Bài viết giới thiệu đến: Hội chứng thực bào máu (HCTBM) nguyên phát ở trẻ em thường do đột biến gen gây nên. Trong một nghiên cứu trước đây trên 21 bệnh nhân trẻ em, chỉ phát hiện 1 trường hợp có đột biến gen perforin. Vì vậy, nghiên cứu này nhằm khảo sát đột biến gen UNC13D trên 10 bệnh nhân không có đột biến perforin.
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN UNC13D GÂY HỘI CHỨNG THỰC BÀO MÁU Ở TRẺ EM BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA Hồng Anh Vũ*, Nguyễn Văn Tân Minh**, Phan Thị Xinh*** TĨM TẮT Giới thiệu: Hội chứng thực bào máu (HCTBM) ngun phát ở trẻ em thường do đột biến gen gây nên. Trong một nghiên cứu trước đây trên 21 bệnh nhân trẻ em, chúng tơi chỉ phát hiện 1 trường hợp có đột biến gen perforin. Mục tiêu: Nghiên cứu này nhằm khảo sát đột biến gen UNC13D trên 10 bệnh nhân khơng có đột biến perforin. Đối tượng và phương pháp: Tồn bộ 32 exon và vùng tiếp giáp exon – intron của gen UNC13D đã được khuếch đại và giải trình tự chuỗi DNA. Kết quả: Chúng tơi phát hiện 2 trường hợp có đột biến điểm c.3151G>A ở exon 31 trên genomic DNA. Đột biến tạo nên RNA khơng tồn vẹn do exon 30 nối trực tiếp với exon 32. Ngồi ra còn có 25 dạng đa hình thái đơn nucleotide được phát hiện. Kết luận: Nghiên cứu trên số mẫu lớn hơn để hiểu rõ phổ đột biến gen UNC13D trên bệnh nhân Việt Nam nên tiếp tục được tiến hành. Từ khóa: hội chứng thực bào máu, đột biến gen UNC13D, giải trình tự chuỗi DNA ABSTRACT DETECTION OF UNC13D MUTATIONS IN PEDIATRIC PATIENTS WITH HEMOPHAGOCYTIC LYMPHOHISTIOCYTOSIS BY DNA SEQUENCING Hoang Anh Vu, Nguyen Van Tan Minh, Phan Thi Xinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 3 ‐ 2013: 150 ‐ 155 Introduction: Hemophagocytic lymphohistiocytosis, also known as hemophagocytic syndrome, in early childhood are commonly caused by gene mutations. In a previous study, we found only one performing mutation among 21 pediatric patients. Objective: In the present study, UNC13D mutations were analyzed in 10 wild type‐performing patients. Patients and methods: Full length of UNC13D including 32 exons and exon‐intron boundaries were amplified and directly sequenced. Results: Two out of ten patients had a point mutation c.3151G>A in exon 31. This mutation led to an abnormal transcript where exon 30 joined up with exon 32. Moreover, we detected 25 single nucleotide polymorphisms along the gen. Conclusion: Further study with more samples needs to be done to know the spectrum of UNC13D mutations in Vietnamese patients. Key words: hemophagocytic lymphohistiocytosis, UNC13D gene mutation, DNA sequencing * Trung tâm Y sinh học phân tử, Đại học Y Dược TPHCM ** Khoa Xét Nghiệm Huyết học, Bệnh viện Nhi Đồng II TPHCM *** Bộ mơn Huyết học, Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: TS.BS. Hồng Anh Vũ, ĐT: 0122‐2993537, email: hoangvuxinh@yahoo.com 150 Chun Đề Giải Phẫu Bệnh Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng thực bào máu (HCTBM; hemophagocytic lymphohistiocytosis hay hemophagocytic syndrome) ở trẻ em là