Đa polyp tuyến gia đình là bệnh di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, nguyên nhân gây bệnh được xác định chủ yếu do đột biến gen APC nằm trên nhiễm sắc thể số 5. Gen gồm 15 exon mã hóa ra mRNA dài 8972 bp. Đột biến chủ yếu của gen APC là đột biến điểm.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN APC Ở MỨC ĐỘ mRNA TRÊN BỆNH NHÂN MẮC BỆNH ĐA POLYP TUYẾN GIA ĐÌNH Đồn Nam Khánh*, Lê Minh Khơi**, Nguyễn Thị Băng Sương** TĨM TẮT Mở đầu: Đa polyp tuyến gia đình bệnh di truyền trội nhiễm sắc thể thường, nguyên nhân gây bệnh xác định chủ yếu đột biến gen APC nằm nhiễm sắc thể số Gen gồm 15 exon mã hóa mRNA dài 8972 bp Đột biến chủ yếu gen APC đột biến điểm Nếu không phát điều trị sớm, 100% bệnh nhân tiến triển thành ung thư đại trực tràng Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự để xác định đột biến điểm gen APC mRNA bệnh nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 33 bệnh nhân bị đa polyp đại trực tràng đồng ý tham gia nghiên cứu Những bệnh nhân chẩn đốn mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình dựa vào triệu chứng lâm sàng nội soi phát có polyp đại trực tràng với số lượng polyp 20 polyp Các bệnh nhân ly trích DNA giải trình tự tồn vùng gen mã hóa APC Kết quả: Phát 15 bệnh nhân bị đột biến điểm gen APC, có đột biến sai nghĩa (chiếm 53,3%), đột biến sai khác nucleotide Ngồi có đột biến làm xuất mã kết thúc (chiếm 46,7%); bao gồm 01 đột biến thêm nucleotide (chiếm 6,7%), đột biến đổi nucleotide (13,3%) đột biến từ đến nucleotide (26,7%) Kết luận: Chúng tơi ứng dụng thành cơng quy trình giải trình tự phát đột biến mRNA gen APC bệnh nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình Từ khóa: Ung thư đại trực tràng, gen APC, mRNA, đa polyp tuyến gia đình, đột biến điểm, giải trình tự… ABSTRACT IDENTIFYING MUTATIONS IN APC mRNA IN PATIENTS WITH HEREDITARY FAMILIAL ADENOMATOUS POLYPOSIS Đoan Nam Khanh, Le Minh Khoi, Nguyen Thi Bang Suong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 19 - No - 2015: 200 - 205 Background: Hereditary familial adenomatous polyposis (FAP) is a dominant somatic inherited disorder caused most frequently by mutations in APC gene on chromosome The gene consists of 15 exons encoding for mRNA of 8972 bp Majority of mutations on APC gene are point mutations Without early detection and prompt management, 100% patients will progress to colorectal cancer Objectives: Applying the genetic sequencing technique to detect point mutations in APC gene in patients who had been diagnosed to have FAP and in mutation carriers Patients and method: We successfully recruited 33 patients Diagnosis of AFP was based on clinical manifestations and polyps detected on colorectal endoscopy and at least 20 polyps must be present Samples were collected and DNA was extracted and sequencing of the whole APC gene was carried out Results: We detected point mutations in APC gene in 15 patients including missense mutations (53.3%) * Khoa Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh ** Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS TS Nguyễn Thị Băng Sương ĐT: 0913281386 Email: suongnguyenmd@gmail.com 200 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Nghiên cứu Y học and nonsense mutations (46.7%): including mutation of adding nucleotide (6.7%), replacement of one nucleotide (13.3%) and patients