Sau khi có ựược những kết luận sơ bộ về triệu chứng lâm sàng, biến ựổi bệnh lý ựại thể và vi thể của chó nghi mắc bệnh Care, chúng tôi tiếp tục tiến hành phương pháp miễn dịch huỳnh quang ựể xác ựịnh chắc chắn sự có mặt của virus Care trong các mẫu bệnh phẩm thu ựược từ 20 chó nghi mắc bệnh.
Dựa theo các nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Lan và cs (2010) về sự tập trung phân bố của virus trong cơ thể chó nghi mắc bệnh Care và do số lượng mẫu lớn nên trong nghiên cứu này chúng tôi quyết ựịnh chọn ra 3 cơ quan (phổi, ruột, hạch lympho) ựể chẩn ựoán bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang. Với mỗi cơ quan, chúng tôi chọn lấy chỗ tổn thương ựại thể ựiển hình nhất ựể tiến hành phương pháp miễn dịch huỳnh quang. Mẫu ựược xác ựịnh là dương tắnh với virus Care khi có sự xuất hiện màu của thuốc nhuộm huỳnh quang (màu xanh lá mạ) trên lát cắt tổ chức; kết quả âm tắnh sẽ không có màu thuốc nhuộm phát huỳnh quang như trên. Như vậy dựa vào sự xuất hiện màu xanh lá mạ chúng tôi có thể ựánh giá ựược vị trắ cư trú của virus và mật ựộ virus phân bố tại cơ quan ựó. Với mỗi lô thắ nghiệm phương pháp miễn dịch huỳnh quang chúng tôi có ựối chứng âm (lát cắt tổ chức của chó khỏe mạnh không mắc bệnh Care).
để khẳng ựịnh lại kết quả sau khi tiến hành chẩn ựoán bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang, chúng tôi tiến hành phản ứng RT-PCR ựể so sánh với kết quả chẩn ựoán bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang với cặp mồi ựặc hiệu cho virus Care. Mẫu dương tắnh với virus Care khi giếng chứa mẫu ựiện di xuất hiện vạch DNA tương ứng với ựộ dài ựoạn gen nhân lên (429bp). Mẫu âm tắnh khi không xuất hiện vạch DNA tương ứng với ựộ dài ựoạn gen khuếch ựại mong ựợi. Kết quả ựược thể hiện ở bảng 4.5 và hình 35.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 47
Bảng 4.5. Kết quả chẩn ựoán bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang và RT-PCR
Kết quả phản ứng miễn dịch huỳnh quang
Kết quả phản ứng RT-PCR Cơ quan Số mẫu chẩn ựoán Số mẫu dương tắnh Tỷ lệ dương tắnh (%) Số mẫu dương tắnh Tỷ lệ dương tắnh (%) Phổi 20 16 80 16 80 Hạch lympho 20 20 100 20 100 Ruột 20 16 80 16 80
Qua kết quả chẩn ựoán các chó nghi mắc bệnh Care bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang ựã khẳng ựịnh sự có mặt của virus Care trong 20 con chó nghi mắc bệnh và cũng cho thấy mức ựộ dương tắnh ở các cơ quan khác nhau là khác nhau trong ựó hạch cho tỷ lệ dương tắnh là 100% tiếp ựến là phổi và ruột với tỷ lệ 80%. Từ kết quả trên cho thấy các cơ quan ựược chọn cho kết quả dương tắnh cao với tỷ lệ là 80% - 100% và có thể áp dụng phương pháp miễn dịch huỳnh quang ựể chẩn ựoán bệnh Care trên chó bằng các cơ quan trên.
Từ bảng 4.5 cho thấy cả hai phương pháp RT-PCR và miễn dịch huỳnh quang ựều có thể giúp chẩn ựoán CDV tốt trong phòng thắ nghiệm. Do có những ưu nhược ựiểm khác nhau, nên tùy thuộc vào ựiều kiện trang thiết bị và mục ựắch, yêu cầu mà người làm công tác chẩn ựoán có thể lựa chọn phương pháp cho phù hợp. Với kỹ thuật RT-PCR, người thực hiện có thể chẩn ựoán nhanh sự có mặt của virus khi con vật còn sống từ các mẫu swab (miếng gạc),
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 48
phân, nước tiểu, dịch tiết khác. đặc biệt, RT-PCR là kỹ thuật cần thiết ựể thực hiện các nghiên cứu tiếp theo về giải trình tự gen virus, phân loại virus và xác ựịnh sự biến hóa, biến ựổi virus thông qua việc xây dựng cây sinh học phân tử. Trong khi ựó, tại những nơi còn hạn chế về trang thiết bị nghiên cứu, ựiều kiện bảo quản mẫu như nhiều phòng thắ nghiệm của các chi cục thú y, công ty thuốc thú y, chăn nuôi, thủy sản hiện nay, mẫu sau khi ựược bảo quản ựơn giản bằng dung dịch formol có thể ựược dùng xác ựịnh sự có mặt và vị trắ quân bố của virus trong cơ thể chó bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang. đây là một ưu ựiểm lớn của miễn dịch huỳnh quang áp dụng trong các nghiên cứu phân lập virus sau này bởi xác ựịnh ựược vị trắ phân bố của virus sẽ giúp việc chọn mẫu ựể phân lập virus ựược chắnh xác, hiệu quả hơn. Kết quả cũng chỉ ra bước chẩn ựoán dựa trên các triệu chứng lâm sàng là cần thiết phục vụ tốt hơn cho công tác chẩn ựoán bệnh.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 49
MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA KẾT QUẢ PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG
Hình 29. CDV tập trung nhiều ở vách phế quản của chó mắc CDV (IF x 10)
Hình 30. Hình ảnh phế quản phổi của chó âm tắnh với phản ứng IF
10X (không chứa virus Care)
Hình 31. CDV phân bố nhiều trên tế bào vách phế nang (IF x 40) ở chó
mắc bệnh Care
Hình 32. CDV phân bố ở vách phế nang (vị trắ có màu xanh lá mạ) (IF x 10) của chó mắc bệnh Care
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 50
Hình 33. CDV phân bố ở vách phế nang của chó mắc bệnh Care (IF x 20)
Hình 34. CDV phân bố ắt ở hạch lympho của chó mắc bệnh Care (IF x 10)
Ghi chú: Thang chuẩn DNA M 100bp. Giếng từ 1-10 là mẫu chó nghi mắc bệnh Care, giếng 11 là ựối chứng dương là virus vacxin, giếng 12 là ựối
chứng âm là nước khử ion.
Hình 35. Kết quả chẩn ựoán chó mắc Care bằng phản ứng RT-PCR