NGHIÊN cứu đột BIẾN GEN PIK3CA LIÊN QUAN đến NGUY cơ UNG THƯ dạ dày TRÊN NGƯỜI VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI DƯƠNG THỊ MINH THOA NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN PIK3CA LIÊN QUAN ĐẾN NGUY CƠ UNG THƯ DẠ DÀY TRÊN NGƯỜI VIỆT NAM ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC HÀ NỘI – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI DƯƠNG THỊ MINH THOA NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN PIK3CA LIÊN QUAN ĐẾN NGUY CƠ UNG THƯ DẠ DÀY TRÊN NGƯỜI VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số: 60720106 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Tạ Thành Văn HÀ NỘI – 2017 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AJCC CEA: CT EGFR GWAS H pylori HE HER HER2 HMMD OR PET_ CT Rpm SNP: TCYTTG TNM UICC UTBM UTBMDD UTBMT UTDD WHO : American Joint Committee on Cancer (Ủy ban Hợp Hoa Kỳ Ung thư) : Carcino- Embryonic- Antigen (Kháng nguyên bào thai) : Computerized Tomography (Chụp cắt lớp vi tính) : Epidermal Growth Factor Receptor (Thụ thể yếu tố tăng trưởng thượng bì) : Genome-Wide Association Studies (nghiên cứu tương quan toàn nhiễm sắc thể) : Helicobacter pylori : Hematoxylin - Eosin : Human Epidermal Growth Factor Receptor (Thụ thể yếu tố tăng trưởng thượng bì người) : Human Epidermal Growth Factor Receptor (Thụ thể yếu tố tăng trưởng thượng bì người loại 2) : Hóa mơ miễn dịch : Odds Ratio (tỷ số chênh) : Positron emission tomography–computed tomography (chụp cắt lớp vi tính phát xạ) : Revolutions Per Minute ( số vòng phút) : Single nucleotide polymorphism (các dạng đa hình nucleotide đơn) : Tổ chức Y tế Thế giới : Tumor–Node–Metastasis (Khối u – Hạch – Di căn) : Union for International Cancer Control (Liênminh Kiểm soát Ung thư Quốc tế) : Ung thư biểu mô : Ung thư biểu mô dày : Ung thư biểu mô tuyến : Ung thư dày : World Health Organization ( tổ chức y tế giới) MỤC LỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư dày (UTDD) bệnh lý ác tính, đứng thứ tư ung thư thường gặp đứng thứ hai nguyên nhân gây tử vong ung thư [1] Theo số liệu GLOBOCAN 2012, có 952.000 trường hợp mắc bệnh 723.000 trường hợp tử vong, 70% trường hợp ung thư dày xảy nước phát triển, 50% gặp nước Đơng Á, phần lớn gặp nước Trung Quốc, Nhật Bản Hàn Quốc UTDD hậu tương tác phức tạp yếu tố vật chủ với môi trường Nhiều yếu tố nguy ung thư dày xác định như: nhiễm Helicobacter pylori (H.pylori), hút thuốc lá, uống rượu, chế độ ăn nhiều nitrit, yếu tố di truyền, polip dày… Ở Việt Nam nhiều nghiên cứu yếu tố nguy thường gặp như: tỷ lệ nhiễm khuẩn H.pylori cao, thói quen sử dụng rượu, thuốc lá, chế độ ăn rau, nhiều muối… Việc làm sáng tỏ đường sinh học dẫn tới phát triển ung thư dày quan trọng tích tụ biến đổi di truyền liên quan tới phát triển khối u [2] Sự thay đổi di truyền liên quan đến protein dọc theo số đường tín hiệu, chẳng hạn kích hoạt cấu tạo receptor kinase tyrosine receptor G-protein, protein liên kết GTP với protein adaptor, dẫn đến kích hoạt phosphoinositide 3-kinase (PI3K) -con đường AKT [3-6] Vì tín hiệu PI3K đóng vai trò quan trọng phát triển tế bào, chuyển hóa, sống còn, di căn, đề kháng với hóa trị, đường PI3K-AKT coi quan trọng q trình gây ung thư [7-10] Chẩn đốn sớm UTDD nhiều khó khăn UTDD giai đoạn sớm thường gặp biểu