with deletion from to nucleotides (26.7%) Conclusions: We have successfully established the procedure for sequencing to detect mutations on APCencoded mRNA in patients with FAP Keywords: Colorectal cancer, APC gene, mRNA, hereditary familial adenomatous polyposis, point mutation, sequencing nhiên tác giả phân tích exon 15 gen ĐẶT VẤN ĐỀ dựa phân tử DNA, đột biến rải Bệnh đa polyp tuyến gia đình (hereditary rác khắp chiều dài đoạn gen(6,11) Để tránh bỏ sót familial adenomatous polyposis: FAP) tổn thương, cần xây dựng quy trình phân tích bệnh rối loạn di truyền trội(5) Đa polyp tuyến gia toàn đoạn gen APC để xác định đột biến Xuất đình đặc trưng phát sinh hàng trăm phát từ thực tiễn đó, chúng tơi tiến hành đề tài đến hàng ngàn polyp đại trực tràng, hầu với mục tiêu: “Xác đình đột biến điểm hết tuổi vị thành niên(1,5) Triệu chứng đầu mRNA gen APC bệnh nhân mắc bệnh đa tiên FAP tiêu chảy có máu polyp tuyến gia đình” phân(1) Bệnh xảy với tần suất 1/8300 trẻ sinh ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU sống(6) có nguy cao dẫn đến ung thư đại trực tràng, gần 100% bệnh nhân bị K hóa Đối tượng nghiên cứu trước 40 tuổi không điều trị sớm(7) Chọn lựa 33 bệnh nhân chẩn đốn Bệnh có liên quan mật thiết đến đột mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình dựa vào biến dòng mầm gen ức chế khối u APC triệu chứng lâm sàng nội soi phát có (tumor - supressor adenomatous polyposis polyp đại trực tràng với số lượng polyp đại coligen: APC) nằm vị trí 5q21-q22(5,10) Gen trực tràng >20 polyp APC gen ức chế khối u cổ điển dài 14000 Phương pháp nghiên cứu nucleotid, có cấu trúc gồm 15 exon, gen mã hóa Tách chiết RNA tổng số từ mẫu máu phân tử mRNA dài 8972 bp, sản phẩm dịch Máu ngoại vi thu nhận giữ mã dài 2843 acid amin Các nghiên cứu ống chống đơng EDTA ly trích giới tìm thấy khoảng 300 đột biến khác (6) vòng 24 Sử dụng quy trình tách chiết gen APC gây bệnh FAP Có khoảng 60RNA tổng số chloroform, isopropanol có 70% đột biến điểm tìm thấy gia bổ sung isogen nhằm tách chiết mRNA có đình bệnh FAP, đột biến đoạn (1) chất lượng tốt Tiến hành kiểm tra sản phẩm thu lớn chiếm từ 10-15% Đa số đột biến nằm phương pháp điện di gel agarose rải rác tồn chiều dài gen APC(1,5,8) Do đó, 0,8%, đo nồng độ độ tinh máy trở ngại lớn muốn xác định đột biến NanoDrop 2000 gen APC mức độ DNA, cần thiết kế 37 cặp mồi khuếch đại exon(11), điều gây tốn tài lẫn thời gian Trong đó, chẩn đốn mức độ mRNA cần 10 cặp mồi khuếch đại toàn chiều dài đoạn gen APC Ở Việt Nam, việc nghiên cứu đột biến gen APC bệnh nhân FAP hạn chế Năm 2012 tác giả Nguyễn Phương Anh phân tích gen APC cho số gia đình bệnh nhân FAP, Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Kỹ thuật tổng hợp cDNA từ RNA tổng số Sản phẩm RNA toàn phần sau tách chiết tiến hành phản ứng RT-PCR tạo cDNA phương pháp MMLV-RT Sản phẩm cDNA sau kiểm tra cách thực phản ứng PCR với cặp mồi gen GADPH Phản ứng PCR khuếch đại amplicon Các thành phần phản ứng bao gồm: mồi xuôi 201 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 10pmol, mồi ngược 10pmol (xem bảng 1), đệm PCR 10X, dNTP 2,5 mM, TakaraTaq 0,5U, cDNA genome mẫu 5μl tổng thể tích 20 μl Chu trình nhiệt: Biến tính 94oC phút, sau 35 - 40 chu kỳ gồm 94oC 10 giây; 61oC 30 giây; 72oC phút, giai đoạn kết thúc gồm 72oC phút Bảng Trình tự mồi thực khuếch đại amplicon STT Amp Amp Amp Amp