một dạng rối loạn di truyền được đặc trưng bởi hội chứng viêm thái quá, với sốt, gan – lách to, giảm tế bào máu ngoại biên và có thể biểu hiện triệu chứng thần kinh trung ương đi kèm(4). Dù có nhiều nguyên nhân khác nhau, những biểu hiện lâm sàng ồ ạt của hiện tượng viêm đa hệ thống và diễn tiến tử vong nhanh chóng đối với HCTBM không được điều trị đã thu hút sự quan tâm của những chuyên gia về huyết học, miễn dịch, bệnh truyền nhiễm và di truyền học. Đến nay, HCTBM vẫn còn được xem là một thử thách đối với những nhà khoa học trong việc tìm hiểu sự hình thành cũng như các bất thường của q trình điều hòa phản ứng viêm miễn dịch trong cơ thể con người. Bệnh diễn tiến đến tử vong trong vòng vài tuần nếu khơng được điều trị bằng thuốc ức chế miễn dịch và thuốc độc tế bào thích hợp để tạm thời kiểm sốt bệnh. Hiện nay, ghép tế bào gốc tạo máu được coi là phương cách duy nhất có khả năng chữa khỏi bệnh(6). Chẩn đoán sớm HCTBM rất quan trọng vì điều trị ưu tiên hàng đầu là ghép tế bào gốc mà dự hậu của bệnh nhân tùy thuộc vào thời gian từ khi mắc bệnh đến được ghép(8). Theo tiêu chuẩn chẩn đốn HCTBM mới(5), một chẩn đốn di truyền phân tử phù hợp là đủ cho một chẩn đốn xác định bệnh. HCTBM được phân thành ít nhất 5 nhóm theo bất thường của các gen HPLH1, perforin, UNC13D, STX11 và STXBP2. Mặc dù đột biến gen perforin chiếm tỷ lệ cao trong nhóm bệnh nhân thuộc các chủng tộc khác nhau như Nhật Bản, Thổ Nhĩ Kỳ, Italia, Bắc Mỹ(3), nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy đột biến gen này đóng vai trò rất nhỏ trong HCTBM ở người Việt Nam, với chỉ 1 trong 21 bệnh nhân có mang đột biến(7). Nhằm tiếp tục tìm hiểu cơ chế phân tử của HCTBM trên bệnh nhân Việt nam, chúng tơi tiến hành khảo sát đột biến gen UNC13D trên những bệnh nhân khơng có đột biến gen perforin. ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 10 bệnh nhi được chẩn đốn hội chứng thực bào máu theo tiêu chuẩn HLH‐2004 của Henter và cộng sự(5). Các bệnh nhân này đã được xác định khơng có đột biến gen perforin trong nghiên cứu trước đây(7). Phân tích đột biến gen UNC13D được phối hợp thực hiện tại Trung tâm Y sinh học phân tử ‐ Đại học Y Dược TPHCM và Khoa Di truyền học Phân Tử ‐ Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM Tách chiết genomic DNA Chúng tôi dùng QIAamp DNA Kit (Qiagen, Mỹ) để tách chiết genomic DNA từ 200 μL máu ngoại vi theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA RNA được tách chiết từ 5 mL máu ngoại vi bằng RNeasy mini Kit (Qiagen, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. RNA được đo nồng độ bằng máy quang phổ kế spectrophotometer. cDNA được tổng hợp từ 1 μg RNA với bộ hóa chất SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Mỹ). Thiết kế mồi cho PCR (polymerase chain reaction) Các đoạn mồi được thiết kế bằng phần mềm Oligo 4.1 dựa trên trình tự chuẩn của UNC13D mang accession number NG_007266 trong GenBank. Thơng tin về các đoạn mồi được trình bày trong Bảng 1. Bảng 1: Thơng tin về các đoạn mồi dùng trong PCR. Tên UNC-g1F UNC-g6R UNC-g7F 94 Trình tự (5’ -3’) ATAATCCTGTGGCTTCGCTG AGGACGACCTACTCATCTCA TGTGGTCACTTACTGCTTCG Vùng gen khuếch đại Sản phẩm PCR (bp) Exon – (genomic DNA) 2059 Exon – 12 (genomic DNA) 1343 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh Nghiên cứu Y học UNC-g12R UNC-g13F UNC-g20R UNC-g21F UNC-g25R UNC-g26F UNC-R6 UNC-F1 UNC-R2 UNC-F3 UNC-R4 UNC-F4 UNC-R6 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 CAAAGGGAACTCTGCTGAGA TCAGCCTGTACTGGTGGATG ACTACGCTTTGGAGGTCCAG TCTGTGCCTGGTGATGGTAG TACACCCCTCAGAACGGATG CGTCTTTGCTTCCTCCTCCG GGGAAGCCCCAGACCCTACA CTTCGCTGTCTTCACCCAG AAAGAGGACGGTGGCAGCCT ACGAGGTCACCCAGCACGAG TGTTGGCTGCCTGGCCTTGG CTTGCTGGGCCTGGTACAGG GGGAAGCCCCAGACCCTACA Thực hiện PCR Trong mỗi tube PCR có tổng thể tích 25 μL, các thành phần gồm có PCR buffer, dNTP (250 μM cho mỗi loại), 2 loại mồi xuôi và ngược (0,5 μM cho mỗi loại), TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (1,25 unit) và 20 ng genomic DNA hoặc cDNA. Chu kỳ luân nhiệt được thực hiện trên máy GeneAmp® PCR system 9700 (Applied Biosystems, Mỹ) bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu ở 980C trong 2 phút, theo sau bằng 40 chu kỳ gồm biến tính ở 980C trong 10 giây, gắn mồi ở 600C trong 20 giây, tổng hợp chuỗi DNA ở 720C trong 2 phút và kết thúc bằng giai đoạn kéo dài sản phẩm ở 720C trong 5 phút. Riêng PCR của cặp mồi UNC‐g26F và UNC‐R6 (exon 26 – 32) được thực hiện gắn mồi và tổng hợp chuỗi DNA ở 680C trong 3 phút. Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 1,2% có nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới màn soi gel Pringraph (Atto, Nhật Bản), tinh sạch bằng QIAquick Gel Extraction kit và được kiểm tra lại bằng điện di trên thạch agarose 1,2%. Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được thực hiện phản ứng cycle sequencing với BigDye V3.1 từ Applied Biosystems, theo 2 chiều xuôi và ngược cho mỗi exon. Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan trong Hi‐Di formamide, biến tính ở 950C trong 2 phút trước khi làm lạnh đột ngột. Trình tự DNA được đọc bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với Exon 13 – 20 (genomic DNA) 1700 Exon 21 – 25 (genomic DNA) 2288 Exon 26 – 32 (genomic DNA) 3526 Exon – 12 (RNA) Exon 12 – 21 (RNA) Exon 17 – 32 (RNA) 1061 1158 1879 POP‐7 polymer và capillary 80 cm (Applied Biosystems, Mỹ). Kết quả được phân tích bằng phần mềm SeqScape. Số thứ tự của các nucleotide được tính theo chuỗi cDNA bình thường của UNC13D mang accession number NG_007266 trong GenBank. Thuật ngữ dùng để mơ tả các thay đổi trình tự DNA dựa theo den Dunen và cộng sự(1). Adenine đầu tiên của mã khởi đầu ATG mang số +1, “c.” để chỉ cDNA, “IVS” chỉ intron: G của GT đầu tiên trong intron mang số +1, G của AG cuối cùng trong intron mang số ‐1. KẾT QUẢ Xây dựng kỹ thuật giải trình tự DNA của gen UNC13D Gen UNC13D gồm 32 exon với tổng chiều dài khoảng 17,5 kb. Để khuếch đại toàn bộ 32 exon và vùng tiếp giáp exon – intron của genomic DNA, chúng tôi thiết kế 5 cặp mồi, với các sản phẩm PCR trong khoảng 1343 – 3526 bp. Hình 