Xác định đột biến gen CYP1B1 trên bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát bằng kĩ thuật giải trình tự gen

7 89 1
Xác định đột biến gen CYP1B1 trên bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát bằng kĩ thuật giải trình tự gen

Đang tải... (xem toàn văn)

Thông tin tài liệu

Nghiên cứu này nhằm xác định đột biến gen CYP1B1 trên bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát Việt Nam bằng kỹ thuật giải trình tự. Kết quả cho thấy, 4/15 (26,7%) bệnh nhân có đột biến điểm trên gen CYP1B1 trong đó 3 bệnh nhân có đột biến dị hợp tử Gln86Lys (01 bệnh nhân có đột biến kết hợp với đột biến Val198Ile, 02 bệnh nhân có đột biến kết hợp với SNP-Arg48Gly, Ala119Ser trên exon 2 và Leu432Val trên exon 3). Một bệnh nhân có đột biến dị hợp tử Asp218His kết hợp với đột biến thay thế acid amin (missense) Glu229Lys trên exon 2. Đột biến Gln86Lys và Asp218His trên exon 2 là các đột biến mới chưa được công bố, trong khi đó 2 đột biến missense (Val198Ile và Glu229Lys) và các SNP đã được công bố.

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CYP1B1 TRÊN BỆNH NHÂN GLÔCÔM BẨM SINH NGUYÊN PHÁT BẰNG KĨ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN Nguyễn Sơn Tùng1, Trần Thu Hà1,2, Trần Huy Thịnh1, Tạ Thành Văn1, Trần Vân Khánh1 Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Bệnh viện Mắt Trung ương Glôcôm bẩm sinh nguyên phát bệnh lý di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, xác định có liên quan với đột biến gen CYP1B1 Bệnh nguyên nhân hàng đầu gây mù lòa trẻ em Việc phát đột biến CYP1B1 bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát cần thiết, cấp bách để tạo điều kiện tư vấn di truyền cho người lành mang gen bệnh Đột biến gen CYP1B1 chủ yếu đột biến điểm exon exon Tuy nhiên, tỷ lệ phát đột biến CYP1B1 thay đổi cho chủng tộc, Châu Á tỷ lệ từ 17,2% đến 33,3% Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu xác định đột biến gen CYP1B1 bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát Nghiên cứu nhằm xác định đột biến gen CYP1B1 bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát Việt Nam kỹ thuật giải trình tự Kết cho thấy, 4/15 (26,7%) bệnh nhân có đột biến điểm gen CYP1B1 bệnh nhân có đột biến dị hợp tử Gln86Lys (01 bệnh nhân có đột biến kết hợp với đột biến Val198Ile, 02 bệnh nhân có đột biến kết hợp với SNP-Arg48Gly, Ala119Ser exon Leu432Val exon 3) Một bệnh nhân có đột biến dị hợp tử Asp218His kết hợp với đột biến thay acid amin (missense) Glu229Lys exon Đột biến Gln86Lys Asp218His exon đột biến chưa công bố, đột biến missense (Val198Ile Glu229Lys) SNP cơng bố Từ khóa: Bệnh glơcơm bẩm sinh nguyên phát, gen CYP1B1, đột biến gen I ĐẶT VẤN ĐỀ Glơcơm bẩm sinh ngun phát tình trạng nhiễm sắc thể số 2, gồm exon intron Gen CYP1B1 quy định tổng hợp protein tăng nhãn áp phát triển bất thường CYP1B1 (một phân họ enzym cytochrom bán phần trước nhãn cầu Tuy gặp P450), đóng vai trò việc hình thành bệnh thường xảy hai mắt (65 - cấu trúc phía trước mắt 80%), xuất sớm từ năm đầu tham gia vào trình điều chỉnh sau sinh nguyên nhân tiết thủy dịch Đột biến gen CYP1B1 cho gây mù lòa quan trọng trẻ nhỏ [1 - 3] Bệnh làm rối loạn sản xuất enzyme, dẫn đến bất xác định thể bệnh glôcôm di thường cấu trúc mạng lưới vùng bè ứ trệ truyền lặn nhiễm sắc thể thường liên thủy dịch làm tăng nhãn áp gây nên bệnh quan đến đột biến gen CYP1B1 [4; 5] glôcôm [6] Đột biến gen CYP1B1 chủ yếu Gen CYP1B1 nằm vị trí 2p22.2 đột biến điểm nằm exon exon 3; tỉ lệ phát đột biến CYP1B1 Châu Á thay đổi từ 17,2% đến khoảng 33,3% [7 - 10] Địa liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Ở Việt Nam, bệnh glôcôm nguyên phát Email: tranvankhanh@hmu.edu.vn thường phát muộn, điều trị phẫu thuật dễ Ngày nhận: 30/8/2018 tái phát [2] Việc phát đột biến gen Ngày chấp thuận: 18/10/2018 CYP1B1 bệnh nhân glôcôm bẩm sinh TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC nguyên phát làm sở cho việc triển khai mống mắt: tật khơng mống mắt, tồn lưu chẩn đốn trước sinh, tư vấn di màng Wachendorf; Dị thường thể thủy tinh: truyền cho gia đình có trẻ mắc bệnh hội chứng Lowe, Marfan, Machesani nhằm giảm tỷ lệ mù lòa trẻ em Theo tổng kết năm 2010, đột biến gen CYP1B1 phát chủ yếu exon exon chiếm tới 99,8% số đột biến phát [7] Vì vậy, nghiên cứu tiến hành với mục tiêu: Xác định đột biến gen CYP1B1 exon exon bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng Tiêu chuẩn lựa chọn 15 bệnh nhân chẩn đoán xác định mắc bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát Bệnh viện Mắt Trung ương bệnh nhân tuổi Bệnh nhân chẩn đốn xác định bệnh glơcơm bẩm sinh ngun phát có từ triệu chứng trở lên [11]: - Nhãn áp cao ≥ 25 mmHg (Nhãn áp kế Maclakov) ≥ 22 mmHg (Nhãn áp kế Icare) - Chói, chảy nước mắt, sợ ánh sáng - Đường kính giác mạc to bất thường ≥ 12 mm - Bệnh nhân gia đình khơng đồng ý tham gia nghiên cứu Phương pháp Lấy mẫu bệnh phẩm: ml máu tĩnh mạch chống đông EDTA Tách chiết DNA từ máu ngoại vi: DNA tổng số tách chiết từ máu toàn phần phenol - chloroform - isopropanol (25: 24: 1) Kỹ thuật PCR: PCR sử dụng để khuếch đại exon exon gen CYP1B1 với cặp mồi thiết kế [12] Thành phần phản ứng PCR (thể tích 20μl) gồm: 1X đệm PCR; 2,5 mM dNTP, 0,2 μM mồi xuôi ngược, 0,5U Taq polymerase, 2050ng DNA Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 94oC/5 phút, 37 chu kỳ [94oC/30 giây, 55oC/30 giây, 72oC/60 giây], 72oC/7 phút Bảo quản mẫu 15oC Kỹ thuật giải trình tự gen: sản phẩm PCR tiến hành giải trình tự trực tiếp máy ABI 3100 Genetic Analyzer Kết thu thập xử lý phần mềm ABI PRISMTM 3100 - Avant Data Collection, DNA Sequencing Analysis 5.2 BLAST NCBI - Giác mạc phù, mờ đục Trình tự so sánh ngân hàng gen: - Tiền phòng sâu, góc tiền phòng có tổ DNA (NG_008386) mRNA (NM_000104) chức bất thường - Tổn hại lõm teo gai thị bệnh glôcôm Tiêu chuẩn loại trừ - Glôcôm bẩm sinh thứ phát: tổn thương giác mạc: hội chứng tách lớp bán phần trước (Axenfeld, Reiger, Peters); Tổn thương TCNCYH 117 (1) - 2019 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu - Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội - Thời gian nghiên cứu: từ tháng 09/2017 đến tháng 09/2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Đạo đức nghiên cứu III KẾT QUẢ Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ theo đạo Kết xác định khuếch đại exon đức nghiên cứu Y học Bệnh nhân và exon gen CYP1B1 gia đình bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu có quyền rút lui khỏi Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho exon nghiên cứu không đồng ý tiếp tục tham exon gen CYP1B1 để khuyếch đại DNA sau gia Bệnh nhân gia đình thông báo tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân Hình kết xét nghiệm gen để giúp cho bác hình ảnh PCR đại diện khuếch đại exon sỹ tư vấn di truyền lựa chọn phác đồ gen CYP1B1 điều trị phù hợp Các thơng tin cá nhân đảm bảo bí mật MK (+) (-) 885 bp Hình Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon 3, gen CYP1B1 * (MK) Marker; (1 - 4) mẫu bệnh nhân; (+) mẫu đối chứng dương; (-) mẫu đối chứng âm Kết hình cho thấy, sản phẩm PCR thu có băng đặc hiệu, rõ nét, kích thước 885 