Phát hiện đột biến gen UNC13D gây hội chứng thực bào máu ở trẻ em bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA

Bài viết giới thiệu đến: Hội chứng thực bào máu (HCTBM) nguyên phát ở trẻ em thường do đột biến gen gây nên. Trong một nghiên cứu trước đây trên 21 bệnh nhân trẻ em, chỉ phát hiện 1 trường hợp có đột biến gen perforin. Vì vậy, nghiên cứu này nhằm khảo sát đột biến gen UNC13D trên 10 bệnh nhân không có đột biến perforin.

Trang 1

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 150

PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN UNC13D

GÂY HỘI CHỨNG THỰC BÀO MÁU Ở TRẺ EM BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA

Hoàng Anh Vũ*, Nguyễn Văn Tân Minh**, Phan Thị Xinh***

TÓM TẮT

Giới thiệu: Hội chứng thực bào máu (HCTBM) nguyên phát ở trẻ em thường do đột biến gen gây nên.

Trong một nghiên cứu trước đây trên 21 bệnh nhân trẻ em, chúng tôi chỉ phát hiện 1 trường hợp có đột biến gen perforin.

Mục tiêu: Nghiên cứu này nhằm khảo sát đột biến gen UNC13D trên 10 bệnh nhân không có đột biến

perforin.

Đối tượng và phương pháp: Toàn bộ 32 exon và vùng tiếp giáp exon – intron của gen UNC13D đã được

khuếch đại và giải trình tự chuỗi DNA.

Kết quả: Chúng tôi phát hiện 2 trường hợp có đột biến điểm c.3151G>A ở exon 31 trên genomic DNA. Đột

biến tạo nên RNA không toàn vẹn do exon 30 nối trực tiếp với exon 32. Ngoài ra còn có 25 dạng đa hình thái đơn nucleotide được phát hiện.

Kết luận: Nghiên cứu trên số mẫu lớn hơn để hiểu rõ phổ đột biến gen UNC13D trên bệnh nhân Việt Nam

nên tiếp tục được tiến hành.

Từ khóa: hội chứng thực bào máu, đột biến gen UNC13D, giải trình tự chuỗi DNA

ABSTRACT

DETECTION OF UNC13D MUTATIONS IN PEDIATRIC PATIENTS WITH HEMOPHAGOCYTIC LYMPHOHISTIOCYTOSIS BY DNA SEQUENCING

Hoang Anh Vu, Nguyen Van Tan Minh, Phan Thi Xinh

* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 3 ‐ 2013: 150 ‐ 155

Introduction: Hemophagocytic lymphohistiocytosis, also known as hemophagocytic syndrome, in early

childhood are commonly caused by gene mutations. In a previous study, we found only one performing mutation among 21 pediatric patients.

Objective: In the present study, UNC13D mutations were analyzed in 10 wild type‐performing patients. Patients and methods: Full length of UNC13D including 32 exons and exon‐intron boundaries were

amplified and directly sequenced.

Results: Two out of ten patients had a point mutation c.3151G>A in exon 31. This mutation led to an

abnormal transcript where exon 30 joined up with exon 32. Moreover, we detected 25 single nucleotide polymorphisms along the gen.

Conclusion: Further study with more samples needs to be done to know the spectrum of UNC13D

mutations in Vietnamese patients.

Key words: hemophagocytic lymphohistiocytosis, UNC13D gene mutation, DNA sequencing

* Trung tâm Y sinh học phân tử, Đại học Y Dược TPHCM

** Khoa Xét Nghiệm Huyết học, Bệnh viện Nhi Đồng II TPHCM

*** Bộ môn Huyết học, Đại học Y Dược TP.HCM

Tác giả liên lạc: TS.BS. Hoàng Anh Vũ, ĐT: 0122‐2993537, email: hoangvuxinh@yahoo.com

Trang 3

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hội chứng thực bào máu (HCTBM;

