XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VI RÚT VIÊM GAN B VÀ CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI docx

XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VI RÚT VIÊM GAN B VÀ CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI I, NHỮNG TIẾN BỘ CỦA XÉT NGHIỆM TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM GAN SIÊU VI B Mặc dù chương trình tiêm ngừa vi rút viêm gan B (HBV) làm giảm đáng kể tỷ lệ bệnh viêm gan vi rút B, HBV “tên sát nhân giấu mặt” đơi triệu chứng bệnh rât mơ hồ làm cho ta lầm tưởng với trường hợp rối loạn tiêu hóa hay gặp, đa số trường hợp khơng có triệu chứng lâm sàng trường hợp viêm gan vi rút B mãn tính mà có xét nghiệm máu chẩn đốn bệnh Do đó, vai trị xét nghiệm chẩn đoán viêm gan vi rút B giữ vai trị quan trọng Có nhiều loại xét nghiệm khác xử dụng chẩn đốn viêm gan vi rút B, loại có ý nghĩa khác tùy vào giai đoạn bệnh mà người bác sĩ lựa chọn xét nghiệm thích hợp Có xét nghiệm hay dùng chẩn đoán, đánh giá vi rút viêm gan siêu vi B trước HBsAg, AntiHBs, HBeAg, AntiHBe, AntiHBc IgM AntiHBc IgG Các xét nghiệm xét nghiệm bản, dùng phương pháp miễn dịch để phát có số hạn chế Vào năm cuối kỷ 20, kỹ thuật sinh học phân tử đời có tốc độ phát triển nhanh chóng mở kỷ nguyên chẩn đốn gen nên chẩn đoán vi rút viêm gan B mức độ phân tử (Đó xét nghiệm phân tích phân tử di truyền HBV DNA) Nhờ ứng dụng kỹ thuật phân tích DNA HBV mà giải hạn chế kỹ thuật miễn dịch kinh điển phân tích DNA vi rút giúp có sở đánh giá tình trạng bệnh, khả diễn tiến bệnh, theo dõi điều trị bệnh lựa chọn phương thuốc điều trị thích hợp Cho đến thực số xét nghiệm sinh học phân tử HBV sau: F Xác định tình trạng tăng sinh vi rút trường hợp có đột biến vùng trước lõi (Pre Core) để từ có định điều trị đặc trị khơng Đó xét nghiệm HBVDNA, kỹ thuật thường dùng để xác định HBVDNA kỹ thuật PCR (Là kỹ thuật khuếch đại DNA đích, nhạy đặc hiệu, xử dụng phổ biến không Việt Nam mà giới) F Đếm số lượng vi rút B máu để theo dõi điều trị Nhờ xác định số lượng vi rút trước điều trị mà theo dõi số lượng vi rút trình điều trị: Tăng giảm để có thay đổi điều trị kịp thời hiệu Hai kỹ thuật thường dùng để định lượng vi rút viêm gan B Real Time PCR (Khuếch đại DNA đích với thời gian thật) bDNA (Khuếch đại tín hiệu) F Xác định loại vi rút (Định kiểu gen vi rút HBV: HBV Genotype) F Phân tích trường hợp đột biến kháng thuốc để từ có sở lựa chọn loại thuốc điều trị thích hợp, đặc biệt đột biến kháng với Lamivudine (Là thuốc uống xử dụng rộng rãi cho điều trị HBV, nhiên có nhược điểm dễ bi đột biến kháng thuốc vi rút) Nhờ mà người bác sĩ tránh trường hợp dùng thuốc không hiệu quả, giảm tốn cho bệnh nhân Cho đến nay, vấn đề lên quan tâm việc chẩn đoán HBV vai trò thực kiểu gen vi rút viêm gan B đột biến vi rút B trình diễn tiến tự nhiên bệnh tác động thuốc đặc trị: Kháng thuốc hiệu thuốc điều trị II, PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VÀ ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA VI RÚT B Trước đây, HBV phân làm kiểu huyết (Serotypes): adr, adw, ayr, ayw dựa việc xác định kiểu kháng nguyên kháng nguyên bề mặt vi rút B, kiểu huyết phân loại thêm chi kiểu (Subtypes) ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq+, adrq- Nghiên cứu dịch tể cho thấy phân bố serotypes khác vùng khác giới Tuy nhiên, có liệu vai trò HBV Serotypes Những tiến kỹ thuật sinh học phân tử vào năm cuối kỹ 20 giúp khám phá đa dạng trình tự chuỗi vi rút viêm gan B, từ dấu ấn (marker) HBV đời HBV genotype Tám kiểu gen HBV xác định (Từ A đến H) dựa vào khác 8% toàn trình tự chuỗi gen HBV, phân bố kiểu gen khác châu lục, nước khác Tuy nhiên phân loại HBV genotypes cần dựa trình tự chuỗi (sequence) đoạn gen HBV phần trình tự chuỗi gen pre-S; S Có nhiều phương pháp nghiên cứu dùng việc xác định HBV genotypes giải trình tự chuỗi (sequencing), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), LiPA (Line Probe Assay), phản ứng miễn dịch men (Enzyme-linked Immunoassay) Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm khác nhau, nhiên phương pháp giải trình tự chuỗi xem có nhiều ưu điểm bật bên cạnh việc xác định trình tự chuỗi Nucleotids gen HBV để từ so sánh với thư viện gen xác định HBV genotypes mà cịn dựa vào kết giải trình tự xác định số dạng đột biến kháng thuốc HBV để từ có phát đồ điều trị tối ưu Hiên nay, trung tâm y khoa MEDIC TP Hồ chí Minh xử dụng hệ thống giải trình tự Trugen hãng Bayer (Đức) Đây hệ thống giải trình tự xác định lúc kiểu gen đột biến kháng thuốc HBV lần xử dụng xét nghiệm thường qui Ngoài HBV, hệ thống dùng cho xác định kiểu gen vi rút viêm gan C (HCV genotype) xác định đột biến kháng thuốc vủa HIV 1, KHÁI NIỆM VỀ CẤU TRÚC PHÂN TỬ DNA: Nguyên tắc bổ sung cấu tạo phân tử DNA: DNA chuỗi xoắn kép, hai mạch đơn nối với liên kết Hydro Mối liên kết bị phá vỡ nhiệt độ cao (Thường 90 o C, ứng dụng thực tế 94 o C), làm cho phân tử DNA biến thành mạch đơn Có loại Nucleotid (Nu ) cấu tạo nên DNA: A(Adenine), T(Thymine), G(Guanine), C(Cytosine) Và phân tử RNA A, U, G, C Các Nu bắt cặp với theo nguyên tắc bổ sung: A (Hoặc U ) gắn với T, G gắn với C (Xem hình minh họa) Việc xác định thứ tự Nu gắn kết với dọc theo chiều dài gen (DNA) gọi việc giải trình tự chuỗi (Sequencing), trình tự gắn kết Nu gọi trình tự chuỗi (Sequence) 2, CẤU TẠO BỘ GEN HBV: HBV có gen phân tử DNA, chiều dài khoảng 3200 bases Hoạt động nhân đôi HBV nhờ hoạt tính men polymerase (P protein), Protein lớn, phức tạp, đa chức Trên vùng gen P (Polymerase) chia làm vùng, vùng có chức riêng: Terminal protein, Spacer, RT domains RNAase H (Xem hình) Trong đó, vùng mã ngược (RT domains: Reverse Transcription) chịu trách nhiệm cho việc tổng hợp men RNA-dependent DNA DNA-dependent DNA chia thành vùng đặt tên từ A – G (Xem hình cấu tạo RT) Vì vùng RT đích tác động thuốc Lamivudine nên đột biến vùng trình phát triển tự nhiên siêu vi B tác động thuốc điều trị dẫn tới vấn đề đột biến kháng thuốc CẤU TẠO BỘ GEN HBV CẤU TẠO GEN P VÀ VÙNG RT 3, QUI TRÌNH THỰC HIỆN GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI TRÊN HỆ THỐNG SEQUENCING