bp, khơng có sản phẩm phụ Sản phẩm PCR đảm bảo cho phản ứng giải trình tự để phát đột biến điểm Kết xác định đột biến gen CYP1B1 Sản phẩm PCR giải trình tự gen để phát đột biến Kết cho thấy phát 4/15 bệnh nhân có đột biến gen CYP1B1 Trong đó, 3/15 bệnh nhân có đột biến dị hợp tử Gln86Lys exon kết hợp với số đa hình thái gen-SNP (Arg48Gly, Ala119Ser exon Leu432Val exon 3) đột biến thay acid amin (missense) Val198Ile cơng bố trước bệnh nhân có đột biến dị hợp tử Asp218His kết hợp với đột biến thay acid (missense) Glu229Lys exon Kết bảng cho thấy 2/4 trường hợp có đột biến dị hợp tử Gln86Lys kết hợp với đa hình đơn nucleotid SNP 2/4 trường hợp phối hợp đột biến dị hợp tử (Compound heterozygous) Trong đó, 01 bệnh nhân có đột biến dị hợp tử Gln86Lys phối hợp với đột biến missense Val198Ile 01 bệnh nhân có đột biến dị hợp tử Asp218His phối hợp với đột biến Glu229Lys dị hợp tử Các đột biến phát exon 10 TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng Kết xác định đột biến gen CYP1B1 Mã số G02.00 G05.00 G10.00 G07.00 Exon Đột biến cDNA Acid amin Thể đột biến Chú thích Tài liệu cơng bố c.659C > A Gln86Lys Dị hợp New c.545C > G Arg48Gly Dị hợp SNP [12] c.758G > T Ala119Ser Dị hợp SNP [12] c.659C > A Gln86Lys Dị hợp New c.1697C > G Leu432Val Dị hợp SNP c.659C > A Gln86Lys Dị hợp New c.995G > A Val198Ile Dị hợp Missense [9] c.1697C > G Leu432Val Dị hợp SNP [12] c.1055G > C Asp218His Dị hợp New c.1088G>A Glu229Lys Dị hợp Missense [12] [13] New: Đột biến mới; SNP: Single Nucleotide Polymorphism (đa hình đơn nucleotid); Missense: Đột biến thay acid amin c.659C c.995G > A (V198I) c.659C > A (Q86K) c.1697C Người bình thường c.955 G c.1697C > G (L432V) Mẫu bệnh nhân Hình Hình ảnh giải trình tự gen CYP1B1 bệnh nhân mã số G10.00 Kết giải trình tự gen hình cho thấy, so sánh với trình tự cDNA người bình thường, bệnh nhân mã số G10.00 có đột biến thay nucleotid C thành A vị trí 659 cDNA, dẫn tới thay đổi acid amin Glutamine thành Lysine codon 86; đột biến thay nucleotid G thành A TCNCYH 117 (1) - 2019 11 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC vị trí 995 cDNA, dẫn tới thay đổi acid amin Valine thành Isoleucine condon 198 đột biến thay nucleotid C thay G vị trí 1697 cDNA, dẫn tới thay đổi acid amin Leucine thành Valine condon 432 Như vậy, bệnh nhân mã số G10.00 có đột biến phát dạng dị hợp tử Gln86Lys exon kết hợp với đột biến missense Val198Ile exon SNP Leu432Val exon công bố trước IV BÀN LUẬN bệnh Tuy nhiên muốn khẳng định Tỷ lệ phát đột biến gen CYP1B1 đột biến gây bệnh cần phải có nghiên cứu in bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát vitro mơ hình động vật Bên cạnh châu Á thay đổi từ 17,2% đến 33,3% đó, chúng tơi tìm thấy đột biến Nghiên cứu năm 2014 192 bệnh nhân missense công bố trước glôcôm bẩm sinh nguyên phát Trung Quốc Val198Ile Glu229Lys Đột biến Val198Ile phát 18 đột biến khác 21 bệnh tìm thấy bệnh nhân Nhật bản, nhân (chiếm 17,2%) [8] Nghiên cứu 12 đột biến Glu229Lys tìm thấy bệnh nhân Indonesia phát bệnh nhân bệnh nhân Iran gợi ý gây kiểu hình (chiếm 33,3%) có đột biến gen CYP1B1 [10] nặng [9; 13] Ngoài ra, nghiên cứu chúng Trong nghiên cứu chúng tơi tỷ lệ phát tơi tìm dạng đa hình thái đột biến 26,7% (4/15), nhiên cỡ mẫu bố trước Arg48Gly, Ala119Ser nhỏ nên để xác định tỷ lệ đột biến gen exon Leu432Val exon Những CYP1B1 bệnh nhân glôcôm bẩm sinh đột biến nằm vùng chức nguyên phát Việt Nam cần tiến hành protein CYP1B1 [12] nghiên cứu cỡ mẫu lớn Trong số bệnh nhân mang đột biến mới, Theo tổng kết năm 2010, 52 nghiên 2/4 bệnh nhân mang đột biến Gln86Lys dị hợp cứu báo cáo phát 542 bệnh tử phối hợp với dạng đa hình thái 2/4 nhân mang 147 đột biến khác gen bệnh nhân phối hợp đột biến dị hợp tử CYP1B1 Trong số 1007 đột biến phát Điều giải thích bệnh đột biến có đột biến vùng khơng mã hóa alen khác phối hợp chưa phát thuộc exon 1; 489 đột biến phát phối hợp đột biến dị hợp tạo hiệu exon 516 đột biến phát exon ứng cộng hưởng gây bệnh glôcôm bẩm sinh [7] Trong nghiên cứu chúng tôi, phát nguyên phát đột biến exon đa hình gen SNP exon exon Trong nghiên cứu chúng tôi, 100% đột biến phát đột biến thay Nghiên cứu phát 3/15 bệnh nhân nuleotide dẫn đến thay đổi acid amin Kết có đột biến Gln86Lys 1/15 bệnh nhân có tương đồng với tác giả đột biến Asp218His, đột biến giới Theo nghiên cứu Úc tỷ lệ đột chưa công bố Phân tích in silico sử biến thay acid amin khoảng 72,7% tổng dụng phần mềm dự đoán kiểu hình protein, số đột biến phát Theo thấy đột biến Gln86Lys nghiên cứu Châu Á, tỷ lệ đột biến loại Asp218His dự đốn có khả gây dao động khoảng từ 60% đến 97% tổng 12 TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC số đột biến gen CYP1B1 cụ thể Nhật kinh phí đề tài cấp Sở Khoa học 66,8%; Indonesia 62,5%; Ả rập 96,5% Công nghệ Hà Nội “Nghiên cứu ứng dụng kỹ Iran 90% Ngoài số dạng đột thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen biến khác tìm thấy tỷ lệ CYP1B1 bệnh Glơcơm bẩm sinh ngun thấp đột biến xóa đoạn, lặp đoạn, đột phát Hà Nội” giúp đỡ cán biến vô nghĩa hay thêm nucleotide [7] Trong Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường nghiên cứu này, đột biến tìm Đại học Y Hà Nội dạng thay nucleotide dẫn đến biến đổi acid amin Tuy nhiên nghiên cứu bước đầu, cần có nghiên cứu để đưa số liệu cụ thể vấn đề Bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường Khoảng 90% trẻ mang đột biến gen CYP1B1 biểu bệnh hai mắt với mức độ khác Ở Việt Nam, trẻ mắc bệnh thường phát điều trị muộn, dẫn đến hậu nặng nề vật chất tinh thần cho trẻ gia đình Việc nghiên cứu đột biến gen CYP1B1 bệnh nhân glôcôm bẩm sinh TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Như Hơn (2012) Nhãn khoa Nhà xuất Y học, 1, 465 - 474 Nguyễn Như Quang (1982) Đặc điểm lâm sàng bệnh glôcôm bẩm sinh phẫu thuật cắt bè củng mạc Nhãn khoa, 1, 65 - 70 Shields M B (1982) Primary congenital glaucoma Williams and Wilkins, Third edition, 220 - 233 Robert N Weiss, Shaffer., Daniel I (1970) Congenital and pediatric glaucomas nguyên phát sở để tư vấn di truyền cho gia đình mang gen bệnh hạn chế tỷ lệ mù Mosby, St Louis, 37 lòa trẻ em cộng (2013) CYP1B1, MYOC, and LTBP2 Mutations in Primary Congenital V KẾT LUẬN Lim SH, Tran-Viet KN, Yanovitch TL Glaucoma Patients in the United States bẩm sinh nguyên phát có đột biến gen American journal of ophthalmology, 155(3), 508 - 517 CYP1B1 Trong có bệnh nhân có đột Sarfarazi M., Stoilov I (2000) Molecular biến dị hợp tử Gln86Lys kết hợp với đột biến genetics of primary congenital glaucoma Eye thay đổi acid amin (missense) Val198Ile (London, England), 14(3B), 422 - 428 Đã phát 4/15 bệnh nhân glơcơm số đa hình gen SNP (Arg48Gly,Ala119Ser Li N, Zhou Y, Du L et al (2011) exon Leu432Val exon 3) Một Overview of Cytochrome P450 1B1 gene bệnh nhân có đột biến dị hợp tử Asp218His mutations in patients with primary congenital kết hợp với đột biến thay đổi acid amin glaucoma Experimental Eye Research, 93 (missense) Glu229Lys exon Đột biến (5), 572 - 579 Gln86Lys Asp218His đột biến chưa công bố Lời cảm ơn Nghiên cứu thực với hỗ trợ TCNCYH 117 (1) - 2019 Chen X, Chen Y, Wang L et al (2014) CYP1B1 genotype