1A cho thấy mỗi cặp mồi đã khuếch đại đặc hiệu các vùng exon – intron của gen UNC13D. Phản ứng reverse transcriptase PCR cũng được thực hiện để kiểm tra đột biến ở mức RNA. Trong hình 1B, các đoạn cDNA đã được khuếch đại với kích thước tương ứng 1061, 1158 và 1879 bp. 152 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Các sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch đã được tiến hành giải trình tự chuỗi DNA để xác định các thay đổi trên gen UNC13D. Tồn bộ các kết quả giải trình tự chuỗi DNA đều cho kết quả đặc hiệu với các vùng gen UNC13D đã được khuếch đại. Phát hiện đột biến gen UNC13D trên bệnh nhân hội chứng thực bào máu Do hạn chế của kinh phí và thời gian, chúng tơi chỉ tiến hành khảo sát đột biến gen UNC13D trên 10 bệnh nhân đã được loại trừ đột biến gen perforin. Có tất cả 26 kiểu thay đổi trên exon và intron được phát hiện (Bảng 2). Hầu hết các thay đổi này là những SNP đã được báo cáo trước đây(13), ngoại trừ thay đổi IVS26+5C>G thuộc intron 26 và thay đổi c.3151G>A thuộc exon 31. Chúng tôi không thể thực hiện khảo sát ở mức RNA cho bệnh nhân có IVS26+5C>G do khơng có mẫu dự trữ thích hợp cho nghiên cứu tiếp theo. IVS12-13C>T IVS18+36A>G IVS19+70T>C c.1744C>T c.1977C>T IVS21+5G>A IVS23-46C>T IVS25-8delC IVS26+5C>G c.2599A>G IVS28+48C>T IVS29+37C>G c.3151G>A IVS31+82G>A c.3198A>G Nghiên cứu Y học Intron 12 Intron 18 Intron 19 Exon 20 Exon 21 Intron 21 Intron 23 Intron 25 Intron 26 Exon 27 Intron 28 Intron 29 Exon 31 Intron 31 Exon 32 Leu582Leu Thr659Thr Lys867Glu Chưa rõ Glu1066Glu 3 3 1 2 Trong 2 bệnh nhân có thay đổi c.3151G>A, chúng tơi đã tiến hành khảo sát được bất thường ở mức RNA cho một bệnh nhân. Hình 2 cho thấy có sự cắt bỏ exon 31 trong bản phiên mã RNA của bệnh nhân này. Hậu quả là protein bị đột biến có 13 amino acid mới được tạo trước khi có hiện tượng cắt bỏ phần đi carboxyl. Bảng 2: Các thay đổi của gen UNC13D được phát hiện trong nghiên cứu này. Thay đổi nucleotide IVS1+30G>A IVS1+59C>T IVS2+67C>T IVS2-19G>A IVS2-16G>A IVS3+26C>G IVS3+69G>A c.279C>T IVS5+81G>A IVS5+122C>T c.888G>C Vị trí Intron Intron Intron Intron Intron Intron Intron Exon Intron Intron Exon 11 Thay đổi Số trường amino acid hợp (n = 10) 3 2 Pro93Pro 1 Pro296Pro 153 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh BÀN LUẬN Đột biến gen UNC13D lần đầu tiên được mô tả vào năm 2003 trên những bệnh nhân bị Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 HCTBM(2). Các nghiên cứu tại nhiều nước, bao gồm Hàn Quốc(12) và Nhật Bản(11) cho thấy đột biến UNC13D đóng vai trò ngun nhân quan trọng trong HCTBM. Nghiên cứu của chúng tôi lần đầu tiên mô tả đột biến gen UNC13D trên bệnh nhân trẻ em Việt Nam. Các thay đổi của gen UNC13D được chúng tôi phát hiện rất đa dạng và phức tạp, xảy ra dọc chiều dài gen, thuộc cả vùng exon và intron. Vì đột biến khơng tập trung vào vùng nào nhất định nên việc xác định được đột biến đòi hỏi phải khảo sát tồn bộ chiều dài gen, bao gồm 32 exon và vùng exon – intron, bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA. Theo