hemophagocytic lymphohistiocytosis hay

hemophagocytic syndrome) ở trẻ em là một

dạng rối loạn di truyền được đặc trưng bởi hội

chứng viêm thái quá, với sốt, gan – lách to, giảm

tế bào máu ngoại biên và có thể biểu hiện triệu

chứng thần kinh trung ương đi kèm(4). Dù có

nhiều nguyên nhân khác nhau, những biểu hiện

lâm sàng ồ ạt của hiện tượng viêm đa hệ thống

và diễn tiến tử vong nhanh chóng đối với

HCTBM không được điều trị đã thu hút sự quan

tâm của những chuyên gia về huyết học, miễn

dịch, bệnh truyền nhiễm và di truyền học. Đến

nay, HCTBM vẫn còn được xem là một thử

thách đối với những nhà khoa học trong việc tìm

hiểu sự hình thành cũng như các bất thường của

quá trình điều hòa phản ứng viêm miễn dịch

trong cơ thể con người. Bệnh diễn tiến đến tử

vong trong vòng vài tuần nếu không được điều

trị bằng thuốc ức chế miễn dịch và thuốc độc tế

bào thích hợp để tạm thời kiểm soát bệnh. Hiện

nay, ghép tế bào gốc tạo máu được coi là

phương cách duy nhất có khả năng chữa khỏi

bệnh(6).

Chẩn đoán sớm HCTBM rất quan trọng vì

điều trị ưu tiên hàng đầu là ghép tế bào gốc mà

dự hậu của bệnh nhân tùy thuộc vào thời gian

từ khi mắc bệnh đến được ghép(8). Theo tiêu

chuẩn chẩn đoán HCTBM mới(5), một chẩn đoán

di truyền phân tử phù hợp là đủ cho một chẩn

đoán xác định bệnh. HCTBM được phân thành

ít nhất 5 nhóm theo bất thường của các gen

HPLH1, perforin, UNC13D, STX11 và STXBP2.

Mặc dù đột biến gen perforin chiếm tỷ lệ cao

trong nhóm bệnh nhân thuộc các chủng tộc khác nhau như Nhật Bản, Thổ Nhĩ Kỳ, Italia, Bắc

Mỹ(3), nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy đột biến gen này đóng vai trò rất nhỏ trong HCTBM ở người Việt Nam, với chỉ 1 trong 21 bệnh nhân có mang đột biến(7). Nhằm tiếp tục tìm hiểu cơ chế phân tử của HCTBM trên bệnh nhân Việt nam, chúng tôi tiến hành khảo sát đột

biến gen UNC13D trên những bệnh nhân không

có đột biến gen perforin.

ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu

10 bệnh nhi được chẩn đoán hội chứng thực bào máu theo tiêu chuẩn HLH‐2004 của Henter

và cộng sự(5). Các bệnh nhân này đã được xác

định không có đột biến gen perforin trong nghiên

cứu trước đây(7). Phân tích đột biến gen UNC13D

được phối hợp thực hiện tại Trung tâm Y sinh học phân tử ‐ Đại học Y Dược TPHCM và Khoa

Di truyền học Phân Tử ‐ Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM

Tách chiết genomic DNA

Chúng tôi dùng QIAamp DNA Kit (Qiagen, Mỹ) để tách chiết genomic DNA từ 200 μL máu ngoại vi theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA

RNA được tách chiết từ 5 mL máu ngoại vi bằng RNeasy mini Kit (Qiagen, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. RNA được đo nồng độ bằng máy quang phổ kế spectrophotometer. cDNA được tổng hợp từ 1 μg RNA với bộ hóa chất SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Mỹ).

Thiết kế mồi cho PCR (polymerase chain reaction)

Các đoạn mồi được thiết kế bằng phần mềm Oligo 4.1 dựa trên trình tự chuẩn của UNC13D mang

accession number NG_007266 trong GenBank. Thông tin về các đoạn mồi được trình bày trong Bảng

1.

Bảng 1: Thông tin về các đoạn mồi dùng trong PCR.

Tên Trình tự (5’ -3’) Vùng gen được khuếch đại Sản phẩm PCR (bp) UNC-g1F ATAATCCTGTGGCTTCGCTG

Exon 1 – 6 (genomic DNA) 2059 UNC-g6R AGGACGACCTACTCATCTCA

UNC-g7F TGTGGTCACTTACTGCTTCG Exon 7 – 12 (genomic DNA) 1343

Trang 4

UNC-g12R CAAAGGGAACTCTGCTGAGA

UNC-g13F TCAGCCTGTACTGGTGGATG

Exon 13 – 20 (genomic DNA) 1700 UNC-g20R ACTACGCTTTGGAGGTCCAG

UNC-g21F TCTGTGCCTGGTGATGGTAG

Exon 21 – 25 (genomic DNA) 2288 UNC-g25R TACACCCCTCAGAACGGATG

UNC-g26F CGTCTTTGCTTCCTCCTCCG

Exon 26 – 32 (genomic DNA) 3526 UNC-R6 GGGAAGCCCCAGACCCTACA

UNC-F1 CTTCGCTGTCTTCACCCAG Exon 1 – 12 (RNA)

