Vi rút
Nồng ựộ 10-4
Thu nước niệu
Thu nước niệu
Thu nước niệu
Tiêm phôi trứng 1: Kiểm tra HA: 8log2
Tiêm phôi trứng 2,3,4: Kiểm tra HA: 8log2
Tiêm phôi trứng 5: Kiểm tra HA: 8log2
Huyễn dịch Vi rút
Như vậy giống vi rút A/Anhui/05 Ờ H5N1 ựảm bảo ổn ựịnh ựể nghiên cứu sản xuất kháng nguyên Cúm A H5N1
Từ các kết quả trên, chúng tôi thấy rằng vi rút giống gốc rút A/Anhui/05- H5N1 ựủ ựiều kiện về tắnh ổn ựịnh ựể nghiên cứu sản xuất kháng nguyên cúm A/H5N1 và nồng ựộ pha loãng tốt nhất cho nhân giống vi rút là 10-4