NGHIÊN cứu đột BIếN TRêN một số VùNG TRọNG ĐIểM CủA GEN G6PD ở BệNH NHâN THIếU hụt ENZYM G6PD

Đến nay, hơn 180 đột biến đã được xác định trên thế giới, trong đó hầu hết làđột biến thay thế một nucleotide, phân bố dọc trên 13 exon của gen và tập trung chủ nhiên, theo các nghiên cứ

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Trần Vân Khánh

2 TS Nguyễn Hoàng Việt

ARMS Hệ thống khuyếch đại các đột biến bền với nhiệt

(Amplification Refractory Mutation System)

EDTA Ethylen diamin tetraacetic acid

G6PD Glucose - 6 - phosphatase dehydrogenase

(High Melting Resolution)

PASA Khuếch đại PCR của các alen đặc hiệu

(PCR amplification of specification of specific alleles)

DANH MỤC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ

Glucose - 6 - phosphatase dehydrogenase (G6PD) là enzyme then chốt mở đầucho chu trình pentose phosphate trong chuyển hóa glucose, oxi hóa Glucose-6-phosphate thành 6-phosphogluconolactone, đồng thời chuyển NADP+(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) thành NADPH Trong tế bào hồngcầu, NADPH tham gia vào phản ứng chuyển glutathione từ dạng oxi hóa (GSSG)thành dạng khử (GSH) - giúp bảo vệ các nhóm sulphydryl của hemoglobin và màng

tán huyết nhanh chóng dưới tác dụng của các tác nhân oxy-hoá

Thiếu G6PD là bệnh lý về men thường gặp nhất ở người, ảnh hưởng đến hơn

400 triệu người trên thế giới Đa số các trường hợp thiếu hụt G6PD không có biểu

sàng như vàng da ở trẻ sơ sinh, thiếu máu huyết tán Enzyme G6PD là sản phẩm mãhóa của gen G6PD nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể giới tính X tại vị trí Xq28,gen có độ dài khoảng 18,5 kb, gồm 13 exon và 12 intron Đột biến trên gen G6PD

sẽ dẫn đến việc giảm hoặc ngừng quá trình tổng hợp enzyme, gây ra bệnh thiếuenzyme G6PD

Đến nay, hơn 180 đột biến đã được xác định trên thế giới, trong đó hầu hết làđột biến thay thế một nucleotide, phân bố dọc trên 13 exon của gen và tập trung chủ

nhiên, theo các nghiên cứu điều tra về sự phân bố đột biến, các dạng đột biến tìmthấy là khác nhau ở những quốc gia, vùng lãnh thổ khác nhau Điểm nóng đột biến(hot spot) ở các nước châu Á được cho là ở exon 9,11,12 [15]

Tại Việt Nam, thiếu enzyme G6PD là một bệnh khá phổ biến, chiếm tỷ lệ dao

khu vực và các nhóm dân tộc Điều trị bệnh tạm thời dừng lại ở điều trị triệu chứng vìvậy phát hiện sớm nhằm tư vấn giúp nâng cao chất lượng sống cho người bệnh, phòngtránh được các biến chứng có thể xảy ra do thiếu enzyme G6PD là việc làm quan trọng

và ý nghĩa Từ năm 1960 đến nay, đã có nhiều nghiên cứu về G6PD điều tra tỷ lệ mắc

bệnh, đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của đối tượng thiếu hụt enzyme G6PD Một sốnghiên cứu gần đây tiến hành tập trung vào xác định các dạng đột biến thường gặp tuynhiên nghiên cứu áp dụng kĩ thuật giải trình tự gen để xác định đột biến G6PD đượctiến hành trên đối tượng dân tộc Kinh thuộc khu vực miền Bắc chưa nhiều Nhằm gópphần vào cơ sở dữ liệu về nghiên cứu bệnh thiếu enzyme G6PD và các đột biến tạivùng trọng điểm của gen, chúng tôi tiến hành đề tài với mục tiêu:

Xác định đột biến trên exon 9, 10, 11, 12 của gen G6PD ở bệnh nhân thiếu hụt enzym G6PD bằng kỹ thuật giải trình tự gen.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I.1. Những hiểu biết về G6PD

I.1.1 Đặc điểm cấu trúc của G6PD

Men G6PD lần đầu tiên được hai tác giả Otto Warburg và Christan phát hiệnvào năm 1930 trên hồng cầu ngựa và sau đó trên một số hồng cầu của động vật, visinh vật, men bia và hồng cầu người [1] Năm 1966, Yoshida và cộng sự tách chiếtđược G6PD từ hồng cầu người Từ những thông tin về cấu trúc ban đầu, trọnglượng phân tử và các thông số động học của G6PD mới dần được làm sáng tỏ

môi trường trung tính thì dạng dimer và tetramer có tỷ lệ bằng nhau [2] Sự trùnghợp của các monomer thành các dimer và các dạng cao hơn có hoạt tính xúc tác cần

sự có mặt của NADP+ NADP+ được gắn với enzyme vừa như một phức hợp cấutrúc ổn định G6PD nhờ việc ngăn cản sự chuyển dạng enzyme từ dimer thànhmonomer không hoạt động, vừa như cơ chất của phản ứng, là chất cộng tác củaenzyme G6PD Monomer G6PD gồm 515 acid amin, khối lượng phân tử là 59,256dalton Trên mỗi dimer có hai vị trí gắn NADP+, tại vị trí gắn NADP chức năng,NADP gắn chặt chẽ hơn và cần thiết để duy trì cấu trúc oligo hoạt động củaenzyme Tính đồng nhất của trình tự acid amin thay đổi tùy theo vùng Vùng có tínhđồng nhất cao được cho là vùng có chức năng quan trọng, ở người, vùng này thuộcacid amin 188-291

I.1.2 Vai trò của G6PD trong chuyển hóa hồng cầu

Hình 1.2 Vai trò của G6PD trong hồng cầu

G6PD là một enzyme oxy hóa khử, có chức năng xúc tác phản ứng đầu tiêncủa con đường pentose phosphate Về mặt năng lượng, Hexose monophosphate làcon đường oxy hóa glucose xảy ra ở các mô song song với con đường đường phânsong con đường này cung cấp năng lượng không đáng kể vì chỉ có khoảng 7-10%glucose được thoái hóa, nhưng con đường này về mặt sinh lý lại là nguồn gốc chủyếu cung cấp NADPH cho hồng cầu NADPH là một coenzyme khử, cần cho phảnứng của nhiều con đường sinh tổng hợp khác nhau và liên quan mật thiết với một

chuỗi phản ứng tiếp theo để bảo vệ hồng cầu như tái tạo glutathione dạng khử(GSH) từ glutathione dạng oxy hóa (GSSG), khử MetHb thành Hb và có nhiệm vụcung cấp ribose-5-phosphat sử dụng cho quá trình tổng hợp acid nucleic Đặc biệttrước một tác nhân oxy hóa bất ngờ thì sự giáng hóa glucose theo con đường này lạităng lên gấp hai mươi đến ba mươi lần thậm chí cao hơn nữa Trong con đường này,G6PD oxy hóa G-6-P thành 6-phosphogluconolacton, với coenzyme là NADP+,chất nhận hydro và trở thành NADPH [3] Hồng cầu với chức năng chính là vậnchuyển oxy, do chứa nhiều oxy nên cấu trúc của hồng cầu thường xuyên có nguy cơ

bị oxy hóa và rất nhạy cảm với các quá trình oxy hóa, do đó chúng rất dễ bị hủyhoại NADPH hoạt động thông qua phản ứng chuyển GSSG thành GSH với sự thamgia của enzyme glutathione reductase GSH tạo thành sẽ ngăn cản quá trìnhperoxide của các cấu tử hồng cầu, trực tiếp bảo vệ hồng cầu khỏi các tác nhân oxyhóa [4] Glutathion peroxidase (GSHPx) loại bỏ các chất oxy hóa ra khỏi hồng cầutheo phản ứng:

Ngoài ra, một cơ chế khác bảo vệ hồng cầu là: quá trình khử MetHb cùngđồng thời diễn ra nhờ hệ thống enzyme methemoglobin reductase (MetHbR) mà cầncoenzyme là NADPH và NADH Khi NADPH bị oxy hóa, GSSG bị khử thànhGSH, NADPH chuyển thành NADP+ và G6PD trở nên hoạt động, khử NADP+thành NADPH Khi hồng cầu thiếu G6PD, con đường hexose monophophat bị ngừngtrệ NADPH sẽ không được tạo thành, dẫn đến GSH không đủ Kết quả là việc bảo vệhồng cầu không hiệu quả Hồng cầu dễ bị tấn công bởi các tác nhân oxy hóa, khi nàyquá trình oxy hóa diễn ra rất mạnh và có nguy cơ làm tăng quá trình peroxide hóa cáccấu tử của nó GSH sẽ càng không đủ cho nhu cầu của quá trình chuyển hóa, làm thayđổi chức năng màng hồng cầu và hemoglobin bị biến tính Hemoglobin bị oxy hóathành một hợp chất không bền với HbH2O2 với hàm lượng khá cao và rất độc chohồng cầu, dẫn đến màng hồng cầu bị tổn thương và bị vỡ [5]

I.2. Bệnh lý thiếu hụt enzyme G6PD

I.2.1 Đặc điểm lâm sàng

Những đối tượng thiếu men G6PD thường không có biểu hiện triệu chứng lâmsàng hoặc nếu có chỉ biểu hiện rất nhẹ Tuy nhiên, khi tiếp xúc với các tác nhân oxihóa như một số loại thuốc, hóa chất và thức ăn có tính oxi hóa cao có thể dẫn đếncác hội chứng lâm sàng:

Tình trạng thiếu máu tán huyết và vàng da sơ sinh kéo dài là hai vấn đềnghiêm trọng mà trẻ thiếu men G6PD gặp phải Vàng da ở trẻ sơ sinh là một hiệntượng sinh lý bình thường do vỡ hồng cầu trong những ngày đầu sau sinh Cáctrường hợp vàng da kéo dài có thể do nhiều nguyên nhân khác nhau, trong đó thiếuG6PD được xem như một yếu tố nguy cơ dẫn tới vàng da bệnh lý Bilirubin giántiếp tăng trong máu do hồng cầu bị vỡ gây vàng da Mức độ vàng da phụ thuộc vàomức độ tan máu Nếu bilirubin tự do ứ nhiều sẽ thấm vào não gây ra biến chứng

quả nghiêm trọng của bệnh lý này là vàng da nhân [6] Biểu hiện bởi các cơn tăngtrương lực cơ, xoắn vặn, mất các phản xạ sơ sinh, ngừng thở tím tái và có thể dẫntới tử vong Nếu qua khỏi, có thể để lại bất thường về giác quan hay những di chứngảnh hưởng tới khả năng phát triển tinh thần và vận động của trẻ

Tình trạng tan máu xảy ra ở bệnh nhân sốt rét được điều trị bằng primaqine đãđược Ernest Beutler ghi nhận vào những năm 50 của thế kỉ trước [7] Năm 1980,Phạm Đình Vy đã báo cáo một trường hợp điều trị đái huyết sắc tố do tan máu cấptrên bệnh nhân thiếu hoàn toàn men G6PD và bị ngộ độc thuốc sốt rét dẫn đến suythận cấp vô niệu, được tiến hành thay máu toàn bộ Thuốc primaquine là một trongnhững thuốc làm giảm tuổi thọ của hồng cầu ở người thiếu men G6PD, đã cónghiên cứu sau khi cho bệnh nhân uống primaquine vài ngày đã cho thấy hàmlượng hemoglobine giảm xuống rõ rệt, nước tiểu sậm màu, bệnh nhân có sốt cao,

vàng da Một số thuốc khác cũng có thể gây nên tình trạng tan máu trên lâm sàng ởngười thiếu men G6PDH như acetaminophen, acid ascorbic, sulfaguanidine,chloramphenicol,… Mức độ tán huyết và gây thiếu máu tùy thuộc vào nhiều yếu tố,

có thể là mức độ thiếu men G6PD, liên quan đến kiểu đột biến và loại tác nhân cótính oxy hóa mạnh [8] Ngoài ra, tan máu cấp có thể xảy ra sau nhiễm vi khuẩn,virus, nhiễm toan cetonic là lí do dùng thuốc [9]

Là bệnh lý thiếu máu tan máu cấp tính xảy ra sau khi ăn đậu tầm vài giờ hayngửi phấn hoa đậu tầm Thành phần trong đậu fava có chất divicine (chủ yếuconvicine và vicine) có khả năng oxy hóa rất mạnh, khi vào cơ thể hai chất này gâygiảm glutathion khử rất nhanh và mạnh Vì thế, những bệnh nhân thiếu hụt G6PDkhi ăn đậu tầm sẽ dẫn đến cơn tan máu cấp sau 24-48 giờ Cơn tan máu rất mạnh, cóthể đe dọa tính mạng, vàng da, hemoglobin niệu, thường dẫn tới suy thận cấp Đa sốcác trường hợp tan máu xảy ra ở những cá thể thiếu hụt G6PD nặng, đôi khi cũnggặp ở những cá thể thiếu G6PD thể nhẹ Bệnh nhân mắc bệnh Favim luôn thiếuG6PD tuy nhiên không phải tất cả bệnh nhân thiếu G6PD đều gặp triệu chứng saukhi ăn đậu fava [4]

Biểu hiện lâm sàng gồm thiếu máu mạn tính, vàng da nhẹ, lách to ít Thiếumáu tan máu mạn tính mức độ từ nhẹ đến nặng Cơn tan máu tăng thêm khi có sốt,dùng thuốc oxi hóa hoặc ngộ độc đậu tầm Chủ yếu gặp nhiều ở người Bắc Âu [10,107-112]

I.2.2 Phân loại

Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã chia các biến thể của bệnh lý thiếu hụt G6PDthành 5 lớp, dựa vào hoạt độ của enzyme trong hồng cầu và biểu hiện lâm sàng củachúng Tuy nhiên sự phân biệt giữa các lớp này không phải luôn rõ ràng

Lớp Lâm sàng Hoạt độ enzyme so với

bình thường

có biểu hiện lâm sàng

60 - 100%

I.2.3 Đặc điểm cận lâm sàng

bình thường

I.2.4 Điều trị

Thường thì triệu chứng sẽ tự hết sau khi những chất gây khởi phát bệnh đượcthải trừ, trong những trường hợp tan máu do dùng thuốc hoặc hóa chất, ngay lập tứcdừng thuốc Nếu tan máu nặng cần truyền máu Truyền thay máu để đề phòng vàng

da nhân ở thể tan máu sơ sinh khi lượng bilirubin tự do quá ngưỡng

I.2.5 Phòng bệnh

Phòng bệnh đóng vai trò quan trọng

tuyên truyền trong cộng đồng ý thức được ý nghĩa tầm soát bệnh

và những nguy hiểm có thể gặp phải và các biện pháp phòng tránh

bệnh

hóa trong danh mục khuyến cáo Thông báo về tình trạng thiếu men G6PDcủa bản thân cho bác sĩ trước khi sử dụng thuốc Trường hợp bắt buộc phải

dùng các loại thuốc có nguy cơ thì cần theo dõi chặt chẽ vấn đề tan máu,vàng da

nghiệm hoạt độ enzyme G6PD trở thành xét nghiệm thường quy trước chỉđịnh điều trị các thuốc có tính oxy hóa cao như Primaquine

