để phát hiện chắnh xác sự có mặt của virus Care trong tổ chức, mức ựộ tập trung của virus trong các cơ quan ựể phục vụ cho bước phân lập virus, tôi tiến hành phương pháp miễn dịch huỳnh quang (IF)
Phương pháp miễn dịch huỳnh quang có ựộ chắnh xác cao cho phép phát hiện kháng nguyên tồn tại trong tổ chức. Phương pháp này thực hiện dựa vào sự kết hợp giữa kháng thể ựặc hiệu và kháng kháng thể ựã ựược gắn chất phát huỳnh quang với kháng nguyên cần chẩn ựoán. Nếu có phức hợp kháng nguyên với kháng thể thì khi soi dưới kắnh hiển vi huỳnh quang sẽ phát sáng màu xanh lý mạ (do dùng Fluoredcent Isothiocynat).
Trong phản ứng miễn dịch huỳnh quang dùng kháng thể ựặc hiệu nhuộm chất phát huỳnh quang ựể phát hiện kháng nguyên chưa biết
* Chuẩn bị:
- EDTA- PBS 1x có pH= 8,0: (EDTA PBS 10x pha trong PBS 1x )
Tổchức
Máyựúc
Máycắt
Nhuộm HE đọckếtquả
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
- Kắnh hiển vi huỳnh quang, tủ ấm, máy chụp ảnh,Ầ - Giấy lau, pipet, bôcan, hộp tối ựể cho tiêu bản vào lúc ủ,Ầ
- PBS tween 0,01% (1lắt) 0,1ml dung dịch gốc tween 20/1000ml PBS 1x - BSA 1% (bột BSA pha trong PBS 1x)
- Kháng thể gắn Fluorescent Isothicocynat (Dako-Denmark)
Hình 5. Kháng kháng thể có gắn chất phát huỳnh quang
Hình 6. Kắnh hiển vi huỳnh quang
* Tiến hành
+ Lấy bệnh phẩm cần chẩn ựoán, làm thành tiêu bản + Khử parafin: ngâm vào hóa chất dưới ựây
Xylen I 1 ngày
Xylen II 3 ngày
Xylen III 3 ngày
Cồn 100o 10 phút
Cồn 90o 10 phút
Cồn 80o 10 phút
Rửa nước cất hai lần mỗi lần 15 giây
+ Ngâm ngập tiêu bản trong dung dịch EDTA Ờ PBS có pH= 8,0
+ đun sôi EDTA pH = 8,0: lấy bô can ựựng EDTA-PBS cùng với tiêu bản trong lò vi sóng ựun sôi khoảng 15 phút.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
+ Ủ trong hộp 37oC/ 2 giờ + Lau khô xung quanh tiêu bản
+ Nhỏ kháng thể vào tiêu bản, ựặt tiêu bản vào hộp và ủ trong tủ ấm 37oC/ 1giờ
+ Nhúng nhanh tiêu bản vào dung dịch PBS tween 0,01% 3 - 4 lần + Lau khô xung quanh tiêu bản và nhỏ Fluoerescent Isothiocynat vào tiêu bản (khi nhỏ chất huỳnh quang thì nhỏ trong ựiều kiện bóng tối, vậy nhỏ xong ựưa vào hộp luôn)
+ để trong hộp ủ trong tủ ấm 370C/1giờ 30 phút, rửa nước nhanh. + Quan sát với kắnh hiển vi huỳnh quang (ánh sáng tia tử ngoại). + đọc kết quả (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phản ứng dương tắnh: có hiện tượng phát sáng màu xanh lá mạ do sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể ựã gắn chất phát huỳnh quang. Phản ứng âm tắnh thì không có hiện tượng phát sáng.