NGHIÊN cứu đột BIếN TRêN một số VùNG TRọNG ĐIểM CủA GEN G6PD ở BệNH NHâN THIếU hụt ENZYM G6PD

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI TRẦN THỊ MAI ANH NGHI£N CứU ĐộT BIếN TRêN MộT Số VùNG TRọNG ĐIểM CủA GEN G6PD ë BƯNH NH©N THIÕU HơT ENZYM G6PD Chun ngành : Xét nghiệm Y học Mã ngành : 8720601 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Vân Khánh TS Nguyễn Hoàng Việt HÀ NỘI - 2019MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ARMS Hệ thống khuyếch đại đột biến bền với nhiệt (Amplification Refractory Mutation System) ASP PCR đặc hiệu alen (Alelle Specific) ASA Khuếch đại allele đặc hiệu (allele specific amplification) DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylen diamin tetraacetic acid G6P Glucose – - phosphat G6PD Glucose - - phosphatase dehydrogenase GSH Glutathione dạng khử GSHPx Glutathion peroxidase GSSG Glutathione dạng oxi hóa HMR Phương pháp phân tích đường cong nóng chảy (High Melting Resolution) MPTP PCR using Mutliplex Tandem forward Primer NADP+ nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (dạng oxy hóa) NADPH nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (dạng khử) PASA Khuếch đại PCR alen đặc hiệu (PCR amplification of specification of specific alleles) PCR phản ứng khuếch đại gen (Polymerase chain reaction) WHO Tổ chức Y tế Thế giới DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ Glucose - - phosphatase dehydrogenase (G6PD) enzyme then chốt mở đầu cho chu trình pentose phosphate chuyển hóa glucose, oxi hóa Glucose-6phosphate thành 6-phosphogluconolactone, đồng thời chuyển NADP+ (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) thành NADPH Trong tế bào hồng cầu, NADPH tham gia vào phản ứng chuyển glutathione từ dạng oxi hóa (GSSG) thành dạng khử (GSH) - giúp bảo vệ nhóm sulphydryl hemoglobin màng tế bào hồng cầu khỏi tác nhân oxi hóa Hồng cầu người bị thiếu G6PD bị tán huyết nhanh chóng tác dụng tác nhân oxy-hoá Thiếu G6PD bệnh lý men thường gặp người, ảnh hưởng đến 400 triệu người giới Đa số trường hợp thiếu hụt G6PD khơng có biểu lâm sàng phơi nhiễm với yếu tố nguy dẫn đến biểu lâm sàng vàng da trẻ sơ sinh, thiếu máu huyết tán Enzyme G6PD sản phẩm mã hóa gen G6PD nằm nhánh dài nhiễm sắc thể giới tính X vị trí Xq28, gen có độ dài khoảng 18,5 kb, gồm 13 exon 12 intron Đột biến gen G6PD dẫn đến việc giảm ngừng trình tổng hợp enzyme, gây bệnh thiếu enzyme G6PD Đến nay, 180 đột biến xác định giới, hầu hết đột biến thay nucleotide, phân bố dọc 13 exon gen tập trung chủ yếu exon 6, 8, 10, 13 Đột biên với số lượng cao exon 10 [16] Tuy nhiên, theo nghiên cứu điều tra phân bố đột biến, dạng đột biến tìm thấy khác quốc gia, vùng lãnh thổ khác Điểm nóng đột biến (hot spot) nước châu Á cho exon 9,11,12 [15] Tại Việt Nam, thiếu enzyme G6PD bệnh phổ biến, chiếm tỷ lệ dao động khoảng 