không đặc trưng nôn, buồn nơn, đầy bụng, chán ăn… Giai đoạn muộn gặp triệu chứng xuất huyết tiêu hóa, hội chứng cận u, thiếu máu, gầy sút, mệt mỏi… Để chẩn đoán UTDD cần dựa vào triệu chứng lâm sàng cận lâm sàng nội soi, giải phẫu bệnh, CT… Tuy nhiên, tất phương pháp để chẩn đoán ung thư dày chẩn đốn khối u hình thành, thường giai đoạn muộn bệnh dẫn đến tỷ lệ tử vong cao [4], [5] Do cần tìm thay đổi đặc hiệu mức độ phân tử hay dấu ấn để chẩn đoán sớm ung thư thay đổi thay đổi sớm trước xuất hình thái thay đổi tế bào Tầm quan trọng đột biến PIK3CA ung thư dày chưa rõ ràng Mặc dù số báo cáo mối quan hệ đột biến tiên lượng PIK3CA, có bệnh nhân phân tích phát khác nghiên cứu Với phát triển khoa học kĩ thuật, nhà khoa học phân tích DNA người để xác định xác tổn thương gen gây bệnh UTDD kiểm soát tốt nhờ xác định người mang gen, phát dấu ấn giúp chẩn đoán sớm theo dõi điều trị tiên lượng UTDD, nhằm góp phần giảm tỷ lệ mắc bệnh tử vong Do tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đột biến gen PIK3CA liên quan đến nguy ung thư dày người Việt Nam” với mục tiêu sau: Đánh giá đột biến PIK3CA bệnh nhân ung thư dày bệnh viện Hữu Nghị Việt Tiệp CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm chung 1.1.1 Dịch tễ học Trong lịch sử, ung thư dày bệnh lý ác tính gây tử vong đứng thứ hai sau ung thư phổi Năm 1990, UTDD xếp bốn loại ung thư thường gặp nhất, chiếm 9,9% trường hợp ung thư [7], [8] Năm 2002 UTDD loại ung thư phổ biến thứ tư giới với 900.000 ca bệnh [9] 2/3 trường hợp xảy nước phát triển [10] Năm 2011, ước tính giới có 989.600 trường hợp UTDD mắc mới, 738.000 trường hợp tử vong [11] Nhìn chung, bệnh lý UTDD khơng có phân bố theo địa lý rõ rệt Theo số liệu GLOBOCAN 2012, 70% trường hợp ung thư dày xảy nước phát triển, 50% gặp nước Đơng Á, phần lớn gặp nước Trung Quốc, Nhật Bản Hàn Quốc Ung thư dày nguyên nhân thứ ba gây tử vong hai giới toàn giới (723.000 người chết, 8.8% tổng số) Tỷ lệ tử vong ước tính cao Đơng Á (24 100.000 nam giới, 9.8 100.000 phụ nữ), thấp Bắc Mỹ (2.8 1.5) Tỷ lệ tử vong cao xuất hai giới Trung Đông Âu, Trung Nam Mỹ [2] Tỷ lệ tử vong UTDD nước phát triển giảm đáng kể Điều giải thích chế độ ăn uống, việc bảo quản thực phẩm, kiểm soát tốt H pylori [11], [12], [13], [14], [15] UTDD bệnh lý có độ tuổi mắc bệnh chiếm tỷ lệ cao từ 60- 80 tuổi, người 30 tuổi bị bệnh Tại miền Nam Ấn Độ, độ tuổi mắc bệnh chủ yếu từ 35- 55 tuổi, miền Bắc số bệnh nhân mắc bệnh thường độ tuổi 45 - 55 Hầu hết quốc gia giới, tỷ lệ mắc bệnh UTDD thường cao nam giới, gấp - lần so với nữ giới [11], [16] Phần lớn bệnh nhân UTDD Mỹ độ tuổi 65 - 74 Tuổi trung bình lúc chẩn đốn 70 nam giới nữ giới 74 tuổi Các nước có tỷ lệ mắc UTDD cao, tuổi lúc chẩn đốn có xu hướng thấp Điều giải thích có chương trình khám sàng lọc tốt hơn, nhờ tỷ lệ phát UTDD sớm tăng lên rõ rệt [15], [17] Khi UTDD có xu hướng lệch phía trẻ tuổi tỷ lệ nam nữ tương đương [11] Ở Mỹ, năm 2013, tỷ lệ mắc UTDD nam 13,2/100.000 dân, nữ 8,3/100.000 dân Trong đó, số bệnh nhân tử vong UTDD năm 2013 nam 6740, nữ 4250 [18] Theo thống kê vào năm 2010, tỷ lệ mắc loại ung thư nam giới Việt Nam 181,3/100.000 dân, nữ giới là134,9/100.000 dân Trong số 71.940 trường hợp ung thư nam, có 10.384 trường hợp UTDD, chiếm tỉ lệ 14,43 %, số 54.367 trường hợp ung thư nữ, có 