ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI ĐỂ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VÀ CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA SIÊU VI VIÊM GAN B ppt

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI ĐỂ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VÀ CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA SIÊU VI VIÊM GAN B Tóm Tắt Tám kiểu gen của siêu vi viêm gan B (HBV) đã được xác định (Từ A đến H) dựa vào sự khác nhau trên 8 % của bộ gen HBV, và sự phân bố của các kiểu gen khác nhau ở các châu lục, các nước khác nhau. Việc xác định kiểu gen của HBV ngày càng được quan tâm bởi vì kiểu gen HBV có liên quan đến biểu hiện triệu chứng lâm sàng, diễn tiến của bệnh cũng như đáp ứng với điều trị của viêm gan siêu vi B. Bên cạnh đó, vấn đề phát hiện đột biến kháng thuốc, đặc biệt là các đột biến kháng Lamivudine trong điều trị HBV giữ một vai trò rất quan trọng để từ đó chúng ta mới có lựa chọn thuốc đúng và hiệu quả trong điều trị viêm gan siêu vi B. Chúng tôi ứng dụng kỹ thuật giải trình tự chuỗi (Sequencing) trên hệ thống OpenGene với bộ thuốc thử TruGene (Bayer) trong việc xác định kiểu gen và các đột biến kháng thuốc Lamivudine đã được công bố của HBV. Trong thời gian từ tháng 8/2004 đến tháng 5/2006, tại phòng xét nghiệm Trung Tâm Y Khoa MEDIC, chúng tôi thực hiện giải trình tự chuỗi cho 122 trường hợp bệnh nhân Việt Nam viêm gan siêu vi B mãn tính đang điều trị Lamivudine. Nam chiếm 97 trường hợp (79,5%), nữ 25 trường hợp (20,5%), với tuổi trung bình của bệnh nhân 33,9 ± 10,4. Tất cả các trường hợp đều HBVDNA [+], trong đó HBeAg [+] là 100 trường hợp (82,0 %) và HBeAg [-] là 22 trường hợp (18,0 %). Chỉ có 2 kiểu gen của HBV là kiểu gen B và C, trong đó kiểu gen B là 76 trường hợp (62,3 %) và kiểu gen C là 46 trường hợp (37,7 %). Tổng cộng có 78 trường hợp (63,9%) có đột biến kháng Lamivudine, tỷ lệ và các kiểu đột biến như sau: L180M & M204I (11,5%); L180M & M204V (36,1%); L180M, M204V & V173L (0,8%); L180M, M204V & V207I (0,8%); M204I (12,3%); M204I & V207I (0,8%); M204V (1,6%). Trong 76 trường hợp kiểu gen B có 49 trường hợp (64,5%) có đột biến kháng Lamivudine, và 46 trường hợp kiểu gen C có 29 trường hợp (63,0%) có đột biến kháng Lamivudine. Tất cả bệnh nhân đang điều trị Lamivudine với thời gian điều trị trung bình là 2,5 ± 0,9 năm với số trường hợp tương ứng cho điều trị 1, 2, 3, 4 năm là 18, 41, 45, 18 trường hợp. Tỷ lệ có đột biến kháng Lamivudine sau 1, 2, 3, 4 năm điều trị Lamivudine là 27,8%; 63,4%; 71,1%; 83,3%. Qua kết quả bước đầu đạt được chúng tôi thấy rằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi giữ một vai trò rất quan trọng trong việc xác định kiểu gen siêu vi viêm gan B cũng như việc nhận diện được các đột biến kháng thuốc Lamivudine để từ đó chúng ta có một phác đồ điều trị tối ưu. Summary APPLYING SEQUENCING TO IDENTIFY HEPATITIS B VIRUS GENOTYPES AND MUTATIONS Hepatitis B Virus (HBV) can be classified into 8 genotypes A through H based on an intergroup divergence of 8% or more in the complete nucleotide sequence, and the different distribution of various genotypes in different continents, countries. The identification of HBV genotypes are more concerned as it is HBV genotypes relating to clinical manifestation, activity of liver disease as well as treatment responses of Hepatitis B. Additionally, the discovery of resistance to medicines in HBV treatment plays a very important role from which we can have an appropriate and effective choice in Hepatitis B treatment.We have applied the Sequencing by OpenGene system with Trugene HBV Genotyping kit (Bayer) to identify Hepatitis B Virus Genotypes and Lamivudine – resistant mutation. From August 2004 to May 2006, in MEDIC laboratory, we have implemented sequencing for 122 cases Vietnamese with Chronic Hepatitis B on Lamivudine treatment in which: 97 cases are males (take 79.5%) and 25 cases are females (take 20.5%), medium age: 33.9±10.4. All cases are HBVDNA [+] in which: 100 cases are HBeAg [+] (82.0%) and 22 cases are HBeAg [-] (18.0%). There are only two genotypes of HBV: genotype B and genotype C, in which 76 cases are genotypes B (62.3%) and 46 cases are genotype C (37.7%). Totally there are 78 cases (63.9%) mutations with following established proportion and types: L180M & M204I (11.5%); L180M & M204V (36.1%); L180M, M204V & V173L (0.8%); L180M, M204V & V207I (0.8%); M204I (12.3%); M204I&V207I (0.8%); M204V (1.6%). There are 49 cases mutations in 76 cases of genotypes B (64.5%) and 29 cases in 46 cases of genotypes C (63.0%). All patients are on Lamivudine treatment with average time is 2.5±0.9 years, the corresponding number of patients in treatment period of 1, 2, 3, 4 year are 18, 41, 45, 18. The proportion of developing mutations after 1, 2, 3, 4 years of treatment with Lamivudine is 27.8%; 63.4%; 71.1%; 83.3%. We have found that - with above preliminary results - the sequencing plays a very important role in identifying Hepatitis B Virus Genotypes and Mutations. From those results we can approach an optimal treatment course. I. Đặt vấn đề: Những tiến bộ mới trong điều trị viêm gan do siêu vi B (HBV) đã góp phần đáng kể trong việc hạn chế những biến chứng của bệnh. Cho đến nay đã có 4 loại thuốc điều trị HBV đã được FDA (Food and Drug Administration: Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ) công nhận là Interferone, Lamivudine, Adefovir và Entecavir, trong đó Lamivudine vẫn được xem là thuốc uống được lựa chọn đầu tiên. Tuy nhiên trong quá trình điều trị Lamivudine đã có vấn đề phát sinh: Vấn đề đột biến kháng Lamivudine của HBV, tỉ lệ đột biến kháng này xảy ra ngày càng cao tăng theo thời gian dùng thuốc Lamivudine. Một vấn đề mới ngày càng được quan tâm là kiểu gen của HBV (HBV Genotype). Khác với kiểu gen siêu vi viêm gan C (HCV) có vai trò quan trọng trong việc đánh giá điều trị đặc hiệu thì vai trò của kiểu gen HBV chưa được rõ ràng lắm. Sự phân bố của kiểu gen HBV thay đổi tùy theo vùng địa dư, mỗi châu lục hay mỗi nước sẽ có các kiểu gen vượt trội khác nhau. Có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử có thể dùng để xác định các đột biến kháng thuốc của HBV cũng như xác định kiểu gen của HBV. Chúng tôi sử dụng kỹ thuật giải trình tự chuỗi (Sequengcing) để đồng thời vừa xác định các đột biến kháng thuốc Lamivudine của HBV vừa xác định được kiểu gen HBV, khảo sát kiểu gen nào vượt trội ở người Việt Nam cũng như đánh giá các loại và tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine theo thời gian điều trị Lamivudine. Mục tiêu của nghiên cứu này là: (1) Xác định kiểu gen của HBV ở bệnh nhân Việt Nam; (2) Khảo sát các kiểu đột biến và tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine ở bệnh nhân điều trị Lamivudine liên tục. II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 1, Đối tượng nghiên cứu: Bệnh nhân người Việt Nam, đã được chẩn đoán viêm gan siêu vi B mãn tính đang được điều trị liên tục bằng Lamivudine. Các bệnh nhân được chia làm 4 nhóm với thời gian điều trị liên tục Lamivudine tương ứng là 1, 2, 3, 4 năm. Có xét nghiệm HBVDNA dương tính. Không bị đồng nhiễm siêu vi viêm gan C. 2, Kỹ thuật thực hiện: 2.1, Kỹ thuật giải trình tự chuỗi: Huyết thanh bệnh nhân được tách và lưu trong ống mẫu tinh sạch, nếu mẫu chưa thực hiện ngay thì được lưu ở nhiệt độ – 200C. DNA của HBV được tách chiết theo nguyên tắc hấp thụ trên hạt Silicate (Phương pháp BOOM) rồi rửa bằng Ethanol 70%. Thực hiện phản ứng trùng hợp chuỗi (PCR) trên bộ thuốc thử TruGene HBV Genotyping (Bayer), máy luân nhiệt Bio-Rad theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau khi kiểm tra có sản phẩm khuếch đại (Amplicons) bằng điện di trên thạch Agarose thì tiếp tục thực hiện phản ứng cắt đoạn (Clip reaction) theo hướng dẫn của nhà sản xuất trên máy luân nhiệt, tiếp tục thực hiện điện di trên thạch Acrylamide với hệ thống OpenGene. Tín hiệu sẽ tự động thu nhận từ hệ thống điện di và phần mềm máy tính sẽ sắp xếp trình tự chuỗi của mẫu, và trình tự chuỗi này sẽ được so sánh với thư viện gen (Gene Librarian) có sẵn được cung cấp bởi nhà sản xuất (Bayer). Kết quả thu nhận được là kiểu gen của HBV và các đột biến kháng Lamivudine đã được công bố. 2.2, HBeAg: Kỹ thuật thực hiện theo phương pháp điện hóa phát quang, thuốc thử của hãng Abbott, thực hiện trên máy Architect (Abbott). 3, Phương pháp nghiên cứu: Cắt ngang. 4, Thống kê: Phần mềm SPSS for Win, Ver. 7.5. III, Kết quả: 1, Tổng số có 122 trường hợp được thực hiện giải trình tự chuỗi: Tuổi nhỏ nhất là 10, lớn nhất là 63 với độ tuổi trung bình là 33,9 ± 10,4. Nam có 97 trường hợp chiếm 79,5% và nữ có 25 trường hợp chiếm 20,5%. 2, Kiểu gen của HBV trong 122 trường hợp: Chỉ có 2 kiểu gen của HBV được xác định là kiểu gen B và C. Trong đó kiểu gen B là 76 trường hợp (62,3%) và kiểu gen C là 46 trường hợp (37,7%). 3, Kết quả HBeAg: Tất cả 122 trường hợp đều có HBVDNA dương tính, trong đó HBeAg âm tính là 22 trường hợp (18%) và HBeAg dương tính là 100 trường hợp (82%). Kết quả của HBeAg trong các kiểu gen khác nhau cũng được ghi nhận. Bảng 1. Tỉ lệ HBeAg và các kiểu gen B, C. Kiểu gen B Kiểu gen C Số lượng Phần trăm Số lượng Phần trăm HBeAg âm tính 12 15,8% 10 21,7% HBeAg dương tính 64 84,2% 36 78,3% 4, Kiểu gen HBV và các đột biến kháng Lamivudine: Bảng 2. Tỉ lệ của đột biến kháng Lamivudine và kiểu gen HBV. Kiểu gen B Kiểu gen C Số lượng Phần trăm Số lượng Phần trăm Không có đột biến kháng Lamivudine 27 35,5% 17 37% Có đột biến kháng Lamivudine 49 64,5% 29 63% 5, Các kiểu đột biến kháng Lamivudine và tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine theo thời gian điều trị: Tổng cộng có 78 (63,9%) trường hợp có đột biến kháng Lamivudine. Bảng 3. Tỷ lệ các loại đột biến kháng Lamivudine và tỉ lệ phần trăm. Loại đột biến L180M, M204I L180M, M204V L180M, M204V & V173L L180M, M204V & V207I M204I M204I, V207I M204V Số lượng 14 44 1 1 15 1 2 Tỉ lệ % 11,5 36,1 0.8 0,8 12,3 0,8 1,6 Ghi chú: L (Leucine); M (Methionine); I (Isoleucine); V (Valine). Có 4 nhóm bệnh nhân được khảo sát dựa trên thời gian điều trị Lamivudine, số lượng bệnh nhân sau 1, 2, 3, 4 năm điều trị Lamivudine tương ứng là 18, 41, 45, 18 trường hợp. Thời gian điều trị Lamivudine trung bình là 2,5 ± 0,9 năm. Bảng 4. Tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine và thời gian điều trị Lamivudine. 1 năm 2 năm 3 năm 4 năm Số lượng Phần trăm Số lượng Phần trăm Số lượng Phần trăm Số lượng Phần trăm Không có đ ột biến kháng Lamivudine 13 72,2% 15 36,6% 13 28,9% 3 16,7% Có đ ột biến kháng Lamivudine 5 27,8% 26 63,4% 32 71,1% 15 83,3% IV, Bàn luận: 1, Kiểu gen HBV: [...]... rtM204V/I/S) Những đột < /b> biến < /b> khác cũng liên quan đến kháng < /b> Lamivudine như đột < /b> biến < /b> thay Leucine thành Methionine ở vùng B (Domain B) là đột < /b> biến < /b> rtL180M; Đột biến < /b> V173L; Đột biến < /b> V207I Trong 122 trường hợp giải < /b> trình < /b> tự < /b> chuỗi < /b> thì có 78 trường hợp (63,9%) có đột < /b> biến < /b> kháng < /b> Lamivudine Có nhiều kiểu < /b> đột < /b> biến < /b> kháng < /b> Lamivudine, chủ yếu là đột < /b> biến < /b> ở vị trí 204 và < /b> có kèm hoặc không các < /b> đột < /b> biến < /b> rtL180M, V173L,... tế b o gan < /b> cao hơn sau khi được phẫu thuật < /b> cắt b ung thư tế b o gan < /b> so với kiểu < /b> gen < /b> B Anh hưởng của < /b> kiểu < /b> gen < /b> HBV với đáp ứng < /b> điều trị Lamivudine cũng chưa được nghiên cứu nhiều, một nghiên cứu cho thấy dường như b nh nhân kiểu < /b> gen < /b> B dễ phát triển đột < /b> biến < /b> kháng < /b> Lamivudine hơn các < /b> kiểu < /b> gen < /b> khác Kết quả của < /b> chúng tôi ghi nhận (B ng 2) tỉ lệ có đột < /b> biến < /b> kháng < /b> Lamivudine ở kiểu < /b> gen < /b> B (64,5%) và < /b> kiểu < /b> gen.< /b> .. luận: Kiểu < /b> gen < /b> HBV ở Vi< /b> t Nam chủ yếu là B và < /b> C, tuy nhiên vai trò của < /b> kiểu < /b> gen < /b> HBV trong diễn tiến b nh cũng như đáp ứng < /b> điều trị chưa được biết rõ Các < /b> kiểu < /b> đột < /b> biến < /b> kháng < /b> Lamivudine của < /b> nhóm b nh nhân chúng tôi thì đa dạng, đặc biệt tỉ lệ đột < /b> biến < /b> kháng < /b> thuốc < /b> Lamivudine cao và < /b> tăng dần theo thời gian dùng thuốc < /b> Lamivudine Qua kết quả b ớc đầu đạt được chúng tôi thấy rằng kỹ < /b> thuật < /b> giải < /b> trình < /b> tự < /b> chuỗi.< /b> .. đề điều trị vi< /b> m gan < /b> siêu < /b> vi < /b> C Kiểu < /b> gen < /b> của < /b> HBV phân b ở các < /b> châu lục và < /b> vùng lãnh thổ khác nhau thì khác nhau Kiểu < /b> gen < /b> HBV chủ yếu ở Đông Nam Á là kiểu < /b> gen < /b> B và < /b> C, điều này cũng phù hợp với kết quả của < /b> chúng tôi với 122 trường hợp thực hiện giải < /b> trình < /b> tự < /b> chuỗi < /b> có 76 trường hợp (62,3%) kiểu < /b> gen < /b> B và < /b> 46 trường hợp (37,7%) kiểu < /b> gen < /b> C Trong 122 trường hợp thực hiện giải < /b> trình < /b> tự < /b> chuỗi < /b> (HBV DNA dương... dựa vào sự khác nhau trên 8% của < /b> toàn b b gen < /b> của < /b> HBV Có nhiều kỹ < /b> thuật < /b> dùng để < /b> xác < /b> định < /b> kiểu < /b> gen < /b> HBV như kỹ < /b> thuật < /b> giải < /b> trình < /b> tự < /b> chuỗi < /b> (Sequencing), sự đa hình của < /b> các < /b> đoạn cắt giới hạn (RFLP), phản ứng < /b> lai các < /b> đoạn dò (LiPA), phản ứng < /b> trùng hợp chuỗi < /b> với các < /b> đoạn mồi đặc hiệu (PCR with Specific Primers), phản ứng < /b> miễn dịch gắn men (Enzyme-linked immunoassay) Kỹ < /b> thuật < /b> chúng tôi dùng để < /b> xác < /b> định < /b> kiểu.