0,3-9% [15] Tỷ lệ bệnh có khác lớn tùy theo khu vực nhóm dân tộc Điều trị bệnh tạm thời dừng lại điều trị triệu chứng phát sớm nhằm tư vấn giúp nâng cao chất lượng sống cho người bệnh, phòng tránh biến chứng xảy thiếu enzyme G6PD việc làm quan trọng ý nghĩa Từ năm 1960 đến nay, có nhiều nghiên cứu G6PD điều tra tỷ lệ mắc bệnh, đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng đối tượng thiếu hụt enzyme G6PD Một số nghiên cứu gần tiến hành tập trung vào xác định dạng đột biến thường gặp nhiên nghiên cứu áp dụng kĩ thuật giải trình tự gen để xác định đột biến G6PD tiến hành đối tượng dân tộc Kinh thuộc khu vực miền Bắc chưa nhiều Nhằm góp phần vào sở liệu nghiên cứu bệnh thiếu enzyme G6PD đột biến vùng trọng điểm gen, tiến hành đề tài với mục tiêu: Xác định đột biến exon 9, 10, 11, 12 gen G6PD bệnh nhân thiếu hụt enzym G6PD kỹ thuật giải trình tự gen CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 Những hiểu biết G6PD I.1.1 Đặc điểm cấu trúc G6PD Men G6PD lần hai tác giả Otto Warburg Christan phát vào năm 1930 hồng cầu ngựa sau số hồng cầu động vật, vi sinh vật, men bia hồng cầu người [1] Năm 1966, Yoshida cộng tách chiết G6PD từ hồng cầu người Từ thông tin cấu trúc ban đầu, trọng lượng phân tử thông số động học G6PD dần làm sáng tỏ Hình 1.1 Cấu trúc G6PD G6PD enzyme có cấu trúc bậc phức tạp, cấu tạo nhiều monomer G6PD có hai đặc tính tính khơng đồng tính chuyển dạng phân tử G6PD tồn nhiều dạng monomer, dimer, trimer, tetramer hexamer Các cấu trúc chuyển dạng lẫn invitro, dạng monomer gần không xuất điều kiện sinh lý, hai dạng hoạt động dimer tetramer dạng dimer chiếm ưu hồng cầu người Cấu trúc enzyme định pH môi trường Enzyme tồn chủ yếu dạng tetramer mơi trường pH thấp Tại pH gần trung tính, enzyme tồn dạng dimer mơi trường trung tính dạng dimer tetramer có tỷ lệ [2] Sự trùng hợp monomer thành dimer dạng cao có hoạt tính xúc tác cần có mặt NADP+ NADP+ gắn với enzyme vừa phức hợp cấu trúc ổn định G6PD nhờ việc ngăn cản chuyển dạng enzyme từ dimer thành monomer không hoạt động, vừa chất phản ứng, chất cộng tác enzyme G6PD Monomer G6PD gồm 515 acid amin, khối lượng phân tử 59,256 dalton Trên dimer có hai vị trí gắn NADP+, vị trí gắn NADP chức năng, NADP gắn chặt chẽ cần thiết để trì cấu trúc oligo hoạt động enzyme Tính đồng trình tự acid amin thay đổi tùy theo vùng Vùng có tính đồng cao cho vùng có chức quan trọng, người, vùng thuộc acid amin 188-291 I.1.2 Vai trò G6PD chuyển hóa hồng cầu Hình 1.2 Vai trò G6PD hồng cầu G6PD enzyme oxy hóa khử, có chức xúc tác phản ứng đường pentose phosphate Về mặt lượng, Hexose monophosphate đường oxy hóa glucose xảy mô song song với đường đường phân song đường cung cấp lượng không đáng kể có khoảng 7-10% glucose thối hóa, đường mặt sinh lý lại nguồn gốc chủ yếu cung cấp NADPH cho hồng cầu NADPH coenzyme khử, cần cho phản ứng nhiều đường sinh tổng hợp khác liên quan mật thiết với chuỗi phản ứng để bảo vệ hồng cầu tái tạo glutathione dạng khử (GSH) từ glutathione dạng oxy hóa (GSSG), khử MetHb thành Hb có nhiệm vụ cung cấp ribose-5-phosphat sử dụng cho trình tổng hợp acid nucleic Đặc biệt trước tác nhân oxy hóa bất ngờ giáng hóa glucose theo đường lại tăng lên gấp hai mươi đến ba mươi lần chí cao Trong đường này, G6PD oxy hóa G-6-P thành 6-phosphogluconolacton, với coenzyme NADP+, chất nhận hydro trở thành NADPH [3] Hồng cầu với chức vận chuyển oxy, chứa nhiều oxy nên cấu trúc hồng cầu thường xuyên có nguy bị oxy hóa nhạy cảm với q trình oxy hóa, chúng dễ bị hủy hoại NADPH hoạt động thông qua phản ứng chuyển GSSG thành GSH với tham gia enzyme glutathione reductase GSH tạo thành ngăn cản trình peroxide cấu tử hồng cầu, trực tiếp bảo vệ hồng cầu khỏi tác nhân oxy hóa [4] Glutathion peroxidase (GSHPx) loại bỏ chất oxy hóa khỏi hồng cầu theo phản ứng: ROOH+GSH (dạng khử) > GS-SG (dạng oxy hóa)+ROH+H2O Ngồi ra, chế khác bảo vệ hồng cầu là: trình khử MetHb đồng thời diễn nhờ hệ thống enzyme methemoglobin reductase (MetHbR) mà cần coenzyme NADPH NADH Khi NADPH bị oxy hóa, GSSG bị khử thành GSH, NADPH chuyển thành NADP+ G6PD trở nên hoạt động, khử NADP+ thành NADPH Khi hồng cầu thiếu G6PD, đường hexose monophophat bị ngừng trệ NADPH không tạo thành, dẫn đến GSH không đủ Kết việc bảo vệ hồng cầu không hiệu Hồng cầu dễ bị cơng tác nhân oxy hóa, q trình oxy hóa diễn mạnh có nguy làm tăng q trình peroxide hóa cấu tử GSH khơng đủ cho nhu cầu q trình chuyển hóa, làm thay đổi chức màng hồng cầu hemoglobin bị biến tính Hemoglobin bị oxy hóa thành hợp chất khơng bền với HbH2O2 với hàm lượng cao độc cho hồng cầu, dẫn đến màng hồng cầu bị tổn thương bị vỡ [5] 10 I.2 Bệnh lý thiếu hụt enzyme G6PD I.2.1 Đặc điểm lâm sàng Những đối tượng thiếu men G6PD thường khơng có biểu triệu chứng lâm sàng có biểu nhẹ Tuy nhiên, tiếp xúc với tác nhân oxi hóa số loại thuốc, hóa chất thức ăn có tính oxi hóa cao dẫn đến hội chứng lâm sàng: 1) Tan máu sơ sinh Tình trạng thiếu máu tán huyết vàng da sơ sinh kéo dài hai vấn đề nghiêm trọng mà trẻ thiếu men G6PD gặp phải Vàng da trẻ sơ sinh tượng sinh lý bình thường vỡ hồng cầu ngày đầu sau sinh Các trường hợp vàng da kéo dài nhiều nguyên nhân khác nhau, thiếu G6PD xem yếu tố nguy dẫn tới vàng da bệnh lý Bilirubin gián tiếp tăng máu hồng cầu bị vỡ gây vàng da Mức độ vàng da phụ thuộc vào mức độ tan máu Nếu bilirubin tự ứ nhiều thấm vào não gây biến chứng thần kinh không hồi phục ảnh hưởng đến phát triển trí não trẻ sau Hậu nghiêm trọng bệnh lý vàng da nhân [6] Biểu tăng trương lực cơ, xoắn vặn, phản xạ sơ sinh, ngừng thở tím tái dẫn tới tử vong Nếu qua khỏi, để lại bất thường giác quan hay di chứng ảnh hưởng tới khả phát triển tinh thần vận động trẻ 2) Tan máu khởi động thuốc Tình trạng tan máu xảy bệnh nhân sốt rét điều trị primaqine Ernest Beutler ghi nhận vào năm 50 kỉ trước [7] Năm 1980, Phạm Đình Vy báo cáo trường hợp điều trị đái huyết sắc tố tan máu cấp bệnh nhân thiếu hoàn toàn men G6PD bị ngộ độc thuốc sốt rét dẫn đến suy thận cấp vô niệu, tiến hành thay máu toàn Thuốc primaquine thuốc làm giảm tuổi thọ hồng cầu người thiếu men G6PD, có nghiên cứu sau cho bệnh nhân uống primaquine vài ngày cho thấy hàm lượng hemoglobine giảm xuống rõ rệt, nước tiểu sậm màu, bệnh nhân có sốt cao, 22 đơn gel điện di tạo vạch sáng phim X quang Giải trình tự Sanger thực với đoạn DNA khoảng 400 – 900 cặp base Hình 1.6 Giải trình tự gen phương pháp Sanger (Nguồn: http://www.onlinebiologynotes.com) Năm 1986 thiết bị giải trình tự tự động dựa phương pháp Sanger phát minh Lloyd M.Smith sản xuất công ty Applied Biosystems Hệ thống điện di thường điện di mao quản, máy gồm nhiều mao quản chứa gel polyacrylamide cho phép phân tích nhiều mẫu lần điện di Các ddNTP đánh dấu huỳnh quang với màu khác nhau, nhờ phản ứng giải trình tự thực ống nghiệm cần điện di hàng Hệ thống detector gồm camera có chùm tia sáng laser di qua để ghi nhận tín hiệu huỳnh quang cách xác Nguyên tắc hoạt động máy suốt trình điện di, có vạch điện di qua chùm tia laser phân từ ddNTP cuối đầu 3’ đoạn DNA phát màu huỳnh quang tương ứng camera ghi nhận lại thành cường độ đỉnh sáng biểu đồ Dựa vào biểu đồ này, máy 23 phân tích đỉnh cường độ sáng, so sánh với màu, nhận diện loại nucleotid cho trình tự DNA đích Hình 1.7 Giải trình tự gen máy giải trình tự gen tự động (Nguồn: http://en.wikimedia.org/wiki/sanger_sequencing) Nghiên cứu thực máy giải trình tự gen tự động, đem lại kết nhanh chóng xác gen cần nghiên cứu, giúp phát xác đột biến xảy gen Đồng thời tăng khả phát đột biến chưa phát 24 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn Đối tượng nghiên cứu gồm 30 bệnh nhân thuộc dân tộc Kinh chẩn đoán thiếu men G6PD Bệnh viện Nhi Trung Ương phương pháp định lượng G6PD máy hóa sinh tự động Tiêu chuẩn đánh giá Bình thường: >200 U/1012HC Thiếu G6PD nhẹ: 120-200 U/1012HC Thiếu G6PD vừa: 20 – 120 U/1012HC Thiếu G6PD nặng: 2.6.3 Kỹ thuật PCR Bảng 2.1.Trình tự mồi khuếch đại exon 9,10,11,12 gen G6PD Tên mồi Trình tự mồi (5'->3') Tm (ºC) Kích thước(bp) 28 F6.2F GACTCGAGATGGACCAGGGTG 61.90 F6.2R CTCGAAGGCATCACCTACCATCC 62.67 F8F GGCCGTGTACACCAAGATGAT 60.41 F8R AGAGTGACGGGTGGAGGAGAG 62.68 F9F TATGGCAGGTGAGGAAAGGGT 60.84 F9R AATGTGCAGCTGAGGTCAATG 59.18 Promoter region E1 395 566 297 + ATG E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 E13 5’ UTR 3’ UTR F6.2 F8 F9 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế cặp mồi cho exon 9,10,11,12 gen G6PD Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Go taq Hot Start Master Mix (2X) Nước cất Mồi xuôi 10 Pm Mồi ngược 10 pM DNA Tổng thể tích Thể tích (µl) 0.5 0.5 10 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR thiết kế tối ưu cho mồi khác Sản phẩm PCR bảo quản ºC Kiểm tra sản phẩm PCR Sản phẩm PCR kiểm tra phương pháp điện di Nguyên lý: 29 Khi phân tử tích điện đăt điện trường, chúng dịch chuyển theo nguyên tắc phân tử tích điện âm di chuyển phía cực dương phân tử tích điện dương di chuyển phía cực âm điện trường Acid nucleic phân tử mang điện tích âm, tiến hành điện di sản phẩm PCR, đoạn DNA khuếch đại dịch chuyển cực dương điện trường Các đoạn DNA kích thước khác chạy với tốc độ khác gel: đoạn ngắn chạy xa, đoạn dài chạy chậm Sử dụng gel agarose để điện di, sau điện di nhuộm gel với ethidium bromide, phân tử Ethidium bromide chèn vào base nitơ acid nucleic, chụp ánh sáng tử ngpaji cho hình ảnh thu với marker độ dài gen đích biết sản phẩm PCR có đạt u cầu hay khơng Tiến hành: - Chuẩn bị khay đổ gel lược: Tùy thuộc vào số lượng mẫu DNA cần kiểm tra mà chọn loại khay rang lược thích hợp, có hai loại khay để đổ gel: o Khay lớn: cân 0,375 g bột agarose hòa tan 25ml dung dịch TBE 1X o Khay nhỏ: cân 0,225g bột agarose hòa tan 15ml dung dịch TBE 1X - Đun hỗn hợp lò vi song khoảng 1-1,5 phút đến dung dịch sơi hồn tồn bột agarose tan hết thành dung dịch đồng - Đổ gel vào khay điện di có sẵn lược để tạo giếng - Để khoảng 45 phút để gel đơng đặc hồn tồn Bước 2: Tra mẫu điện di - Đặt gel vào bể điện di cho gel ngập hoàn toàn dung dịch đệm TBE 1X - Tra µl Marker vào giếng - Tra 2-3 µl sản phẩm PCR vào giếng lại gel Bước 3: Chạy điện di Chạy điện di mẫu 30 phút hiệu điện 100V Bước : Nhuộm gel 30 Ngâm gel vào dung dịch nhuộm Ethidium bromide 3-5 phút Sau lấy gel rửa nước để loại bỏ phẩm nhuộm dư thừa Bước 5: Chụp gel Quan sát vạch sáng xuất gel Chụp hình lưu trữ kết Vạch điện di rõ nét, khơng có vạch phụ, kích thước so thang chuẩn tương ứng với kích thước đoạn gen cần khuếch đại 2.6.4 Giải trình tự gen trực tiếp Bước Tiến hành phản ứng PCR giải trình tự - Chuẩn bị master mix cho phản ứng: Bảng 2.3 Thành phần phản ứng giải trình tự gen STT - Thành phần Buffer Big dye 5X Big dye Terminator v3.1 Mồi xuôi mồi ngược pM Nước cất DNA cần giải trình tự (sản phẩm PCR) Tổng thể tích Thể tích (µl) 0.5 6.0 0.5 10 Chu trình nhiệt: 96ºC 96ºC Tgm 50ºC 60ºC Phút 10 giây giây phút Bảo quản 15ºC 25 chu kỳ Bước 2: Tinh sản phẩm PCR giải trình tự - Thêm 60 µl Ethanol 100% µl EDTA vào mẫu cần tinh - Lắc mạnh, để bóng tối 15 phút, nhiệt độ phòng - Lấy ly tâm 15000 vòng/phút 20 phút - Loại bỏ dịch - Thêm 200 µl Ethanol 70%, ly tâm 15000 vòng/phút 10 phút - Loại bỏ dịch nổi, để khô 31 - Thêm 20 µl Hi – di formamide, ủ 95 ºC vòng phút - Cho vào tủ lạnh khoảng phút - Cho vào máy giải trình tự Bước 3: Giải trình tự gen máy tự động Kết so sánh với trình tự NG_009015 ngân hàng Gen Bank 2.7 Xử lý số liệu - Số liệu thống kê