Amp Amp Amp Amp Amp Amp 10 Mồi R F R F R F R F R F R F R F R F R F R F Trình tự mồi CTGGAGACAGAATGGAGGTG CCTTGGTTCCCAGATGACTT AGCCAGTGTTTTGAGTTCTAGT TGCACCATCTACAGCACATATA AAAGCGTATTGAGTGCCTTATG CTTCTGTCTTCCTGAGAGGTATG AGGTTTGCAGATCTCCACCA TGCTTTGTCCAGATGAACTCT CCTTCATCACAGAAACAGTCA CACTCAGGCTGGATGAACAA ACATTTTGCCACGGAAAGTAC GTTTCTTTGAATCTTTGTTGTCTGAG CCACAAAATACTGAATATAGGACACG CACCTTCCTGAATAGCTTTCCA AGATTCAGAACATGGTCTATCCC TCTGATTTAGTCCTTTGGAGGCA TCTCCAGGTAGACAGATGAGC GGATTTGCCTTTTCTGAAACAC CTCAGGTGCTACAAATGGTG CTGTAGTGTTCATTATTTTAAGACAAGC Kỹ thuật giải trình tự gen phân tích kết Tiến hành tinh sản phẩm PCR, thực phản ứng cycle sequence tinh sản phẩm khuếch đại Sau điện di máy ABI 3500 Sử dụng phần mềm chuyên dụng để phân Mồi dài 20 20 22 22 22 23 20 21 21 20 21 26 26 22 22 23 21 22 20 28 o Tm C 60,7 60,8 60,9 60,0 60,7 60,4 61,0 60,1 60,5 60,1 61,2 60,4 60,7 60,6 60,9 60,2 60,3 60,2 60,1 60,8 % GC 55,0 50,0 40,9 40,9 40,9 47,8 50,0 42,9 42,9 50,0 42,9 34,6 38,5 45,5 40,9 43,5 52,4 40,9 50,0 32,1 Chiều dài (bp) 992 bp 973 bp 958 bp 989 bp 961 bp 974 bp 985 bp 962 bp 974 bp 958 bp tích kết giải trình tự so sánh với trình tự cDNA phiên mã ngược từ mRNA chuẩn có mã trình tự tham chiếu NCBI NM_000038.5 để xác định đột biến KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết giải trình tự nhóm bệnh nhân nghiên cứu Hình Đột biến p.Lys1456Thr c.4367 (FAP11) p.Gln1517ArgfsX6 c.4550 (FAP 18) 202 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Nhận xét: Đột biến c.4367A>C làm đổi acid amine Lysine thành acid amine Threonine (FAP 11) Đột biến c.4550 delA làm xuất codon Nghiên cứu Y học kết thúc (TAA) codon 1522 (FAP 18) Đột biến chưa cơng bố Hình Đột biến p.Leu639TyrfsX7 c.1916 (FAP 25) p.Gln1922His c.5766 (FAP33) Nhận xét: đột biến c.1916delT làm xuất codon kết thúc (TGA) codon 645 (FAP25) Đột biến c.5766G>C làm đổi acid amine Glutamine thành acid amine Histidine (FAP33) Đột biến chưa công bố Kết tỷ lệ đột biến gen APC Nhận xét: số 33 bệnh nhân mắc bệnh đa polyp đại trực tràng phân tích, chúng tơi phát 15 bệnh nhân bị đột biến gen APC, chiếm 45,5% Có 18 bệnh nhân khơng có đột biến gen APC vùng phân tích, chiếm 54,5% Bảng Tỷ lệ bệnh nhân bị đốt biến gen APC Kết Có đột biến gen Khơng tìm thấy đột biến Tổng số Số lượng BN 15 18 33 Tỷ lệ (%) 45,5 54,5 100 Phân loại đột biến gen APC Bảng Bảng phân loại đột biến gen APC STT BN 10 11 FAP FAP FAP FAP 11 FAP 13 FAP 18 FAP 20 FAP 25 FAP 27 FAP 28 FAP 29 Exon Nucleotide thay đổi 15 (Amp8) c.6691 A>T 15 (Amp6) c.4661-4666insA (Amp2) c.1165A>T 15 (Amp5) c.4367A>C 15 (Amp3) c.2097G>A 15 (Amp6) c.4550delA 15 (Amp4) c.3146G>A 14 (Amp3) c.1916delT 15 (Amp7) c.5908A>C (Amp1) c.317G>A 15 (Amp5) c.3921_3925 delAAAAG Acid amine thay đổi Kết luận đột biến p.Ile2231Phe p.Ser1556PhefsX2 p.Asn1165Tyr p.Lys1456Thr p.Tyr699Term p.Gln1517ArgfsX6 p.Trp1049Term p.Leu639TyrfsX7 p.Ser1970Arp p.Arg106His p.Glu1309AspfsX4 Dị hợp tử Đột biến sai nghĩa Dị hợp tử Đột biếnvô nghĩa Dị hợp tử Đột biến sai nghĩa Dị hợp tử Đột biến sai nghĩa Dị hợp tử Đột biếnvô nghĩa Dị hợp tử Đột biếnvô nghĩa Dị hợp tử Đột biếnvô nghĩa Dị hợp tử Đột biếnvô nghĩa Dị hợp tử Đột biến sai nghĩa Dị hợp tử Đột biến sai nghĩa Dị hợp tử Đột biếnvô nghĩa Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Tác giả năm công bố Đột biến Gismodi, 1997 Chen, 2009 Đột biến Christie, 2012 Đột