Bài viết trình bày ứng dụng kỹ thuật giải trình tự để xác định đột biến điểm của gen APC ở bệnh nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN ĐIỂM CỦA GEN APC Ở BỆNH NHÂN MẮC BỆNH ĐA POLYP TUYẾN GIA ĐÌNH Nguyễn Thị Băng Sương*, Bùi Chí Viết*, Nguyễn Trung Tín * , Đoàn Duy Khánh**, Võ Đức Hiếu***, Phạm Xuân Dũng***, Lê Minh Khơi*, Nguyễn Hồng Bắc* TĨM TẮT Mở đầu: Đa polyp tuyến gia đình bệnh di truyền trội nhiễm sắc thể thường, nguyên nhân gây bệnh xác định chủ yếu đột biến gen APC nằm nhiễm sắc thể số Đột biến chủ yếu gen APC đột biến điểm Nếu không phát điều trị sớm, 100% bệnh nhân tiến triển thành ung thư đại trực tràng Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự để xác định đột biến điểm gen APC bệnh nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 11 bệnh nhân chẩn đoán mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình dựa vào triệu chứng lâm sàng nội soi phát có polyp đại trực tràng với số lượng polyp > 20 polyp Các bệnh nhân ly trích DNA giải trình tự tồn vùng gen mã hóa APC Kết quả: Phát 04 bệnh nhân bị đột biến điểm gen APC, có 03 bệnh nhân bị đột biến chuyển nghĩa (missense) 01 bệnh nhân bị đột biến thêm nucleotid A Kết luận: Đã ứng dụng thành cơng quy trình giải trình tự chẩn đốn đột biến gen APC bệnh nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình Từ khóa: Ung thư đại trực tràng, gen APC, đa polyp tuyến gia đình, đột biến điểm, giải trình tự… ABSTRACT DETERMINATION OF POINT MUTATION IN APC GENE CAUSING FAMILY ADENOMATOUS POLYPOSIS Nguyen Thi Bang Suong, Bui Chi Viet, Nguyen Trung Tin, Doan Duy Khanh, Vo Duc Hieu, Pham Xuan Dung, Le Minh Khoi, Nguyen Hoang Bac * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 19 - No - 2015: 176 - 182 Introduction: Familial adenomatous polyposis (FAP) is an autosomal-dominant disease caused by mutations in the adenomatous polyposis coli (APC) gene locating on chromosome Mutations in the APC gene is mainly point mutations Unless detected and treated early, 100% of patients will progress to colorectal cancer Objective: Perform sequencing techniques to identify mutations in APC gene from Family adenomatous polyposis patients Patients and Methods: Blood samples were obtained from 11 patients who were diagnosed to have Family adenomatous polyposis based on clinical symptoms and endoscopic results of more than 20 colorectal polyps DNA were extracted and the entire APC gene were sequenced to analyzed mutations Results: Among 11 patients analyzed, we identified 04 patients showed APC mutations, including 03 missense mutation, and poly A inserted mutation * Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh *** Bệnh viện Ung Bướu TP.HCM ** Khoa Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TPHCM Tác giả liên lạc: PGS TS Nguyễn thị Băng Sương ĐT: 0913281386 Email: suongnguyenmd@gmail.com 176 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Nghiên cứu Y học Conclusion: Successfully establish sequence procedure to identify APC gene mutations dcausing family adenomatous polyposis Keywords: Colorectal cancer, APC gene, family adenomatous polyposis, point mutations, sequencing… tràng kiểm tra sau đến năm Có thể kết hợp ĐẶT VẤN ĐỀ thuốc dự phòng ung thư aspirin, Ung thư đại trực tràng bệnh lý ác tính phổ vitamin D, cycloxygenose,… biến với khoảng 655.000 người chết giới Nguyên nhân gây nên FAP xác định năm Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc ung thư đại trực đột biến gen APC (adenomatous polyposis tràng 7,5/100.000 dân Nghiên cứu coli) dòng tế bào mầm, có 85% bệnh nhân thể Nguyễn Thị Diệp Anh cho thấy Việt Nam, tỷ lệ nặng 30-60% bệnh nhân thể nhẹ mang đột mắc ung thư đại trực tràng đứng hàng thứ hai biến gen APC Gen APC nằm nhánh dài sau ung thư dày ung thư gan(6) Theo nhiễm sắc thể số 5, cấu trúc gồm 18 exon, nghiên cứu, bệnh ung thư đại trực tràng liên nhiên vùng gen mã hóa exon đến quan mật thiết với bệnh đa polyp tuyến gia đình exon 18 nên thông thường nghiên cứu (Familial adenomatous polyposis-FAP) Các khảo sát đột biến gen APC từ exon đến exon nghiên cứu ước tính khoảng 20-30% ung thư 18 Các đột biến nhỏ gen APC chiếm khoảng đại trực tràng có tiền sử gia đình Khoảng 3-4% 60-70% bệnh nhân FAP Đột biến thường tạo ung thư đại trực tràng bắt nguồn từ thể không ba kết thúc (stop codon), làm trình dịch polyp di truyền, 15% ung thư đại mã kết thúc sớm tổng hợp nên protein bị cắt trực tràng bệnh đa polyp tuyến gia đình cụt, làm chức ức chế tăng sinh tế Mặc dù chiếm tỷ lệ không lớn FAP đóng bào protein APC, hậu gây nên bệnh FAP vai trò quan trọng bệnh có khả tiến triển đến ung thư không di truyền cao(1,3) chẩn đốn sớm điều trị tích cực Mặc dù có Đa polyp tuyến gia đình bệnh di truyền nhiều phương pháp phát đột biến nhỏ trội nhiễm sắc thể thường Ở Mỹ, bệnh FAP gen APC giải trình tự trực tiếp tồn có tần suất 1/10.000 – 1/6000, Việt Nam chiều dài gen phương pháp hiệu chưa có thống kê cụ thể tỷ lệ mắc bệnh FAP xác (2) Ở Việt Nam, việc nghiên cứu đột Trên lâm sàng, bệnh đặc trưng diện biến gen APC bệnh nhân FAP hạn nhiều polyp tuyến đại tràng, thường chế Năm 2012 tác giả Nguyễn Phương Anh 100 polyp (khoảng 100-2000 polyp) Chúng có phân tích gen APC cho số gia đình bệnh thể gây chảy máu xuất máu nhân FAP, nhiên tác giả phân tích exon phân Nếu bệnh tiến triển ác tính gây sụt cân, 15 gen(6), đột biến rải rác khắp di vào gan nơi khác FAP xuất chiều dài đoạn gen Để tránh bỏ sót tổn thương, với triệu chứng khác phì đại lớp cần xây dựng quy trình phân tích tồn đoạn biểu mô sắc tố võng mạc, u nang quai hàm, u gen APC để xác định đột biến Xuất phát từ thực nang mỡ khối u xương lành tính Theo tiễn đó, chúng tơi tiến hành đề tài với mục Sheng tác giả, 100% bệnh nhân FAP tiêu: “Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự để xác định không điều trị dẫn đến ung thư đại đột biến điểm gen APC bệnh nhân mắc bệnh đa tràng tuổi 35-40(10) Cần phát sớm polyp tuyến gia đình” polyp tiền ung thư cắt bỏ chúng trước trở ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU thành ác tính Bệnh nhân bị polyp tuyến thường có nguy tái phát cao, khả tái Đối tượng nghiên cứu phát 25-30% năm đầu sau cắt Chọn lựa 11 bệnh nhân chẩn đốn mắc polyp Do sau cắt polyp nên nội soi đại bệnh đa polyp tuyến gia đình dựa vào triệu Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 177 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 chứng lâm sàng nội soi phát có polyp đại trực tràng với số lượng polyp đại trực tràng > 20 polyp Phương pháp nghiên cứu Ly trích DNA từ máu ngoại vi Các bệnh nhân lấy 2ml máu tĩnh mạch, chống đông EDTA ly trích DNA kit Qiagen Sau ly trích, tiến hành đo quang để kiểm tra nồng độ độ tinh DNA, mẫu DNA đạt chất lượng tiến hành bước phân tích Thực phản ứng PCR Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại toàn chiều dài gen APC Trình tự cặp mồi chu trình luân nhiệt chuẩn hóa Sau thực phản ứng PCR, tiến hành điện di sản phẩm khuếch đại gel agarose 1,5%, đoạn khuếch đại có vạch đồng nhất, bờ đều, sắc gọn sử dụng để giải trình tự gen Thực phản ứng giải trình tự Tiến hành tinh sản phẩm PCR, thực phản ứng cycle sequence tinh sản phẩm khuếch đại Sau điện di máy ABI 3500 Sử dụng phần mềm chuyên dụng để phân tích kết giải trình tự xác định đột biến gen APC Trình tự chuẩn gen APC mang mã số NG_008481 KẾT QUẢ NGHIÊNCỨU Kết bệnh nhân FAP 01 Kết giải trình tự exon 14 Hình Kết giải trình tự exon 14 gen APC bệnh nhân FAP 01 nucleotid C Kiểm tra phần mềm SNP Nhận xét: Check cho thấy SNP (single Tại vị trí c.1458 trình tự nucleotid nucleotide polymorphism) Genbank T, vị trí bệnh đột biến nhân xuất hai đỉnh ứng với hai allele, allele có trình tự T allele có trình tự 178 Chun Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Nghiên cứu Y học Kết giải trình tự exon 18 Hình Kết giải trình tự exon 18 gen APC bệnh nhân FAP 01 nucleotid T Sự thay đổi A thành T làm thay đổi Nhận xét acid amin codon 2231 từ Isoleucin thành Tại vị trí c.6691 trình tự nucleotid Phenylalanin, làm thay đổi cấu trúc genbank A, vị trí bệnh protein gen APC tổng hợp nên nhân xuất hai đỉnh ứng với hai allele, allele có trình tự A allele có trình tự Kết bệnh nhân FAP 06 Đột biến thêm thêm A Hình Kết phân tích gen bệnh nhân FAP 06 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 179 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Nhận xét: Có chèn thêm nucleotid A vùng c.4661-c.4666, kết giải trình tự mồi xi xuất sóng đơi từ vị trí c.4667 (hình FAP06_18G-F) Trong đoạn gen khuếch đại mồi ngược, sóng đơi xuất từ vị trí c.4660 Đột biến làm xuất mã kết thúc (TGA) codon 1558 Đột biến Gismondi cơng bố tạp chí Human Mutation vào năm 1997 Kết bệnh nhân FAP 09 Hình Kết phân tích gen APC bệnh nhân FAP 09 đổi acid amin codon 389 từ Asparagin thành Nhận xét: Tại vị trí c.1165, trình tự nucleotid Tyrosin, làm thay đổi cấu trúc của genbank A, vị trí bệnh protein gen APC tổng hợp nên Đột biến nhân FAP 09 xuất hai đỉnh ứng với hai Chen SP công bố tạp chí Am J Clin allele, allele có trình tự A allele có trình Oncol vào năm 2009 tự nucleotid T Sự thay đổi A thành T làm thay Kết bệnh nhân FAP 11 Hình Kết phân tích gen APC bệnh nhân FAP 11 180 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Nhận xét: Tại vị trí c.4367, trình tự nucleotid genbank A, vị trí bệnh nhân FAP 11 xuất hai đỉnh ứng với hai allele, allele có trình tự A allele có trình tự nucleotid C Sự thay đổi A thành T làm thay đổi acid amin codon 1456 từ Lysin thành Threonin, làm thay đổi cấu trúc protein gen APC tổng hợp nên BÀN LUẬN Đột biến gen từ lâu xác định nguyên nhân gây bệnh quan trọng, đặc biệt bệnh lý di truyền Đây tổn thương xảy sớm gen người tác dụng chế điều hòa gen với tương tác phân tử nội bào hay tương tác tế bào mà biểu thành thể bệnh nặng, nhẹ khác Đột biến gen tồn thể người bệnh phát sinh sống hàng ngày tác động nạn ô nhiễm môi trường, tình trạng sử dụng thực phẩm bảo quản hóa chất độc hại,… Trong năm gần Việt Nam, có nhiều cơng trình nghiên cứu xác định đột biến gen bệnh lý di truyền đưa quy trình chẩn đoán bệnh nhân việc phát người lành mang gen bệnh Điều có ý nghĩa thực tiễn cao, giúp làm giảm tỷ lệ bệnh di truyền lan truyền gen bệnh cộng đồng Đối với bệnh đa polyp tuyến gia đình, tác giả Nguyễn Phương Anh tiến hành nghiên cứu xác định đột biến exon 15 gen APC bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình phát đột biến gen người nhà bệnh nhân(5) Một biến chứng bệnh đa polyp tuyến gia đình khả tiến triển thành ung thư đại trực tràng (UTĐTT)- bệnh di truyền thường gặp ung thư đường tiêu hoá Ngày tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh UTĐTT toàn giới tăng lên Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc ung thư đại trực tràng 7,5/100.000 dân Nghiên cứu Nguyễn Thị Diệp Anh cho thấy UTĐTT đứng hàng thứ hai Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Nghiên cứu Y học sau ung thư dày ung thư gan(9) Năm 2006, Nguyễn Văn Hiếu tiến hành nghiên cứu đặc điểm lâm sàng giải phẫu bệnh ung thư đại trực tràng bệnh viện K đưa kết luận: việc phát ung thư đại trực tràng giai đoạn sớm (giai đoạn Dukes A) góp phần nâng cao hiệu điều trị(8) Các nghiên cứu khẳng đình đa polyp tuyến gia đình khơng phát sớm điều trị kịp thời 100% bệnh nhân tiến triển thành ung thư đại trực tràng(4) Việc chẩn đoán đột biến gen APC bệnh nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình sở cho việc chẩn đoán người lành mang gen bệnh giúp phát sớm đột biến thành viên khác gia đình, thành viên xuất triệu chứng lâm sàng chưa Như đưa phương thức điều trị thích hợp, giảm biến chứng ung thư đại trực tràng đối tượng mắc bệnh Có hai dạng đột biến gen APC phổ biến bệnh nhân FAP đột biến điểm (chiếm 60-70%) đột biến đoạn (chiếm 1015%) Để phát đột biến điểm, xây dựng quy trình giải trình tự đoạn exon vùng nối exon-intron gen APC Ở bệnh nhân FAP 01, giải trình tự exon 14 chúng tơi phát vị trí c.1458 trình tự nucleotid genbank T, vị trí bệnh nhân xuất hai đỉnh ứng với hai allele, allele có trình tự T allele có trình tự nucleotid C Kiểm tra phần mềm kiểm tra SNP, phát SNP khơng phải đột biến Điều có nghĩa phân tích vị trí cộng đồng, số người bình thường xuất nucleotid T vị trí này, số cá thể bình thường khác lại xuất nucleotid C (tần suất > 1%) Như vấn đề quan trọng giải trình tự vấn đề phân tích khác thường nhiều nucleotid, cần xác định xem SNP đột biến điểm gây bệnh Trong nghiên cứu sử dụng phối hợp 03 phần mềm phân tích SNP SNP check, fast SNP polyphene để phân 181 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 tích bất thường quan sát bệnh nhân FAP Khi khảo sát exon 18 bệnh nhân FAP 1, Tại vị trí c.6691 trình tự nucleotid genbank A, vị trí bệnh nhân xuất hai đỉnh ứng với hai allele, allele có trình tự A allele có trình tự nucleotid T Sử dụng phần mềm kiểm tra SNP, nhận thấy SNP bất thường có khả gây bệnh cao Sự thay đổi A thành T làm thay đổi acid amin codon 2231 từ Isoleucin thành Phenylalanin, làm thay đổi cấu trúc protein gen APC tổng hợp nên Như kết luận bệnh FAP 01 bị đột biến điểm vị trí c.6691A>T Tương tự phân tích gen APC bệnh nhân khác chúng tơi phát có 04 bệnh nhân mang đột biến điểm tổng số 11 bệnh nhân phân tích Nghiên cứu bước đầu chẩn đốn số bệnh nhân, tiếp tục nghiên cứu cỡ mẫu lớn để đưa vị trí đột biến thường gặp bệnh nhân FAP Việt Nam Bên cạnh chúng tơi tiến hành phân tích kiểu gen thành viên khác gia đình bệnh nhân phát có đột biến để xác định nguy mắc