I.2.6 Cơ sở di truyền của bệnh thiếu hụt G6PD

I.2.6.1 Gen mã hóa tổng hợp G6PD

Vị trí gen mã hóa tổng hợp G6PD được định khu trên nhánh dài, vùng 2 băng

8 của NST X [2] Vùng này gắn với rất nhiều gen khác như gen mã hóa hội chứngnhiễm sắc thể X gãy, hemophilia, gen quy định màu sắc khi nhìn và nếu bị đột biến

sẽ gây bệnh mù màu Gen G6PD dài khoảng 18-20kb, gồm 13 exon và 12 introngồm 25861 nucloetid, khung đọc mở dài 1545 nucleotid Kích thước của các exon

mã hóa thay đổi rất nhiều, từ 38 – 236bp Hầu hết các intron đều ngắn hơn 1kb, chỉ

có intron 2 dài hơn bình thường (khoảng 12kb) Exon 1 và đầu 5’ của exon 2 không

mã hóa Bộ ba mã hóa đầu tiên nằm trên exon 2 [11] Chức năng của từng exon có

sự khác nhau Gen cấu trúc của G6PD gồm 20014 bp được mã hóa mRNA G6PDgồm 2269 nucleotid, tương ứng với 2,4 kb mRNA của G6PD có 1 đoạn đầu 3’ dài

655 bp và đoạn đầu 5’ dài 69 bp không mã hóa [12]

Hình 1.3 Vị trí gen G6PD trên nhiễm sắc thể X

1.2.6.2 Cơ sở di truyền bệnh thiếu G6PD

Thiếu hụt men G6PD là một bệnh lý di truyền liên kết nhiễm sắc thể giới tính

X, không có alen trên Y Nữ giới, mỗi tế bào đều có 2 alen mã hóa cho G6PD (mộtalen nhận từ bố và 1 alen nhận tự mẹ) Những người nữ dị hợp tử vì mang gen độtbiến lặn nên có thể có kiểu hình bình thường, tuy nhiên có thể có các biểu hiện bệnh

lý ở mức độ nhẹ hoặc vừa, một số cá thể biểu hiện rất nặng Nguyên nhân do mộttrong hai nhiễm sắc thể X trong tế bào ở nữ đã bị bất hoạt từ giai đoạn sớm của thời

kỳ phôi thai, sau đó theo quá trình phân bào, nó được nhân lên tạo thành cơ thểdạng khảm giữa những tế bào có nhiễm sắc thể lành và nhiễm sắc thể mang gen độtbiến với các tỷ lệ khác nhau Do đó, những người nữ này có hai nhóm hồng cầu:một nhóm bình thường và một nhóm hồng cầu có thiếu hụt G6PD, tỷ lệ của chúngthay đổi trong phạm vi rộng 50:50 [8] Một số ít trường hợp, các hồng cầu bấtthường chỉ chiếm 1%, nhưng cũng có khi lên đến 99% Ngược lại, nam giới chỉ cómột nhiễm sắc thể X di truyền từ mẹ nên nếu thừa hưởng gen bị đột biến họ sẽ cókiểu gen bán hợp tử và sẽ biểu hiện kiểu hình thiếu men G6PD Có nhiều dạng độtbiến gây nên thiếu hụt G6PD nhưng chủ yếu là đột biến điểm, thay thế mộtnucleotid, dẫn đến thay thế acid amin này bằng một acid amin kia và cuối cùng làthay đổi cấu trúc protein Khi gen cấu trúc bị đột biến sẽ gây nên thiếu men G6PD

về mặt chất lượng Nếu đột biến xảy ra trên gen điều hòa hoặc gen khởi động sẽ làmgiảm số lượng enzyme G6PD Sự biến đổi về mặt số lượng và chất lượng của phân

tử enzyme đều dẫn đến thay đổi hoạt độ của enzym

Các xét nghiệm định tính và định lượng chẩn đoán thiếu G6PD được dựa trên

cơ sở đo tốc độ tạo thành NADPH từ NADP+ khi có G6P làm cơ chất, phục vụ chomục đích chẩn đoán nhanh, kỹ thuật ít phức tạp và chi phí thấp Tuy nhiên đối vớitrường hợp nữ giới mang gen dị hợp tử kết quả hoạt độ enzyme có thể vẫn nằmtrong giới hạn bình thường [8] Ngoài ra, thời điểm xét nghiệm gần với cơn tanmáu, thời điểm này hồng cầu non và hồng cầu lưới là những tế bào có hoạt độenzyme cao chiếm ưu thế có thể dẫn tới xét nghiệm âm tính giả Các xét nghiệmG6PD dựa trên các kỹ thuật phân tử sẽ khắc phục những hạn chế của xét nghiệmsinh hóa vì tính ổn định của DNA