< /b> .. trong đó HBeAg âm tính là 22 trường hợp (18%) và < /b> HBeAg dương tính là 100 trường hợp (82%) Có vài nghiên cứu đã được công b cho thấy đối với kiểu < /b> gen < /b> B của < /b> HBV có thải trừ HBeAg cao hơn so với kiểu < /b> gen < /b> C Tuy nhiên kết quả của < /b> chúng tôi (B ng 1) không có sự khác biệt rõ rệt giữa tỉ lệ HBeAg âm tính ở kiểu < /b> gen < /b> B và < /b> C (15,8% và < /b> 21,7%) Vai trò của < /b> kiểu < /b> gen < /b> HBV trong diễn tiến của < /b> b nh vi< /b> m gan < /b> siêu < /b> vi < /b> B cũng... xác < /b> định < /b> kiểu < /b> gen < /b> của < /b> HBV là kỹ < /b> thuật < /b> giải < /b> trình < /b> tự < /b> chuỗi < /b> vì b n cạnh vi< /b> c xác < /b> định < /b> được kiểu < /b> gen < /b> của < /b> HBV chúng tôi còn tìm được các < /b> đột < /b> biến < /b> kháng < /b> Lamivudine chỉ trong một lần thực hiện giải < /b> trình < /b> tự < /b> chuỗi < /b> Vai trò của < /b> kiểu < /b> gen < /b> HBV chưa được nghiên cứu nhiều cũng như có nhiều nghiên cứu với số liệu nhỏ, rãi rác công b với kết quả không phù hợp nhau, điều này khác với vai trò của < /b> kiểu < /b> gen < /b> HCV trong... đột < /b> biến < /b> kháng < /b> Lamivudine của < /b> siêu < /b> vi < /b> viêm < /b> gan < /b> B và < /b> tỉ lệ đột < /b> biến < /b> kháng < /b> thuốc < /b> Lamivudine tăng theo thời gian sử dụng < /b> Lamivudine Vị trí đột < /b> biến < /b> kháng < /b> Lamivudine xảy ra trên vùng C (Domain C) của < /b> đoạn gen < /b> sao chép ngược (RT: Reverse Transcriptase) của < /b> HBV chủ yếu là kiểu < /b> YMDD (tyrosine-methionine-aspartate-aspartate), ở đó Methionine sẽ được thay b ng Valine, Isoleucine và < /b> hiếm khi là Serine (Đột biến.< /b> .. 2 cách phân loại HBV: Kiểu < /b> huyết thanh (Serotype) và < /b> kiểu < /b> gen < /b> (Genotype) Trước đây người ta phân HBV thành 4 kiểu < /b> huyết thanh adr, adw, ayr và < /b> ayw dựa vào các < /b> kháng < /b> nguyên của < /b> kháng < /b> nguyên b mặt HBV (HBsAg) Tuy nhiên những ý nghĩa của < /b> kiểu < /b> huyết thanh chưa được nghiên cứu nhiều Với sự phát triển của < /b> sinh học phân tử, ngày nay người ta phân loại HBV dựa vào nghiên cứu trên b gen < /b> của < /b> HBV và < /b> phân HBV... kết quả cho thấy kiểu < /b> gen < /b> C dường như làm cho rối loạn chức năng gan < /b> nhiều hơn kiểu < /b> gen < /b> B cũng như kiểu < /b> gen < /b> C dễ diễn tiến đến xơ gan < /b> nhiều hơn kiểu < /b> gen < /b> B Mối liên hệ giữa kiểu < /b> gen < /b> HBV và < /b> ung thư tế b o gan < /b> cũng được ghi nhận: Kiểu < /b> gen < /b> B thường kết hợp với sự phát triển ung thư tế b o gan < /b> ở người trẻ tuổi, một nghiên cứu khác lại cho thấy kiểu < /b> gen < /b> C thường kết hợp với ung thư tế b o gan < /b> và < /b> có tỉ lệ tái . ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI ĐỂ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VÀ CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA SIÊU VI VIÊM GAN B Tóm Tắt Tám kiểu gen của siêu vi viêm gan B (HBV) đã được xác định (Từ. dụng kỹ thuật giải trình tự chuỗi (Sequencing) trên hệ thống OpenGene với b thuốc thử TruGene (Bayer) trong vi c xác định kiểu gen và các đột biến kháng thuốc Lamivudine đã được công b của HBV xác định kiểu gen của HBV là kỹ thuật giải trình tự chuỗi vì b n cạnh vi c xác định được kiểu gen của HBV chúng tôi còn tìm được các đột biến kháng Lamivudine chỉ trong một lần thực hiện giải