bệnh thành viên khác, đồng thời đưa lời khuyên di truyền có hướng điều trị thích hợp nhằm giảm nguy ung thư cho thành viên khác KẾT LUẬN Nghiên cứu ứng dụng thành công quy trình giải trình tự để xác định đột biến điểm gen APC bệnh nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình, nghiên cứu tiền đề giúp lĩnh vực ung thư nói chung ung thư đại trực tràng đa polyp nói riêng ngày phát triển, giúp bác sĩ lâm sàng chẩn đốn xác điều trị bệnh 182 TÀI LIỆU THAM KHẢO: 10 Cao X, Hong Y, Eu KW, Loi C, Cheah PY (2006) Singapore familial adenomatous polyposis (FAP) patients with classical adenomatous polyposis but undetectable APC mutations have accelerated cancer progression Am J Gastroenterol 101(12):2810-7 Chiang JM, Chen HW, Tang RP, Chen JS, Changchien CR, Hsieh PS, Wang JY (2010) Mutation analysis of the APC gene in Taiwanese FAP families: low incidence of APC germline mutation in a distinct subgroup of FAP families Familial Cancer 9(2): 117-124 Gómez-Fernández N, Castellví-Bel S, Fernández-Rozadilla C, Balaguer F, Muñoz J, Madrigal I, Milà M, Graña B, Vega A, Castells A, Carracedo A, Ruiz-Ponte C (2009) Molecular analysis of the APC and MUTYH genes in Galician and Catalonian FAP families: a different spectrum of mutations BMC Med Genet 10:57 Hosogi H, Nagayama S, Kanamoto N, Yoshizawa A, Suzuki T, Nakao K, Sakai Y (2009) Biallelic APC inactivation was responsible for functional adrenocortical adenoma in familial adenomatous polyposis with novel germline mutation of the APC gene: report of a case Jpn J Clin Oncol 39(12):837-46 Marra G, Jiricny J (2003) Multiple colorectal adenomas is their number up? N Engl J Med 348(9):845-7 Nguyễn Phương Anh (2011) Nghiên cứu đột biến gen APC bệnh ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình Luận án tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội Nguyễn Thị Lụa, Lê Thị Tài, Lê Trần Ngoan (2007) Nghiên cứu thực trạng ung thư dày giải pháp phòng bệnh số tỉnh miền Bắc Việt Nam Nghiên cứu y học, tập 50 (4), tr.130-7 Nielsen M, Bik E, Hes FJ, Breuning MH, Vasen HF, Bakker E, Tops CM, Weiss MM (2007) Genotype-phenotype correlations in 19 Dutch cases with APC gene deletions and a literature review Eur J Hum Genet 15(10):1034-42 Powell SM, Zilz N, Beazer B, Bryan Y, Hamilton TM et al (1992) APC mutations occur early during colorectal tumorigenesis Nature 359: 235-237 Sheng JQ, Cui WJ, Fu L, Jin P, Han Y, Li SJ, Fan RY, Li AQ, Zhang MZ, Li SR (2010) APC gene mutations in Chinese familial adenomatous polyposis patients World J Gastroenterol 16(12):1522-6 Ngày nhận báo: 29/8/2015 Ngày phản biện nhận xét báo: 16/9/2015 Ngày báo đăng: 20/10/2015 20/10/2015 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học ... với bệnh đa polyp tuyến gia đình, tác giả Nguyễn Phương Anh tiến hành nghiên cứu xác định đột biến exon 15 gen APC bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình phát đột biến gen. .. đình đa polyp tuyến gia đình khơng phát sớm điều trị kịp thời 100% bệnh nhân tiến triển thành ung thư đại trực tràng(4) Việc chẩn đoán đột biến gen APC bệnh nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình. .. để xác định không điều trị dẫn đến ung thư đại đột biến điểm gen APC bệnh nhân mắc bệnh đa tràng tuổi 35-40(10) Cần phát sớm polyp tuyến gia đình polyp tiền ung thư cắt bỏ chúng trước trở ĐỐI