biến Christie, 2012 Đột biến Đột biến Azzopardi, 2008 Miyaki, 1994 203 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 STT BN Exon Nucleotide thay đổi Acid amine thay đổi 12 13 14 15 FAP 30 FAP 31 FAP 32 FAP 33 15 (Amp5) 15 (Amp4) 15 (Amp3) 15 (Amp7) c.4345A>T c.3202-3205delTCAA c.2055G>A c.5766G>C p.Cys1449Term p.Ser1068GlyfsX57 p.Trp685Term p.Gln1922His Nhận xét: kết nghiên cứu nhóm bệnh nhân cho thấy, tổng cộng có đột biến sai nghĩa (53,3%), đột biến sai khác nucleotide đột biến làm xuất mã kết thúc (46,7%), bao gồm đột biến thêm nucleotide (6,7%), đột biến thay đổi nucleotide (13,3%) đột biến từ đến nucleotide (26,7%) Trong số 15 đột biến tìm thấy có đột biến hồn tồn chưa công bố giới, chiếm tỷ lệ 40% BÀN LUẬN APC gen ức chế khối u, gồm 15 exon, sản phẩm dịch mã dài 2843 acid amin(1,6,7) Đột biến dòng mầm gen làm chức protein APC, dẫn đến bệnh liên quan thể, phổ biến bệnh ung thư đường tiêu hóa(1,4,7) Các nghiên cứu đột biến gen APC tìm 1000 đột biến cơng bố sở liệu Leiden Open Variations Database (http://www.LOVD.nl) Hầu hết đột biến đột biến điểm nên giải trình tự phương pháp hiệu để phát hiệu đột biến gen APC(5) Khi tiến hành giải trình tự để xác định đột biến gen APC, phát 15 bệnh nhân có đột biến điểm tổng số 33 bệnh nhân (chiếm tỷ lệ 45,5%) Kết nghiên cứu nhóm bệnh nhân cho thấy, tổng cộng có đột biến sai nghĩa (53,3%), đột biến sai khác nucleotide đột biến làm xuất mã kết thúc (46,7%); bao gồm đột biến thêm nucleotide (6,7%), đột biến đổi nucleotide (13,3%) đột biến từ đến nucleotide (26,7%) Trong số 15 đột biến tìm thấy có đột biến hoàn toàn chưa công bố giới, chiếm tỷ lệ 40% Khi so sánh với nghiên cứu trước Việt Nam tác giả Nguyễn Phương Anh (2011)(11), 204 Tác giả năm công bố Dị hợp tử Đột biến sai nghĩa Wallis, 1990 Dị hợp tử Đột biếnvô nghĩa Miyhoshi, 1992 Dị hợp tử Đột biến sai nghĩa Miyaki, 1994 Dị hợp tử Đột biến sai nghĩa Đột biến Kết luận đột biến tác giả Nguyễn Phương Anh phát 19 bệnh nhân có đột biến 22 bệnh nhân (chiếm tỷ lệ 86%) Tỷ lệ đột biến nghiên cứu thấp so với nghiên cứu trước vỉ tác giả Phương Anh lựa chọn đối tượng nghiên cứu bệnh nhân đa polyp thể điển hình tiến triển thành ung thư, nghiên cứu chúng tơi lựa chọn thêm đối tượng bệnh nhân thể nhẹ, số lượng polyp Mặt khác tác giả Nguyễn Phương Anh phân tích exon 15, exon lớn gen APC, chiếm 75% trình tự có chức mã hóa protein, nghiên cứu chúng tơi phân tích tồn chiều dài gen APC Theo nghiên cứu Andrzej Plawski (2009) Ba Lan, phát 80 bệnh nhân có đột biến điểm 164 gia đình bệnh nhân (chiếm tỷ lệ 48,7%)(5) Theo nghiên cứu Giovana Tardin Torrezan (2013) Brazil, phát 14 bệnh nhân có đột biến điểm 23 bệnh nhân (chiếm tỷ lệ 60%)(8) Theo nghiên cứu Jin P (2010) Trung quốc, phát bệnh nhân có đột biến điểm 14 bệnh nhân (chiếm tỷ lệ 64%)(2) Khi so sánh với nghiên cứu này, tỷ lệ đột biến nghiên cứu thấp nước Ba Lan, Brazil, Trung Quốc Theo chúng tôi, khác biệt cỡ mẫu chúng tơi hạn chế, ngồi lối sống(13) chế độ dinh dưỡng khác nhau(12) ảnh hưởng đến tỉ lệ đột biến Trong số 15 đột biến phát hiện, có đột biến chưa công bố giới(Error! Reference source not found.), nhiên phân tích khă gây bệnh đột biến phần mềm Polyphene thấy đột biến có nguy gây bệnh nghiêm trọng Có lẽ yếu tố chủng tộc, sơ đồ đột biến gen APC người Việt Nam khác biệt so với nước khác Do cần nghiên cứu cỡ mẫu lớn để Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 xây dựng đồ đột biến gen APC bệnh nhân FAP Việt Nam Đây nghiên cứu Việt Nam giải trình tự tồn 15 exon sử dụng mRNA làm khuôn mẫu để giải trình tự phát đột biến, điều có ý nghĩa quan trọng khơng bỏ sót đột biến nằm exon 15 – vùng hotspot chứa nhiều đột biến gen APC Nghiên cứu Y học Jin P et al (2010), "Detection of APC gene germline mutation in Chinese familial adenomatous polyposis by direct sequencing in combination with multiplex ligation-dependent probe amplification", Zhonghua yi xue za zhi 90(8), tr 535-539 Leppert M et al (1987), "The gene for familial polyposis coli maps to the long arm of chromosome 5", Science 238(4832), tr 1411-3 Nguyễn Phương Anh, Nguyễn Nghiêm Luật Trần Văn Khánh (2010), Nghiên cứu đột biến gene APC bệnh ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình, Luận án tiến sỹ y học, Trường đại học Y Hà Nội, Hà Nội KẾT LUẬN Nghiên cứu ứng dụng thành cơng quy trình giải trình tự để xác định đột biến điểm mRNA gen APC bệnh nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình Nghiên cứu tiền đề giúp lĩnh vực ung thư nói chung ung thư đại trực tràng đa polyp nói riêng ngày phát triển, giúp bác sĩ lâm sàng chẩn đốn xác, nhanh tiết kiệm chi phí cho bệnh nhân TÀI LIỆU THAM KHẢO Benchabane H1 Ahmed Y (2009), "The adenomatous polyposis coli tumor suppressor and Wnt signaling in the regulation of apoptosis", Adv Exp Med Biol 656, tr 7584 Haggar FA and Boushey RP (2009), "Colorectal cancer epidemiology: incidence, mortality, survival, and risk factors", Clinics in colon and rectal surgery 22(4), tr 191 Half E, Bercovich D Rozen P (2009), "Familial adenomatous polyposis", Orphanet J Rare Dis 4(22) http://www.hgmd.cf.ac.uk Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 10 11 12 13 Plawski A Slomski R (2009), "APC gene mutations causing familial adenomatous polyposis in Polish patients", J Appl Genet 49(4), tr 407–414 Poovorawan K et al (2012), "Colon Cancer Prevention by Detection of APC Gene Mutation in a Family with Attenuated Familial Adenomatous Polyposis", Asian Pacific J Cancer Prev 13(10), tr 5101-5104 Potter JD (1996), "Nutrition and colorectal cancer", Cancer Causes & Control 7(1), tr 127-146 Powell S M et al (1992), "APC mutations occur early during colorectal tumorigenesis", Nature 359, tr 235-237 Sheng JQ et al (2010), "APC gene mutations in Chinese familial adenomatous polyposis patients", World J Gastroenterol 16(12), tr 1522–1526 Torrezan GT et al (2013), "Mutational spectrum of the APC and MUTYH genes and genotype-phenotype correlations in Brazilian FAP, AFAP, and MAP patients", Orphanet Journal of Rare Diseases 8, tr 54 Ngày nhận báo: 19/9/2015 Ngày phản biện nhận xét báo: 19/9/2015 Ngày báo đăng: 20/10/2015 205 ... (FAP33) Đột biến chưa công bố Kết tỷ lệ đột biến gen APC Nhận xét: số 33 bệnh nhân mắc bệnh đa polyp đại trực tràng phân tích, phát 15 bệnh nhân bị đột biến gen APC, chiếm 45,5% Có 18 bệnh nhân. .. hết đột biến đột biến điểm nên giải trình tự phương pháp hiệu để phát hiệu đột biến gen APC( 5) Khi tiến hành giải trình tự để xác định đột biến gen APC, chúng tơi phát 15 bệnh nhân có đột biến. .. Dị hợp tử Đột biếnvô nghĩa Dị hợp tử Đột biến sai nghĩa Dị hợp tử Đột biến sai nghĩa Dị hợp tử Đột biếnvô nghĩa Dị hợp tử Đột biếnvô nghĩa Dị hợp tử Đột biếnvô nghĩa Dị hợp tử Đột biếnvô nghĩa