TRUGENE Để thực kỹ thuật giải trình tự chuỗi, phải thực bước sau: (1) Thực PCR; (2) Thực phản ứng cắt; (3) Điện di phân tích kết 3.1, THỰC HIỆN PCR Để khuếch đại gene HBV ta dùng kỹ thuật PCR Mục đích giai đoạn khuếch đại đoạn gen đặc hiệu cho HBV có máu bệnh nhân: Từ phân tử ban đầu thành hàng tỷ DNA, từ thực giải trình tự chuỗi HBV Đây giai đoạn quan trọng, định cho thành công thực giải trình tự chuỗi Kỹ thuật gồm có bước chủ yếu sau (Theo thứ tự bước thực hiện): 1, Lấy mẫu, bảo quản mẫu & cách gửi mẫu 2, Ly trích tinh DNA HBV 3, Khuếch đại DNA vi rút phản ứng PCR máy luân nhiệt 4, Kiểm tra & phát sản phẩm khuếch đại (Amplicon) gel Agarose Sau chi tiết ý nghĩa bước thực 3.1.1, Lấy mẫu, bảo quản mẫu & cách gửi mẫu Yêu cầu mẫu máu: Serum, plasma (tuyệt đối không dùng Heparin) Tách serum plasma vòng sau lấy máu Nếu chưa thực ly trích DNA mẫu phải lưu –20oC Nếu gửi mẫu phải giữ mẫu đá khô tốt Tránh tượng phải rả đông mẫu máu nhiều lần Máu tĩnh mạch, lấy lúc đói buổi sáng tốt Dụng cụ lấy máu: Vô trùng, loại dùng lần, thao tác nguyên tắc vơ trùng, có bao tay 3.1.2, Ly trích tinh DNA HBV Phương pháp ly trích chọn hấp thụ DNA lên hạt silica, rửa Ethenol 70% 3.1.3, Khuếch đại DNA virus phản ứng PCR máy luân nhiệt Áp dụng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction: Phản ứng trùng hợp chuỗi) Đây kỹ thuật khuếch đại đoạn gen mà cần khuếch đại, sau khuếch đại có số lượng nhiều DNA để ứng dụng vào lĩnh vực mà ta quan tâm Một chu kỳ phản ứng PCR gồm có giai đoạn: (1) GIAI ĐOẠN BIẾN TÍNH: Nhiệt độ ống mẫu tăng lên đến 94o C, nhiệt độ làm cho phân tử DNA biến tính tách làm đơi hồn tồn, tất hoạt động men dừng lại (Ví dụ hoạt động kéo dài chu kỳ trước) Mục đích giai đoạn làm cho phân tử DNA tách làm đơi duỗi thẳng hồn tồn, từ dễ dàng cho việc bắt cặp gắn Nu vào mạch đơn theo ngun tắc bổ sung Hình minh họa giai đoạn biến tính: (2) GIAI ĐOẠN BẮT CẶP: Các Primer (Các đoạn mồi) có gắn Biotin đoạn Nu ngắn (Khoảng 20-25 Nu) có sẵn ống mẫu bắt cặp vào chuỗi đơn DNA sau biến tính theo nguyên tắc bổ sung Sự bắt cặp có ý nghĩa đặc hiệu: Đặc hiệu theo nguyên tắc bổ sung với đoạn gen mà ta cần khuếch đại đặc hiệu theo chiều dài đoạn gen khuếch đại Ví dụ ta cần khuếch đại đoạn gene HBV primer cho HBV bắt cặp với gen HBV có ống mẫu, cịn gen lồi khác khơng bắt cặp (Đồng nghĩa với việc khơng khuếch đại được) Hình minh họa giai đoạn bắt cặp: (3) GIAI ĐOẠN KÉO DÀI: Sau primer bắt cặp đặc hiệu với mạch đơn DNA, nhờ tác dụng men Taq polymerase điều kiện thích hợp gắn Nu có sẵn ống nghiệm vào primer theo nguyên tắc bổ sung, từ làm cho đoạn mồi dài hình thành nên mạch đơn bổ sung với mạch đơn cũ Và DNA hình thành Như vậy, sau giai đoạn ta có hai phân tử DNA có cấu trúc giống hệt phân tử DNA ban đầu Cả ba giai đoạn biến tính, bắt cặp kéo dài thuộc chu kỳ khuếch đại DNA Như vậy, sau chu kỳ khuếch đại từ phân tử DNA ban đầu thành phân tử DNA giống hệt nhau, sau 30 chu kỳ khuếch đại có khoảng 230 phân tử DNA giống hệt (Khoảng tỷ DNA) Như số lượng DNA mẫu vài triệu sau 30 chu kỳ khuếch đại (Thời gian khoảng 23 giờ) ta có hàng nghìn tỷ sao, lượng DNA đủ để ta làm phản ứng cắt cho giải trình tự chuỗi Hình minh họa giai đoạn kéo dài: 3.1.4, Kiểm tra & phát sản phẩm khuếch đại (Amplicon) gel Agarose Sau thực phản ứng PCR, ta điện di gel agarose 2%, mục đích chủ yếu bước xem có sản phẩm PCR khơng đánh giá kích thước sản phẩm khuếch đại có đoạn dài ta biết (Có nghĩa có bắt cặp primer chiều dài amplicon cho HBV) 3.2, THỰC HIỆN PHẢN ỨNG CẮT (CLIP) Về nguyên tắc phản ứng giống hệt phản ứng PCR (Cũng gồm có bước: Biến tính, bắt cặp kéo dài) Tuy nhiên có điểm khác biệt thành phần Nu Clip buffer để khuếch đại A, T, G, C cịn có thêm dd Nucleotides Như ống nghiệm phản ứng clip có thành phần sau: DNA đích cần cho phản ứng clip cặp mồi chuyên biệt A, C, G, T Deoxynucleotides Triphosphate A, C, G, T DiDeoxynucleotides Triphosphate DNA Polymerase Trong giai đoạn kéo dài phản ứng clip (Giống giai đoạn kéo dài phản ứng PCR), lúc Nu tác động men Polymerase gắn vào cặp mồi có gắn ngẫu nhiên dd Nucleotides, kéo dài ngừng lại vị trí (Là vị trí ta biết) Ví dụ ống cho vào A DiDeoxynucleotides Triphosphate kéo dài dừng lại vị trí A, sau phản ứng Clip ta có phân tử dài ngắn khác mà có tận Adenine Khi điện di gel có độ ly giải cao (Có thể phân biệt dài ngắn khác Nu) ta có trình tự Nu, dựa vào phần mềm máy cho trình tự chuỗi DNA HBV So sánh thư viện gen máy tính se cho ta biết kiểu gen vi rút kiểu gen đột biến công bố HBV (Bao gồm đột biến kháng thuốc) HỆ THỐNG GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI TRUGENE ĐIỆN DI RA CÁC VẠCH DÀI NGẮN KHÁC NHAU HÌNH MINH HỌA CỦA CÁC ĐOẠN DNA VỚI SỰ NGƯNG KÉO DÀI Ở VỊ TRÍ ADENINE TỪ ĐĨ TA BIẾT TRÌNH TỰ TRONG CHUỖI DNA CỦA ADENINE TƯƠNG TỰ TA BIẾT TRÌNH TỰ CHUỖI CỦA T, G, C KẾT QUẢ TRÌNH TỰ CHUỖI CĨ ĐƯỢC SAU KHI KẾT HỢP CẢ CHIỀU ĐIỆN DI, TỪ KẾT QUẢ NÀY SẼ ĐƯỢC SO VỚI THƯ VIỆN GEN CỦA MÁY ĐỂ CÓ KIỂU GEN VÀ CÁC ĐỘT BIẾN III, VAI TRỊ CỦA KIỂU GEN VI RÚT B Khơng giống kiểu gen vi rút viêm gan C, vai trò kiểu gen vi rút viêm gan B chưa biết rõ ràng Nhiều câu hỏi vai trò kiểu gen HBV đặt nhà chuyên môn cố gắng để trả lời: (1) Có hay khơng liên quan kiểu gen HBV khả nhân đôi vi rút, hoạt tính bệnh gan, khỏi bệnh, đáp ứng với điệu trị (2) Kiểu gen chủ yếu nước Sự phân bố kiểu gen HBV theo vùng địa lý có liên quan với dịch tể nhiễm HBV (3) Anh hưởng kiểu gen HBV diễn tiến đến viêm gan B mạn tính (4) Khi nhiễm với kiểu gen có bảo vệ khỏi nhiễm với kiểu gen khác không Cho đến nay, nghiên cứu kiểu gen HBV cịn rải rác, số liệu khơng nhiều kết chưa thống hồn tồn Kiểu gen HBV vùng Đơng Nam Á, có Việt Nam, chủ yếu kiểu gen B C Có nhiều nghiên cứu cho thấy có mối liên quan kiểu gen HBV đột biến vùng Precore Core Promoter: Kiểu gen B, C D thường có đột biến kiểu gen A Về độ thải HBeAg kiểu gen HBV, nghiên cứu bệnh nhân Châu Á cho thấy kiểu gen B có thải HBeAg cao so với kiểu gen C Mối quan hệ kiểu gen vi rút viêm gan B diễn tiến bệnh nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Rối loạn chức gan gặp kiểu gen B so với kiểu gen C, kiểu gen C thường gặp bệnh nhân xơ gan Vai trò kiểu gen HBV đáp ứng điều trị quan tâm Trong điều trị với Interferon, kiểu gen A có đáp ứng điều trị tốt nhất, kiểu gen B có đáp ứng điều trị tốt kiểu gen C Đối với Lamivudine, kiểu gen B dễ phát triển kháng thuốc IV, CÁC ĐỘT BIẾN CỦA VI RÚT B Hơn thập kỷ nay, nhiều kiểu đột biến HBV nhận diện Đa số đột biến thầm lặng khơng có ý nghĩa lâm sàng nào, nhiên có số đột biến có ý nghĩa q trình diễn tiến bệnh từ việc tiêm chủng phòng ngừa (S escape mutants), diễn tiến tự nhiên bệnh (Pre-core, Core promoter, Core mutations), đến đột biến gây kháng thuốc đặc trị (DNA Polymerase mutations) đột biến liên quan đến ung thư tế bào gan (X mutants) 1, Đột biến gen S (S mutants): Một số đột biến gen S có ý nghĩa đột biến “thốt”, ví dụ đột biến G145A, làm cho việc tiêm ngừa khơng có hiệu bệnh nhân nhiễm bệnh 2, Đột biến vùng trước lõi (Pre-core) Core promoter: Đột biến hay gặp đột biến Pre core (G1896A), từ làm khơng tạo HBeAg dù tình trạng vi rút tăng sinh HBeAg (-) đánh giá tình trạng vi rút tăng sinh qua xét nghiệm tìm HBVDNA 3, Đột biến vùng DNA Polymerase: Đột biến vùng ngày quan tâm, lý vùng đích tác động thuốc Lamivudine (Là thuốc uống lựa chọn điều trị HBV) Đột biến kháng Lamivudine hay gọi tên YMDD Nhóm Các đột biến vùng Polymerase rtL180 rtM204V rtM204I rtL80V/I rtM204I rtL180M rtM204I rtV173L, rtL180M rtM204V rtL180M rtM204S Bảng kiểu đột biến kháng Lamivudine Khi kết có đột biến người BS biết bệnh nhân có kháng với thuốc cần phải thay đổi chế độ thuốc cho bệnh nhân để từ đạt kết điều trị tốt 4, Đột biến gen X (HBX): Dữ liệu đột biến vai trò đột biến hạn chế, nhiên kết nghiên cứu bước đầu cho thấy đột biến có liên quan đến ung thư tế bào gan Với việc thực kỹ thuật giải trình tự chuỗi hệ thống Trugene, sau có trình tự chuỗi máy tự động so sánh trình tự chuỗi mẫu với thư viện gen có sẵn máy, từ phần mềm tính cho ta biết kiểu gen mẫu với độ tương đồng so với gen gốc, đột biến công bố HBV Nhờ việc thực xét nghiệm này, nói giải xét nghiệm cần thiết vấn đề chẩn đoán điều trị HBV Nhờ kỹ thuật sinh học phân tử mà người bác sĩ đánh giá biết chi tiết, toàn diện vi rút viêm gan B người bệnh nhân để từ có phác đồ điều trị tối ưu Tuy nhiên, chiến chống lại vi rút viêm gan B chưa có hồi kết, HBV vi rút nói chung luôn biến đổi cấu trúc di truyền để tránh tác động thuốc đặc trị  ... CÓ KIỂU GEN VÀ CÁC ĐỘT BIẾN III, VAI TRÒ CỦA KIỂU GEN VI RÚT B Không giống kiểu gen vi rút vi? ?m gan C, vai trò kiểu gen vi rút vi? ?m gan B chưa biết rõ ràng Nhiều câu hỏi vai trò kiểu gen HBV... rút vi? ?m gan B đột biến vi rút B trình diễn tiến tự nhiên b? ??nh tác động thuốc đặc trị: Kháng thuốc hiệu thuốc điều trị II, PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VÀ ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA VI RÚT B Trước... cạnh vi? ??c xác định trình tự chuỗi Nucleotids gen HBV để từ so sánh với thư vi? ??n gen xác định HBV genotypes mà dựa vào kết giải trình tự xác định số dạng đột biến kháng thuốc HBV để từ có phát đồ