xử lý phần mềm SPSS16.0 2.8 Vấn đề đạo đức nghiên cứu - Các xét nghiệm phân tích gen thực có đồng ý bệnh nhân - Bệnh nhân thông báo kết xác định đột biến gen thông qua bác sĩ điều trị - Các thơng tin bệnh nhân, kết chẩn đốn hồn tồn giữ bí mật - Nghiên cứu tiến hành hồn tồn mục đích khoa học, khơng mục đích khác - Đề cương thông qua hội đồng y đức, trường Đại học Y Hà Nội 32 CHƯƠNG DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu Bảng 3.1 Đặc điểm giới đối tượng nghiên cứu Giới Nam Nữ Tổng số Số lượng Tỉ lệ (%) Bảng 3.2 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo địa dư Tỉnh n Tỉ lệ % Tổng 3.2 Đặc điểm cận lâm sàng trẻ thiếu G6PD Bảng 3.3 Giá trị trung bình G6PD nhóm nghiên cứu G6PD ( IU/1012HC) Giới p X ±SD Nam Nữ Tổng Bảng 3.4 Phân loại mức độ thiếu hụt G6PD theo giới Mức độ thiếu hụt G6PD Giới Nam Nữ Tổng Nặng ( G; 58 Asp > Gly): Frequency Distributions of Variants Compared with Those in Other Southeast Asian Countries Acta Med Okayama, 71(4), 15 Iwai K., Hirono A., Matsuoka H (2001) Distribution of glucose-6-phosphate dehydrogenase mutations in Southeast Asia Hum Genet, 108(6), 445–449 16 Minucci A., Moradkhani K., Hwang M.J (2012) Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) mutations database: review of the “old” and update of the new mutations Blood Cells Mol Dis, 48(3), 154–165 17 Matsuoka H., Wang J., Hirai M (2004) Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) mutations in Myanmar: G6PD Mahidol (487G>A) is the most common variant in the Myanmar population J Hum Genet, 49(10), 544–547 18 Louicharoen C Nuchprayoon I (2005) G6PD Viangchan (871G>A) is the most common G6PD-deficient variant in the Cambodian population J Hum Genet, 50(9), 448–452 19 Matsuoka H., Thi Vinh Thuan D., van Thien H (2007) Seven different glucose-6-phosphate dehydrogenase variants including a new variant distributed in Lam Dong Province in southern Vietnam Acta Med Okayama, 61, 213–9 20 Trần Thị Chính, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Kaoru Nishiyama (2003) Phát thiếu hụt G6PD phân tích dạng đột biến gen số trường hợp thuộc dân tộc Kinh, Mường, Racley Tày Hà Nội, Hồ Bình, Khánh Hồ, Tạp chí nghiên cứu y học, 3, 98-104 ... thiếu enzyme G6PD đột biến vùng trọng điểm gen, tiến hành đề tài với mục tiêu: Xác định đột biến exon 9, 10, 11, 12 gen G6PD bệnh nhân thiếu hụt enzym G6PD kỹ thuật giải trình tự gen 7 CHƯƠNG... tử, sở gen học, dạng đột biến bệnh thiếu G6PD ngày làm rõ Bệnh gặp tất dân tộc, với khoảng 400 triệu người giới thiếu men G6PD [13] [14] Các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ thiếu G6PD dạng đột biến bệnh. .. protein Khi gen cấu trúc bị đột biến gây nên thiếu men G6PD mặt chất lượng Nếu đột biến xảy gen điều hòa gen khởi động làm giảm số lượng enzyme G6PD Sự biến đổi mặt số lượng chất lượng phân tử enzyme