I.2.7 Tổng quan tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam

Với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là lĩnh vực sinh học phân tử, cơ

sở gen học, các dạng đột biến của bệnh thiếu G6PD ngày càng được làm rõ Bệnh

có thể gặp ở tất cả dân tộc, với khoảng hơn 400 triệu người trên thế giới thiếu menG6PD [13] [14] Các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ thiếu G6PD cũng như các dạng độtbiến của bệnh có sự khác nhau giữa các dân tộc và vùng địa lý Trên thế giới, tỷ lệbệnh cao nhất vẫn là các khu vực Địa Trung Hải, châu Phi và nam Á, ít nhất là ởbắc Âu [13] Tại Đông Nam Á, tỷ lệ thiếu hụt G6PD dao động trong khoảng từ 0-14%, một số quốc gia như ở Lào là 7.2%, Thái Lan 11.5%, Indonesia là 3.7% vàMyanmar là 5.4%, Việt Nam nằm trong vùng có tỷ lệ này dao động khoảng 0,3-9%[15] Theo thống kê năm 2012, số lượng đột biến gen G6PD được công bố trên thếgiới là 186 đột biến Trong đó, 159 đột biến tìm thấy là đột biến điểm chiếm 85,4%,

15 (8%) đột biến thay thế 2 hay nhiều nucleotide, 10 (5,3%) đột biến xóa đoạn và 2(1%) đột biến xảy ra trên intron Hơn 442 biến thể được xác định dựa vào kỹ thuậtenzyme học, 68 đột biến thuộc phân lớp I chiếm tần số tương đối cao trên tổng sốđột biến điểm được xác định, tập trung chủ yếu ở các exon 6, 8, 10, 13, đột biên với

số lượng cao nhất tại exon 10 [16] Mỗi dạng đột biến gây ra những bệnh cảnh vàmức độ nặng nhẹ khác nhau như thiếu máu tan huyết, vàng da, đái huyết sắc tố, suythận trước sự tấn công của các chất ô xy hóa như một số thức ăn, một số loại thuốc,hay nhiễm khuẩn Đột biến thuộc phân lớp I thường dẫn đến kiểu hình nghiêmtrọng, thiếu máu tan máu hồng cầu không hình cầu mạn tính với hoạt tính enzymedưới 10% so với người bình thường Vì vậy việc xác định cá thể mắc bệnh thuộc

phân lớp này thường dễ dàng hơn so với phân lớp khác trong dân số nói chung Cácloại đột biến được tìm thấy thường phân bố có tính khu vực ở Myanmar, hơn 90%trường hợp thiếu G6PD là đột biến G6PD Mahidol (487GA) và không gặp độtbiến G6PD Viangchan (871GA, 1311C T) [17] Trái ngược với Myanmar, hơn90% số ca mắc bệnh thiếu G6PD tại Campuchia là G6PD Viangchan, và không cótrường hợp của G6PD Mahidol [18], [19] Viangchan là đột biến phổ biến nhất gặp

ở nhiều quốc gia thuộc khu vực Đông Nam Á như Lào, Thái Lan, Campuchia vớitần suất từ 9% đến 88,9% [11],[15], [18] Theo phân loại của Tổ chức y tế thế giới(WHO,1989), G6PD Viangchan nằm trong phân lớp II với hoạt tính enzyme từ 1-10% so với người bình thường

Một số đột biến gen G6PD được tìm thấy tại Đông Nam Á

Tại Việt Nam, thiếu G6PD đã được nghiên cứu từ những năm 1960, cácnghiên cứu tập trung vào cấu trúc, đặc tính của enzyme, xác định tỷ lệ thiếu hụtG6PD, biểu hiện lâm sàng, đặc điểm xét nghiệm của người thiếu hụt G6PD và sự