các tác giả Nhật Bản, cần 28 cặp mồi để khuếch đại gen UNC13D(11). Nhờ việc thiết kế các cặp mồi thích hợp có thể tạo ra những sản phẩm PCR dài trên 3 kb, chúng tơi đã khuếch đại tồn bộ 32 exon của gen UNC13D chỉ bằng 5 cặp mồi đặc hiệu. Trong 10 bệnh nhân, chúng tơi phát hiện 2 trường hợp có đột biến c.3151G>A thuộc exon 31. Đây là đột biến mới, chưa từng được báo cáo trong các nghiên cứu trước đây. Đột biến này đã được khẳng định lại ở mức RNA, với sự trượt mất exon 31, gây phá vỡ khung đọc giải mã. Protein bị đột biến khơng có đầy đủ chức năng trong tế bào do thiếu đuôi carboxyl. Như vậy, bản chất của đột biến này là sự khiếm khuyết trong q trình tạo RNA trong tế bào miễn dịch, với sự ghép nối exon khơng hồn hảo. Phát hiện của chúng tôi phù hợp với các kết quả nghiên cứu trước đây của các tác giả nước ngoài khi thấy rằng phần lớn các đột biến gen UNC13D ảnh hưởng trên quá trình hình thành RNA(9,10,12). Trong số những thay đổi khác của UNC13D mà chúng tơi phát hiện trong nghiên cứu này, IVS1+59C>T được một số tác giả coi là đột biến vì tạo nên vị trí tiếp nhận exon mới(10), nhưng cũng có nghiên cứu khác chứng minh đây chỉ là SNP khơng có ý nghĩa gây bệnh, với mã số rs3744010. Trên 3 bệnh nhân có IVS1+59C>T, chúng tơi đã khảo sát mức RNA nhưng không phát hiện được bất thường nào. Kết quả của chúng tôi ủng hộ nhận định IVS1+59C>T chỉ là một dạng SNP trong HCTBM. Thay đổi IVS26+5C>G chỉ được phát hiện trên 1 bệnh nhân. Chúng tơi khơng thấy có nghiên cứu nào trước đây từng mơ tả bất thường này. Tuy nhiên, vì khơng có mẫu RNA để khảo sát thêm nên chưa thể khẳng định bất thường ở vùng intron 26 này có ảnh hưởng lên sự ghép nối exon hay khơng. Để có thể khẳng định đây là đột biến mới hay chỉ là một SNP cần khảo sát thêm trên những mẫu chứng của người khỏe mạnh để có tần suất phân bố alen tương ứng tại vị trí ‐5 của intron này. KẾT LUẬN Chúng tơi đã ứng dụng thành cơng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA để phát hiện 2 bệnh nhân có đột biến gen UNC13D trong số 10 bệnh nhân được khảo sát. Cần có nghiên cứu với số mẫu lớn hơn để biết được phổ đột biến gen này trên bệnh nhân HCTBM tại Việt Nam, góp phần hữu ích cho cơng tác chẩn đốn chính xác và quyết định điều trị hợp lý hơn cho bệnh nhân. TÀI LIỆU THAM KHẢO den Dunnen JT, Antonarakis SE (2000). Mutation nomenclature extensions and suggestions to describe complex mutations: a discussion. Hum Mutat;15(1):7‐12. Feldmann J, Callebaut I, Raposo G, Certain S, Bacq D, Dumont C, et al (2003). Munc13‐4 is essential for cytolytic granules fusion and is mutated in a form of familial hemophagocytic lymphohistiocytosis (FHL3). Cell;115(4):461‐73. Gholam C, Grigoriadou S, Gilmour KC, Gaspar HB (2011) Familial haemophagocytic lymphohistiocytosis: advances in the genetic basis, diagnosis and management. Clin Exp Immunol;163(3):271‐83. Henter JI, Arico M, Elinder G, Imashuku S, Janka G. (1998). Familial hemophagocytic lymphohistiocytosis. Primary hemophagocytic lymphohistiocytosis. Hematol Oncol Clin North Am;12(2):417‐33. Henter JI, Horne A, Arico M, Egeler RM, Filipovich AH, Imashuku S, et al (2007). HLH‐2004: Diagnostic and therapeutic guidelines for hemophagocytic lymphohistiocytosis. Pediatr Blood Cancer;48(2):124‐31. Henter JI, Samuelsson‐Horne A, Arico M, Egeler RM, Elinder G, Filipovich AH, et al (2007). Treatment of hemophagocytic lymphohistiocytosis with HLH‐94 immunochemotherapy and bone marrow transplantation. Blood;100(7):2367‐73. Hoàng Anh Vũ, Nguyễn Văn Tân Minh, Phan Thị Xinh. (2012). Phát hiện đột biến gen perforin gây hội chứng thực bào máu ở trẻ em bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA. Y học Việt Nam;396:152‐157. Horne A, Janka G, Maarten Egeler R, Gadner H, Imashuku S, Ladisch S, et al (2005). Haematopoietic stem cell transplantation in haemophagocytic lymphohistiocytosis. Br J Haematol;129(5):622‐30. 154 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 10 11 Meeths M, Chiang SC, Wood SM, Entesarian M, Schlums H, Bang B, et al (2011). Familial hemophagocytic lymphohistiocytosis type 3 (FHL3) caused by deep intronic mutation and inversion in UNC13D. Blood;118(22):5783‐93. Santoro A, Cannella S, Trizzino A, Bruno G, De Fusco C, Notarangelo LD, et al (2008). Mutations affecting mRNA splicing are the most common molecular defect in patients with familial hemophagocytic lymphohistiocytosis type 3. Haematologica;93(7):1086‐90. Yamamoto K, Ishii E, Sako M, Ohga S, Furuno K, Suzuki N, et al (2004). Identification of novel MUNC13‐4 mutations in familial haemophagocytic lymphohistiocytosis and functional analysis of MUNC13‐4‐deficient cytotoxic T lymphocytes. J Med Genet;41(10):763‐7. 155 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 12 13 Nghiên cứu Y học Yoon HS, Kim HJ, Yoo KH, Sung KW, Koo HH, Kang HJ, et al (2010). UNC13D is the predominant causative gene with recurrent splicing mutations in Korean patients with familial hemophagocytic lymphohistiocytosis. Haematologica;95(4):622‐6. Zhang K, Biroschak J, Glass DN, Thompson SD, Finkel T, Passo MH, et al (2008). Macrophage activation syndrome in patients with systemic juvenile idiopathic arthritis is associated with MUNC13‐4 polymorphisms. Arthritis Rheum;58(9):2892‐ 6. Ngày nhận bài báo Ngày phản biện nhận xét bài báo: Ngày bài báo được đăng: 16‐06‐2013 20‐06‐2013 15–07‐2013 ... xác định các thay đổi trên gen UNC13D. Tồn bộ các kết quả giải trình tự chuỗi DNA đều cho kết quả đặc hiệu với các vùng gen UNC13D đã được khuếch đại. Phát hiện đột biến gen UNC13D trên bệnh nhân hội chứng thực bào máu ... ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng thực bào máu (HCTBM; hemophagocytic lymphohistiocytosis hay hemophagocytic syndrome) ở trẻ em là một dạng rối loạn di truyền được đặc trưng bởi hội chứng viêm thái quá, với sốt, gan – lách to, giảm ... ứng tại vị trí ‐5 của intron này. KẾT LUẬN Chúng tơi đã ứng dụng thành cơng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA để phát hiện 2 bệnh nhân có đột biến gen UNC13D trong số 10 bệnh nhân được khảo sát. Cần