influences the phenotype in primary congenital glaucoma and surgical treatment The British Journal of Ophthalmology, 98(2), 246 - 251 13 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Mashima Y, Suzuki Y, Sergeev Y et al (1998) Sequence analysis and homology (2001) Novel cytochrome P4501B1 (CYP1B1) gene mutations in Japanese patients with modeling suggest that primary congenital primary disrupting either the hinge region or the congenital glaucoma Invest glaucoma on 2p21 results from mutations Ophthalmol Vis Sci, 42(10), 2211 - 2216 conserved core structures of cytochrome 10 Sitorus R, Ardjo SM, Lorenz B et al (2003) CYP1B1 gene analysis in primary congenital glaucoma in Indonesian and P4501B1 American Journal of Human Genetics, 62(3), 573 - 584 13 Fereshteh Chitsazian, Betsabeh European patients J Med Genet, 40(1), e9 11 T S Dietlein, P C Jacobi., G K Khoramian Tusi Elahe Elahi (2007) Krieglstein (1999) Prognosis of primary ab externo surgery for primary congenital Congenital Glaucoma Patients and Associated glaucoma Br J Ophthalmol, 83(3), 317 - 322 12 Stoilov I, Akarsu AN, Alozie I et al CYP1B1 Mutation Profile of Iranian Primary Haplotypes The Journal of Molecular Diagnostics, 9(3), 382 - 393 Summary MUTATION ANALYSIS OF CYP1B1 GENE IN PATIENTS WITH PRIMARY CONGENITAL GLAUCOMA USING SEQUENCING METHOD Primary congenital glaucoma is an autosomal recessive inherited disease which associate with CYP1B1 mutations Glaucoma leads to blindness if left untreated, and it is considered one of the most common leading cause of blindness in children Detection of CYP1B1 mutations in patients with primary congenital glaucoma is essential, urgently needed to facilitate genetic counseling for healthy carriers of the gene Point mutation is the most common in the CYP1B1 gene and almost located in exon and exon However, the proportion of PCG patients which have CYP1B1 mutations varies among populations, the numbers in Asian range from 17.2% to 33.3% In Vietnam, in present no research perform CYP1B1 mutations analysis in patients with primary congenital glaucoma This study was planned with the aim to identify the mutation profile of CYP1B1 in Vietnam primary congenital glaucoma (PCG) patients by using sequencing technique The results showed that 4/15 (26,7%) cases harbored the CYP1B1 mutations, in which patients carrying novel heterozygous Gln86Lys mutation in exon combined with missense mutation Val198Ile and others SNPs (Arg48Gly, Ala119Ser in exon and Leu432Val in exon 3) One patient has novel heterozygous Asp218His mutation in exon combined with missense mutation Glu229Lys Gln86Lys and Asp218His in exon are novel mutations, whereas missense mutations and SNPs had been reported in other studies Keywords: primary congenital glaucoma, CYP1B1 gene, mutation 14 TCNCYH 117 (1) - 2019 ... ứng giải trình tự để phát đột biến điểm Kết xác định đột biến gen CYP1B1 Sản phẩm PCR giải trình tự gen để phát đột biến Kết cho thấy phát 4/15 bệnh nhân có đột biến gen CYP1B1 Trong đó, 3/15 bệnh. .. 2010, đột biến gen CYP1B1 phát chủ yếu exon exon chiếm tới 99,8% số đột biến phát [7] Vì vậy, nghiên cứu tiến hành với mục tiêu: Xác định đột biến gen CYP1B1 exon exon bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên. .. Mẫu bệnh nhân Hình Hình ảnh giải trình tự gen CYP1B1 bệnh nhân mã số G10.00 Kết giải trình tự gen hình cho thấy, so sánh với trình tự cDNA người bình thường, bệnh nhân mã số G10.00 có đột biến

Ngày đăng: 21/01/2020, 10:23

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan