Khảo sát đột biến CALR trên bệnh nhân xơ tủy nguyên phát bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA

Bài viết tiến hành nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA exon 9 của gen CALR để khảo sát đột biến, góp thêm 1 dấu ấn cho chẩn đoán xơ tủy nguyên phát trên lâm sàng.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * PB Tập 21 * Số * 2017 KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN CALR TRÊN BỆNH NHÂN XƠ TỦY NGUYÊN PHÁT BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA Phan Thị Xinh*, Hồng Anh Vũ** TĨMTẮT Mục tiêu: Xơ tủy nguyên phát dạng bệnh lý thuộc nhóm bệnh tân sản tăng sinh tủy có tủy xương bị xơ hóa, tăng sinh reticulin gan lách tạo máu thay tủy Các đột biến đặc trưng cho thể bệnh bao gồm JAK2V617F (60%) MPLW515L/K (5%) Gần đây, đột biến CALR phát khoảng 20 – 30% trường hợp xơ tủy nguyên phát với loại đột biến phổ biến 52 bp (loại 1), chèn bp (loại 2) exon gây lệch khung đọc số kiểu đột biến gặp khác Chúng tiến hành nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA exon gen CALR để khảo sát đột biến, góp thêm dấu ấn cho chẩn đoán xơ tủy nguyên phát lâm sàng Đối tượng phương pháp: Mẫu máu ngoại vi ống chống đông EDTA bệnh nhân xơ tủy nguyên phát âm tính với đột biến JAK2V617F tách chiết DNA Các cặp mồi xuôi mồi ngược thiết kế để khuếch đại đặc hiệu exon gen CALR Sản phẩm PCR giải trình tự theo hai chiều xi ngược hệ thống ABI 3130 Genetic Analyzer để khảo sát đột biến Kết quả: Cặp mồi CALR-g8F CALR-g9R dùng để khuếch đại vùng exon gen CALR có nhiệt độ bắt cặp tối ưu 550C Phân tích kết giải trình tự chuỗi DNA ghi nhận 7/9 trường hợp có đột biến CALR chiếm 77,78%, phát kiểu đột biến bao gồm đoạn 52 bp (c.1099_1150del) đột biến chèn thêm bp (c.1154_1155insTTGTC), đột biến dạng dị hợp tử Kiểu đoạn 52 bp gặp bệnh nhân, kiểu đột biến thường gặp nghiên cứu Kết luận: Chúng thiết lập thành công quy trình kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA phát đột biến CALR exon 9, giúp dễ dàng chẩn đốn trường hợp xơ tủy ngun phát khơng có đột biến JAK2V617F MPLW515L/K lâm sàng Từ khóa: Xơ tủy nguyên phát, gen CALR, đột biến gen, giải trình tự chuỗi DNA ABSTRACT DETECTION OF CALR MUTATIONS IN PRIMARY MYELOFIBROSIS BY DNA SEQUENCING Phan Thi Xinh, Hoang Anh Vu * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 21 - No - 2017: 322 - 326 Purpose: Primary myelofibrosis (PMF) is a type of myeloproliferative neoplasms (MPNs) characterized by fibrosis in bone marrow, increased proliferation of reticulin and replacing bone marrow by liver and spleen for hematopoiesis The typical mutations in this disease consist of JAK2V617F (60%) and MPLW515L/K (5%) Recently, CALR mutations were detected in approximately 20 – 30% of PMF patients with common types of mutations including 52 bp deletetion (type 1) and bp insertion (type 2) in exon leading to the frameshift and several other rare mutations We aim to establish a procedure of DNA sequencing for CALR exon and use for screening CALR mutations as an additional marker for diagnosis of PMF patients in clinical practice * Bộ môn Huyết học - Đại học Y Dược TP.HCM; khoa Di truyền học phân tử, Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM ** Bộ môn Mô phôi; Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: TS Phan Thị Xinh ĐT: 0932 728 115 Email: phanthixinh@yahoo.com 322 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy năm 2017 Y Học TP Hồ Chí Minh * PB Tập 21 * Số * 2017 Nghiên cứu Y học Methods: Genomic DNA was extracted from peripheral blood samples of JAK2V617F- negative PMF patients Forward and reverse primers were designed to amplify specifically CALR exon PCR products were sequenced bidirectionally using Sanger’s technique on an ABI 3130 Genetic Analyzer system Result: The primers CALR-g8F and CALR-g9R were used to amplify exon of CALR with optimal annealing temperature at 550C The analysis of DNA sequencing results showed that out of patients (77.78%) carried CALR mutations, with types of mutations including 52-bp deletion (c.1099_1150del) and 5-bp insertion (c.1154_1155insTTGTC), both were in heterozygous status The 52-bp deletion type was the most common mutation, detected in patients Conclusion: We have successfully established the DNA sequencing procedure for detection of CALR exon mutations, facilitating diagnosis of PMF in patients without JAK2V617F and MPLW515L/K mutations Key words: Primary myelofibrosis, CALR gene, gene mutation, DNA sequencing protein với trọng lượng 46-kDa có vùng cấu ĐẶTVẤNĐỀ trúc chức bao gồm vùng đầu tận Nhóm bệnh tân sản tăng sinh tủy bao gồm N gắn lectin, vùng giàu proline chứa vị trí bệnh bạch cầu mạn dòng tủy, đa hồng cầu tương tác Ca2+ có lực cao, vùng đầu tận C nguyên phát, tăng tiểu cầu nguyên phát xơ có tính acid Calreticulin có vùng KDEL tủy nguyên phát Bệnh đặc trưng tình vị trí đầu tận C với nhiều vị trí gắn Ca2+ trạng tăng sinh mức tế bào máu mang nhiều vị trí gắn với bề mặt tế bào với giai đoạn biệt hóa tế bào tủy xương yếu tố đông máu(3,4,6) máu ngoại biên(2) Xơ tủy nguyên phát có Về mặt chẩn đoán, sinh thiết tủy nhuộm tủy xương bị xơ hóa, tăng sinh reticulin gan reticulin giúp chẩn đốn tình trạng xơ tủy lách tạo máu thay tủy, đặc biệt lách Hầu hết mức độ xơ tủy, nhiên cần tìm nguyên trường hợp xơ tủy nguyên phát có nhân xơ tủy nguyên phát hay thứ phát Các lách to lúc chẩn đoán khoảng 50% trường dấu ấn sinh học phân tử giúp bác sĩ lâm hợp có gan to Trong nhóm bệnh tân sản tăng sàng chẩn đốn thể nguyên phát có sinh tủy có đột biến gen giúp chẩn đoán hướng điều trị phù hợp Trong nghiên cứu bệnh nhiễm sắc thể Philadelphia gặp này, thực khảo sát đột biến bạch cầu mạn dòng tủy đột biến gen CALR kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA, JAK2V617F gặp đa hồng cầu nguyên góp thêm dấu ấn cho chẩn đoán xơ tủy phát, tăng tiểu cầu nguyên phát xơ tủy nguyên phát lâm sàng nguyên phát với tỷ lệ tương ứng 99%, 60%, ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 60%(1) Ngoài ra, đột biến tăng chức liên quan gen MPL (MPLW515L/K) gặp Đối tượng 5% trường hợp xơ tủy nguyên phát, lại Nghiên cứu thực 10 bệnh khoảng 40% trường hợp xơ tủy nguyên phát nhân chẩn đoán xơ tủy nguyên phát theo tiêu chưa phát đột biến gen chuẩn tổ chức y tế năm 2008 không Đến cuối năm 2013, hai nghiên cứu phát đột biến JAK2 V617F Klampfl (5), Nangalia (Error! Reference source not found.) Phương pháp: cộng xác định đột biến gen CALR mã Tách chiết genomic DNA hóa Calreticulin 20 – 30% bệnh nhân (BN) xơ tủy nguyên phát khơng có đột biến gen ml máu ngoại vi ống chống đông JAK2 MPL Gen CALR nằm NST có EDTA lắc tách chiết DNA 19p13.2 gồm exon, tổng hợp Calreticulin Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy năm 2017 323 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * PB Tập 21 * Số * 2017 QIAamp DNA Kit (Qiagen, Mỹ) theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất Thiết kế mồi Các đoạn mồi thiết kế phần mềm Oligo 4.1 dựa trình tự chuẩn gen CALR mang mã số NM_004343 GenBank (bảng 1) Thực PCR Mỗi tube PCR tích 15 l chứa thành phần gồm 1,5 µL 10X PCR buffer; 1,5 µL dNTP 2,5 mM; 0,75 µL mồi xi 0,75 µL mồi ngược (10 M cho loại); 0,12 µL TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản) µL genomic DNA (50 - 100 ng) Chu trình luân nhiệt thực máy ABI 2700 (Apllied Biosystems, Mỹ) Sản phẩm PCR phát điện di thạch agarose 1,5% có nhuộm ethidium bromide quan sát hệ thống chụp ảnh điện di ChemiDoc (Biorad, Mỹ) Sản phẩm PCR sau tinh illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare) theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất Thực giải trình tự chuỗi DNA Sản phẩm PCR tinh thực phản ứng cycle sequencing với BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ) theo hai chiều xi ngược Sản phẩm sau kết tủa ethanol, hòa tan Hi-Di formanide, biến tính 95C trước làm lạnh đột ngột Trình tự DNA đọc máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ) Kết Bảng 1: Các đoạn mồi dùng nghiên cứu Tên mồi Dùng cho PCR Dùng cho sequencing CALR-g8F CALR-g9R CALR-g9F KẾTQUẢVÀBÀNLUẬN Xây dựng quy trình giải trình tự DNA gen CALR Đột biến gen CALR gặp khoảng 25% trường hợp xơ tủy nguyên phát đột biến thường gặp sau JAK2V617F (5,7,8) Các đột biến CALR gây biến đổi liên quan trực tiếp đến đường truyền tín hiệu JAK-STAT nhân tố tiên lượng độc lập mức độ nguy cơ(2,5,8) Khi xảy đột biến CALR, protein calreticulin bị thay đổi vùng C-terminus làm vùng KDEL, dẫn tới tăng sinh bất thường dòng tế bào máu sinh bệnh(7) Khi phân tích thời gian sống tồn trường hợp xơ tủy nguyên phát, nhiều nghiên cứu cho thấy BN mang đột biến CALR có nguy tử vong thấp so với BN mang đột biến JAK2V617F MPL (3,8,9) Gen CALR có nhiều kiểu đột biến khác nhau, kiểu đột biến thường gặp đoạn 52-bp chèn 5-bp TTGTC nên sử dụng kỹ thuật giải trình chuỗi DNA để phát đột biến cần thiết(8) Trong nghiên cứu, thiết kế mồi để khuếch đại vùng exon gen CALR (bảng 1) vị trí thường xảy đột biến làm thay đổi cấu trúc chức protein calreticulin Trình tự chuỗi (5’-3’) GAAACCCTGTCCAAAGCAAG CAGGGCTGGACTGAGGCCTG ACAACTTCCTCATCACCAACG Cặp mồi CALR-g8F CALR-g9R dùng để khuếch đại vùng exon gen CALR với kích thước 476 bp (hình 1) Sau 324 giải trình tự phân tích phần mềm CLC Main Workbench, so sánh với trình tự chuẩn gen CALR mang mã số NM_004343 GenBank để xác định đột biến gen Đoạn gen khuếch đại Exon – (476 bp) thay đổi nhiệt độ bắt cặp mồi khoảng 550C – 600C, chúng tơi chọn nhiệt độ thích hợp cho phản ứng khuếch đại 550C Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy năm 2017 Y Học TP Hồ Chí Minh * PB Tập 21 * Số * 2017 Nghiên cứu Y học trường hợp) Trong BN xác định âm tính JAK2V617F có 7/9 trường hợp phát đột biến CALR, chiếm 77,78% với kiểu đột biến đoạn 52 bp (c.1099_1150del) đột biến chèn thêm bp (c.1154_1155insTTGTC), đột biến dạng dị hợp tử (hình 2) Mất đoạn 52 bp gặp BN kiểu đột biến thường gặp Hình 1: Khuếch đại exon – gen CALR Giếng 1: Mẫu BN; giếng 2: chứng dương (476 bp); giếng 3: nước; giếng 4: 1kb DNA Ladder Sản phẩm khuếch đại thực giải trình tự chuỗi DNA theo phương pháp Sanger hệ thống ABI 3130 Genetic Analyzer Kết khuếch đại gen CALR mẫu phù hợp với trình tự gen CALR từ liệu genome Điều cho thấy cặp mồi thiết kế khuếch đại đặc hiệu trình tự gen CALR để phát đột biến Kết giải trình tự DNA gen CALR mẫu BN xơ tủy nguyên phát Ứng dụng quy trình kỹ thuật thiết lập để khảo sát đột biến gen CALR cho BN chẩn đoán xơ tủy nguyên phát không mang đột biến gen JAK2V617F, phát BN có đột biến hầu hết đột biến đoạn (Bảng 2) Bảng 2: Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu Mã nghiên cứu PMF-01 PMF-02 PMF-03 PMF-04 PMF-05 PMF-06 PMF-07 PMF-08 PMF-09 Tuổi 30 60 50 32 77 38 61 83 42 Giới Tình trạng đột biến Nữ c.1154_1155insTTGTC Nữ Không Nữ c.1099_1150del Nữ Không Nữ c.1099_1150del Nữ c.1099_1150del Nam c.1099_1150del Nữ c.1099_1150del Nam c.1099_1150del Kết nghiên cứu bảng cho thấy BN chẩn đốn xơ tủy ngun phát có tuổi trung bình 53 tuổi, thấp 30 tuổi cao 83 tuổi, hầu hết BN nữ (7/9 Kết nghiên cứu chúng tơi cho thấy trường hợp có mang đột biến CALR chiếm tỷ lệ cao BN xơ tủy ngun phát âm tính JAK2V617F, đột biến đoạn 52 bp kiểu đột biến thường gặp nhất, tương đồng với nghiên cứu khác giới(7,8,10) Nghiên cứu Nangalia J cộng (2013) phát đột biến CALR xuất 18/32 trường hợp xơ tủy nguyên phát âm tính đột biến JAK2V617F, chiếm tỷ lệ 56,25%(7) Năm 2014, Rumi E cộng khảo sát 218 trường hợp xơ tủy nguyên phát âm tính với JAK2V617F cho kết 64,22% trường hợp mang đột biến CALR, đột biến đoạn 52 bp chiếm 72%, đột biến chèn đoạn bp chiếm 16% đột biến khác chiếm tỷ lệ thấp(8) Đồng thời Tefferi A cộng công bố tỷ lệ kiểu đột biến CALR xuất 113 BN xơ tủy nguyên phát với 98 trường hợp (74,8%) đột biến đoạn 52 bp, 15 trường hợp (11,5%) kiểu đột biến chèn đoạn bp, 18 trường hợp lại (13,7%) kiểu đột biến khác(10) Việc phát kiểu đột biến khác tỷ lệ đột biến tương đồng với nghiên cứu khác cho thấy kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA nghiên cứu phù hợp với việc khảo sát đột biến CALR BN xơ tủy nguyên phát Kết cho thấy xây dựng thành công quy trình giải trình tự chuỗi DNA cho phân tích đột biến gen CALR, giúp chẩn đốn xác xơ tủy nguyên phát để điều trị phù hợp Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy năm 2017 325 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * PB Tập 21 * Số * 2017 Hình 2: Đột biến CALR exon Dạng đột biến đoạn thường gặp c.1099_1151del52 (A) đột biến chèn đoạn c.1154_1155insTTGTC (B) KẾTLUẬN Kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA phát đột biến CALR thiết lập điều kiện phòng thí nghiệm Việt Nam, giúp chẩn đoán tiên lượng bệnh cho BN xơ tủy nguyên phát Hơn nữa, nghiên cứu cung cấp tảng để xây dựng sở liệu riêng cho BN Việt Nam 326 TÀILIỆUTHAMKHẢO Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, et al (2005), Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders, Lancet, 365(9464):1054-61 Campbell PJ, Green AR (2006), The myeloproliferative disorders, N Engl J Med, 7;355(23):2452-66 Chi J, Nicolaou KA, Nicolaidou V, et al (2014), Calreticulin gene exon frameshift mutations in patients with thrombocytosis Leukemia, 28(5):1152-4 Gold LI, Eggleton P, Sweetwyne MT, et al (2010), Calreticulin: non-endoplasmic reticulum functions in physiology and disease, FASEB J, 24:665–83 Klampfl T, Gisslinger H, Harutyunyan AS, et al (2013) Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms N Engl J Med, 369:2379–90 10 Kuwabara K1, Pinsky DJ, Schmidt AM, et al (1995), Calreticulin, an antithrombotic agent which binds to vitamin K-dependent coagulation factors, stimulates endothelial nitric oxide production, and limits thrombosis in canine coronary arteries, J Biol Chem Apr 7;270(14):8179-87 Nangalia J, Massie CE, Baxter EJ, et al (2013), Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2, N Engl J Med;369: 2391–405 Rumi E, Pietra D, Pascutto C, et al (2014), Clinical effect of driver mutations of JAK2, CALR, or MPL in primary myelofibrosis, Blood, 124(7):1062-9 Mario Cazzola, Robert Kralovics (2014), From Janus kinase to calreticulin: the clinically relevant genomic landscape of myeloproliferative neoplasms, Blood, 123:3714-3719 Tefferi A, Lasho TL, Tischer A, et al (2014), The prognostic advantage of calreticulin mutations in myelofibrosis might be confined to type or type 1-like CALR variants, Blood, 2014, 124:2465-2466 Ngày nhận báo: 06/03/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 15/03/2016 Ngày báo đăng: 05/04/2017 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy năm 2017 ... dòng tủy đột biến gen CALR kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA, JAK2V617F gặp đa hồng cầu nguyên góp thêm dấu ấn cho chẩn đoán xơ tủy phát, tăng tiểu cầu nguyên phát xơ tủy nguyên phát lâm sàng nguyên. .. với việc khảo sát đột biến CALR BN xơ tủy nguyên phát Kết cho thấy xây dựng thành cơng quy trình giải trình tự chuỗi DNA cho phân tích đột biến gen CALR, giúp chẩn đốn xác xơ tủy nguyên phát để... BN xơ tủy nguyên phát Ứng dụng quy trình kỹ thuật thiết lập để khảo sát đột biến gen CALR cho BN chẩn đoán xơ tủy nguyên phát không mang đột biến gen JAK2V617F, chúng tơi phát BN có đột biến hầu