1061 UNC-R2 AAAGAGGACGGTGGCAGCCT

UNC-F3 ACGAGGTCACCCAGCACGAG Exon 12 – 21 (RNA)

1158 UNC-R4 TGTTGGCTGCCTGGCCTTGG

UNC-F4 CTTGCTGGGCCTGGTACAGG Exon 17 – 32 (RNA)

1879 UNC-R6 GGGAAGCCCCAGACCCTACA

Thực hiện PCR

Trong mỗi tube PCR có tổng thể tích 25 μL,

các thành phần gồm có PCR buffer, dNTP (250

μM cho mỗi loại), 2 loại mồi xuôi và ngược (0,5

μM cho mỗi loại), TaKaRa TaqTM HotStart

Polymerase (1,25 unit) và 20 ng genomic DNA

hoặc cDNA. Chu kỳ luân nhiệt được thực hiện

trên máy GeneAmp® PCR system 9700 (Applied

Biosystems, Mỹ) bao gồm giai đoạn biến tính

ban đầu ở 980C trong 2 phút, theo sau bằng 40

chu kỳ gồm biến tính ở 980C trong 10 giây, gắn

mồi ở 600C trong 20 giây, tổng hợp chuỗi DNA ở

720C trong 2 phút và kết thúc bằng giai đoạn kéo

dài sản phẩm ở 720C trong 5 phút. Riêng PCR

của cặp mồi UNC‐g26F và UNC‐R6 (exon 26 –

32) được thực hiện gắn mồi và tổng hợp chuỗi

DNA ở 680C trong 3 phút. Sản phẩm PCR được

phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 1,2%

có nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới

màn soi gel Pringraph (Atto, Nhật Bản), tinh

sạch bằng QIAquick Gel Extraction kit và được

kiểm tra lại bằng điện di trên thạch agarose

1,2%.

Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA

Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được

thực hiện phản ứng cycle sequencing với

BigDye V3.1 từ Applied Biosystems, theo 2

chiều xuôi và ngược cho mỗi exon. Sản phẩm

sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan trong

Hi‐Di formamide, biến tính ở 950C trong 2 phút

trước khi làm lạnh đột ngột. Trình tự DNA được

đọc bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với

POP‐7 polymer và capillary 80 cm (Applied Biosystems, Mỹ). Kết quả được phân tích bằng phần mềm SeqScape. Số thứ tự của các nucleotide được tính theo chuỗi cDNA bình

thường của UNC13D mang accession number

NG_007266 trong GenBank. Thuật ngữ dùng để

mô tả các thay đổi trình tự DNA dựa theo den Dunen và cộng sự(1). Adenine đầu tiên của mã khởi đầu ATG mang số +1, “c.” để chỉ cDNA,

“IVS” chỉ intron: G của GT đầu tiên trong intron mang số +1, G của AG cuối cùng trong intron mang số ‐1.

KẾT QUẢ Xây dựng kỹ thuật giải trình tự DNA của gen UNC13D

Gen UNC13D gồm 32 exon với tổng chiều

dài khoảng 17,5 kb. Để khuếch đại toàn bộ 32 exon và vùng tiếp giáp exon – intron của genomic DNA, chúng tôi thiết kế 5 cặp mồi, với các sản phẩm PCR trong khoảng 1343 – 3526 bp. Hình 1A cho thấy mỗi cặp mồi đã khuếch đại đặc hiệu các vùng exon – intron của gen

UNC13D.

Phản ứng reverse transcriptase PCR cũng được thực hiện để kiểm tra đột biến ở mức RNA. Trong hình 1B, các đoạn cDNA đã được khuếch đại với kích thước tương ứng 1061, 1158

và 1879 bp.

Trang 5

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Nghiên cứu Y học

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh

153

Các sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch

đã được tiến hành giải trình tự chuỗi DNA để

xác định các thay đổi trên gen UNC13D. Toàn bộ

các kết quả giải trình tự chuỗi DNA đều cho kết

quả đặc hiệu với các vùng gen UNC13D đã được

khuếch đại.

Phát hiện đột biến gen UNC13D trên bệnh

nhân hội chứng thực bào máu

Do hạn chế của kinh phí và thời gian, chúng

tôi chỉ tiến hành khảo sát đột biến gen UNC13D

trên 10 bệnh nhân đã được loại trừ đột biến gen

perforin. Có tất cả 26 kiểu thay đổi trên exon và

intron được phát hiện (Bảng 2). Hầu hết các thay

đổi này là những SNP đã được báo cáo trước

đây(13), ngoại trừ thay đổi IVS26+5C>G thuộc

intron 26 và thay đổi c.3151G>A thuộc exon 31.