Nam thì tỷ lệ thiếu G6PD chung là 4,80% (292 trên 6.079 người) trong đó cao nhất

là người Rục - Quảng Bình là 18,92%, Mường - Hòa Bình 16%, Tày ở Cao Bằng vàKhánh Hòa 14,15%, Katu - Huế 10,96%, Raglai - Khánh Hòa 2,42% và thấp nhất

là người Kinh – Hà Nội 1,59% [20]

Các dạng đột biến thường gặp trong các nghiên cứu tại Việt Nam như:Viangchan, Canton, Kaiping, Union thuộc lớp II; Gaohe, Chatham thuộc lớp III;Chinese - 5 chưa phân lớp Các đột biến trên thuộc các exon 2, 9, 11, 12 Một đột

biến khác dạng Silent cũng xuất hiện trên exon 11, 1311C>T bộ ba TAC TAT cùng

mã hóa cho Tyrosine nên không làm biến đổi thứ tự acid amin, đột biến này thườngxuất hiện đồng thời cùng một số đột biến khác như Viangchan và Canton với tầnsuất tương đối cao [5], [6] Năm 2013, Nguyễn Thị Huế và cộng sự nghiên cứu trên

30 trẻ sơ sinh nam thuộc dân tộc Kinh, 7 loại đột biến được tìm thấy Trong đóViangchan và Canton là hai loại đột biến gặp nhiều nhất trong nghiên cứu với tỷ lệlần lượt là 43,33% và 26,6% Các đột biến tập trung chủ yếu trên exon 9,11,12,không tìm thấy đột biến trên các exon 3,4,6,7,10,13 [11] Kết quả này phù hợp vớinhận định của một số nghiên cứu, nhận thấy điểm nóng đột biến (hot spot) ở cácnước châu Á là ở exon 9,11,12 [15] Ngoài ra, Việt Nam cũng đã đóng góp vào cơ

sở dữ liệu đột biến gen G6PD với các đột biến phát hiện gặp lần đầu tiên như G6PDBao Loc (118 Tyr > His), Vietnam1 (3Glu > Lys),Vietnam2 (66Phe >Cys),Vietnam3 (73Ser > Ser)

I.3. Các phương pháp sinh học phân tử phát hiện đột biến gen G6PD

Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR được phát triển bởi Kary Mullis vào những năm 1980 Đây là một

kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm nhân bản một hay vài đoạnDNA thành nhiều bản sao Phản ứng PCR dựa trên nguyên tắc biến tính, hồitính của DNA bởi nhiệt độ và khả năng của DNA polymerase tổng hợp chuỗiDNA mới bổ sung cho chuỗi mẫu ban đầu

Hình 1.4 Các giai đoạn của phản ứng PCR

1.Giai đoạn biến tính; 2.Giai đoạn gắn mồi; 3 Giai đoạn kéo dài

(Nguồn: https://en.wikipedia.org/)

Phản ứng PCR bao gồm 3 giai đoạn

này đã làm đứt các liên kết hidro, từ đó DNA mạch kép tách thành 2 mạch khuôncho quá trình tổng hợp

đoạn oligonucleotide gắn với sợi DNA khuôn Enzyme DNA polymerase bền vớinhiệt sẽ được hoạt hóa và bắt đầu giai đoạn kéo dài mồi

polymerase xúc tác cho quá trình kéo dài

Để khuếch đại thành công đoạn gen đích, chu kỳ nhiệt gồm 3 giai đoạn trênđược nhắc lại 25 – 40 lần Số lượng chu kỳ tùy thuộc vào mục đích ứng dụng cụ

tùy theo mục đích sử dụng và loại thiết bị tạo chu kỳ nhiệt được sử dụng

Phản ứng PCR có độ nhạy cao, có thể chỉ cần một phân tử DNA làm khuôncũng thu được sản phẩm Vì vậy phản ứng này được ứng dụng rộng rãi và có nhữngbiến đổi phù hợp với từng mục đích riêng Trên cơ sở đó, có rất nhiều phương phápđược sử dụng để xác định đột biến gây bệnh thiếu hụt G6PD như: phương pháp