Chúng tôi không thể thực hiện khảo sát ở mức

RNA cho bệnh nhân có IVS26+5C>G do không

có mẫu dự trữ thích hợp cho nghiên cứu tiếp

theo.

Bảng 2: Các thay đổi của gen UNC13D được phát

hiện trong nghiên cứu này.

Thay đổi

nucleotide

Vị trí Thay đổi

amino acid

Số trường hợp (n = 10)

IVS1+30G>A Intron 1 3

IVS1+59C>T Intron 1 3

IVS2-19G>A Intron 2 2

IVS2-16G>A Intron 2 1

IVS3+26C>G Intron 3 2

c.279C>T Exon 4 Pro93Pro 2

c.888G>C Exon 11 Pro296Pro 1

IVS12-13C>T Intron 12 3 IVS18+36A>G Intron 18 3 IVS19+70T>C Intron 19 3 c.1744C>T Exon 20 Leu582Leu 1 c.1977C>T Exon 21 Thr659Thr 2 IVS21+5G>A Intron 21 1 IVS23-46C>T Intron 23 3 IVS25-8delC Intron 25 3 IVS26+5C>G Intron 26 1 c.2599A>G Exon 27 Lys867Glu 1 IVS28+48C>T Intron 28 2 IVS29+37C>G Intron 29 1 c.3151G>A Exon 31 Chưa rõ 2 IVS31+82G>A Intron 31 1 c.3198A>G Exon 32 Glu1066Glu 3 Trong 2 bệnh nhân có thay đổi c.3151G>A, chúng tôi đã tiến hành khảo sát được bất thường

ở mức RNA cho một bệnh nhân. Hình 2 cho thấy có sự cắt bỏ exon 31 trong bản phiên mã RNA của bệnh nhân này. Hậu quả là protein bị đột biến có 13 amino acid mới được tạo trước khi có hiện tượng cắt bỏ phần đuôi carboxyl.

BÀN LUẬN

Đột biến gen UNC13D lần đầu tiên được mô

tả vào năm 2003 trên những bệnh nhân bị

Trang 6

HCTBM(2). Các nghiên cứu tại nhiều nước, bao

gồm Hàn Quốc(12) và Nhật Bản(11) cho thấy đột

biến UNC13D đóng vai trò nguyên nhân quan

trọng trong HCTBM. Nghiên cứu của chúng tôi

lần đầu tiên mô tả đột biến gen UNC13D trên

bệnh nhân trẻ em Việt Nam. Các thay đổi của

gen UNC13D được chúng tôi phát hiện rất đa

dạng và phức tạp, xảy ra dọc chiều dài gen,

thuộc cả vùng exon và intron. Vì đột biến không

tập trung vào vùng nào nhất định nên việc xác

định được đột biến đòi hỏi phải khảo sát toàn bộ

chiều dài gen, bao gồm 32 exon và vùng exon –

intron, bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA.

Theo các tác giả Nhật Bản, cần 28 cặp mồi để

khuếch đại gen UNC13D(11). Nhờ việc thiết kế

các cặp mồi thích hợp có thể tạo ra những sản

phẩm PCR dài trên 3 kb, chúng tôi đã khuếch

đại toàn bộ 32 exon của gen UNC13D chỉ bằng 5

cặp mồi đặc hiệu.

Trong 10 bệnh nhân, chúng tôi phát hiện 2

trường hợp có đột biến c.3151G>A thuộc exon

31. Đây là đột biến mới, chưa từng được báo cáo

trong các nghiên cứu trước đây. Đột biến này đã

được khẳng định lại ở mức RNA, với sự trượt

mất exon 31, gây phá vỡ khung đọc giải mã.

Protein bị đột biến không có đầy đủ chức năng

trong tế bào do thiếu đuôi carboxyl. Như vậy,

bản chất của đột biến này là sự khiếm khuyết

trong quá trình tạo RNA trong tế bào miễn dịch,

với sự ghép nối exon không hoàn hảo. Phát hiện

của chúng tôi phù hợp với các kết quả nghiên

cứu trước đây của các tác giả nước ngoài khi

thấy rằng phần lớn các đột biến gen UNC13D

ảnh hưởng trên quá trình hình thành RNA(9,10,12).

Trong số những thay đổi khác của UNC13D mà

chúng tôi phát hiện trong nghiên cứu này,

IVS1+59C>T được một số tác giả coi là đột biến

vì tạo nên vị trí tiếp nhận exon mới(10), nhưng

cũng có nghiên cứu khác chứng minh đây chỉ là

SNP không có ý nghĩa gây bệnh, với mã số

rs3744010. Trên 3 bệnh nhân có IVS1+59C>T,

chúng tôi đã khảo sát mức RNA nhưng không

phát hiện được bất thường nào. Kết quả của

chúng tôi ủng hộ nhận định IVS1+59C>T chỉ là

một dạng SNP trong HCTBM.

Thay đổi IVS26+5C>G chỉ được phát hiện trên 1 bệnh nhân. Chúng tôi không thấy có nghiên cứu nào trước đây từng mô tả bất thường này. Tuy nhiên, vì không có mẫu RNA

để khảo sát thêm nên chưa thể khẳng định bất thường ở vùng intron 26 này có ảnh hưởng lên

sự ghép nối exon hay không. Để có thể khẳng định đây là đột biến mới hay chỉ là một SNP cần khảo sát thêm trên những mẫu chứng của người khỏe mạnh để có tần suất phân bố alen tương ứng tại vị trí ‐5 của intron này.

KẾT LUẬN

Chúng tôi đã ứng dụng thành công kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA để phát hiện 2 bệnh

nhân có đột biến gen UNC13D trong số 10 bệnh

nhân được khảo sát. Cần có nghiên cứu với số mẫu lớn hơn để biết được phổ đột biến gen này trên bệnh nhân HCTBM tại Việt Nam, góp phần hữu ích cho công tác chẩn đoán chính xác và quyết định điều trị hợp lý hơn cho bệnh nhân.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

nomenclature extensions and suggestions to describe complex mutations: a discussion. Hum Mutat;15(1):7‐12.

C, et al (2003). Munc13‐4 is essential for cytolytic granules fusion and is mutated in a form of familial hemophagocytic lymphohistiocytosis (FHL3). Cell;115(4):461‐73.

Familial haemophagocytic lymphohistiocytosis: advances in the genetic basis, diagnosis and management. Clin Exp Immunol;163(3):271‐83.

hemophagocytic lymphohistiocytosis. Hematol Oncol Clin North Am;12(2):417‐33.

Imashuku S, et al (2007). HLH‐2004: Diagnostic and

lymphohistiocytosis. Pediatr Blood Cancer;48(2):124‐31.

G, Filipovich AH, et al (2007). Treatment of hemophagocytic lymphohistiocytosis with HLH‐94 immunochemotherapy and bone marrow transplantation. Blood;100(7):2367‐73.

(2012). Phát hiện đột biến gen perforin gây hội chứng thực bào máu ở trẻ em bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA. Y học Việt Nam;396:152‐157.

Ladisch S, et al (2005). Haematopoietic stem cell transplantation in haemophagocytic lymphohistiocytosis. Br J Haematol;129(5):622‐30.

Trang 7

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Nghiên cứu Y học

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh

155

lymphohistiocytosis type 3 (FHL3) caused by deep intronic

mutation and inversion in UNC13D. Blood;118(22):5783‐93.

10 Santoro A, Cannella S, Trizzino A, Bruno G, De Fusco C,

Notarangelo LD, et al (2008). Mutations affecting mRNA

splicing are the most common molecular defect in patients

with familial hemophagocytic lymphohistiocytosis type 3.

Haematologica;93(7):1086‐90.

11 Yamamoto K, Ishii E, Sako M, Ohga S, Furuno K, Suzuki N, et

al (2004). Identification of novel MUNC13‐4 mutations in

familial haemophagocytic lymphohistiocytosis and functional

analysis of MUNC13‐4‐deficient cytotoxic T lymphocytes. J

Med Genet;41(10):763‐7.

12 Yoon HS, Kim HJ, Yoo KH, Sung KW, Koo HH, Kang HJ, et al (2010). UNC13D is the predominant causative gene with recurrent splicing mutations in Korean patients with familial

Haematologica;95(4):622‐6.

13 Zhang K, Biroschak J, Glass DN, Thompson SD, Finkel T, Passo MH, et al (2008). Macrophage activation syndrome in patients with systemic juvenile idiopathic arthritis is associated with MUNC13‐4 polymorphisms. Arthritis Rheum;58(9):2892‐

6.

Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20‐06‐2013

Định dạng
Số trang	7
Dung lượng	471,09 KB