4.728 trường hợp UTDD, chiếm tỷ lệ 8,06% Tại Việt Nam theo số liệu bệnh viện K Hà Nội, UTDD chiếm tỉ lệ cao ung thư hệ tiêu hóa xếp thứ tư loại ung thư Mỗi năm có 15.000 trường hợp mắc mới, 11.000 trường hợp tử vong Bệnh gặp nhiều lứa tuổi gặp người 40 tuổi [9] Theo nghiên cứu Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh Thừa Thiên Huế cho thấy, UTDD đứng hàng thứ bệnh ung thư Vị trí hay gặp ung thư dày phần dưới, chiếm tỉ lệ 80-90% Tính đến năm 2000, nghiên cứu UTDD Việt Nam thấy 90% UTDD mổ có di hạch, điều đồng nghĩa với ung thư giai đoạn muộn [1], [10], [14] 1.1.2 Nguyên nhân yếu tố nguy cuả ung thư dày UTDD hậu tương tác phức tạp yếu tố vật chủ với môi trường, đáng lưu ý nhiễm H pylori 1.1.2.1 Yếu tố mơi trường Nhiều nghiên cứu cho thấy nhóm nguy môi trường quan trọng chế độ ăn uống, hút thuốc nhiễm H pylori - Chế độ ăn uống có nhiều nitrate loại cá, thịt chế biến sẵn, loại thức ăn xông khói, ướp muối, làm tăng nguy UTDD Nitrosamin có thức ăn số loại thức ăn chứa nitrate tạo chất gây UTDD [19], [20] Ăn 10 rau trái làm tăng nguy UTDD [19] - Hút thuốc làm tăng nguy UTDD lên 1,56 lần [21] Theo Gonzalez, xấp xỉ 18% trường hợp UTDD quy cho hút thuốc Nguy UTDD tăng theo thời gian hút thuốc giảm sau 10 năm cai thuốc [22] - H pylori Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) xếp vào tác nhân gây ung thư nhóm I [20] Có nhiều chứng dịch tễ mối liên quan nhiễm H pylori với UTDD, đặc biệt UTDD không thuộc tâm vị Nhiễm H pylori làm tăng nguy UTDD không thuộc tâm vị xấp xỉ lần Người ta ước tính H pylori nguyên nhân khoảng 63% trường hợp UTDD không thuộc tâm vị toàn giới [10] Người ta cho nhiễm H pylori khởi phát trình viêm niêm mạc thân vị, sau dẫn đến teo niêm mạc dày dị sản ruột Theo dõi 4655 người khơng có triệu chứng thời gian trung bình 7,7 năm, Ohata phát 45 trường hợp UTDD (tỷ suất 126/100.000 người/năm) Phân tích đơn biến sau điều chỉnh tuổi cho thấy H pylori viêm dày teo mạn tính có liên quan rõ rệt với UTDD [23] Tại Việt Nam, Phạm Quang Cử nhận thấy có mối liên quan nhiễm H pylori với viêm dày teo, dị sản ruột, loạn sản niêm mạc dày [5] Tỷ lệ UTDD người nhiễm H pylori cao người không nhiễm H pylori với tỷ số chênh (Odds Ratio: OR) = 3,3-3,6 [5], [14] Do vậy, người ta cho viêm dày teo mạn tính, dị sản ruột tổn thương tiền ác tính UTDD [20] 1.1.2.2 Yếu tố nguy liên quan với vật chủ - Yếu tố di truyền: UTDD thường xảy người có nhóm máu A thường gặp gia đình anh em sinh đôi [19] Yatsuya ghi nhận tiền sử UTDD nhiều người thân hệ có liên quan với tăng nguy UTDD phụ nữ (OR: 5,1) sau kiểm soát biến số nhiễm H pylori biến số gây nhiễu khác [27] UTDD thể lan tỏa di truyền loại UTDD di truyền xác định rõ đột biến dòng phơi gen E-cadherin (CDH1) [28] Các nghiên cứu mối liên quan gen bệnh tật (GWAS) áp dụng nhiều loại hình bệnh tật, có ung thư Nghiên cứu GWAS KDD báo cáo vào năm 2008 phát mối liên quan SNP thuộc gen 33 có tín hiệu phát quang (Roche) hay huỳnh quang (Illumina) ghi nhận, kéo dài đầu 3’ mạch bổ sung lần base nhờ kéo dài nối probe dựa sợi khuôn tổng hợp base có tín hiệu huỳnh quang ghi nhận (Solid ABI) Thứ tự lần thổi thuốc thử giải trình tự vào chip nano-well hay vào vi máy tính ghi lại đồng thời với thứ tự cường độ tín hiệu tổng hợp sợi bổ sung clone DNA bám lên vi hay vi hạt, nhờ mà giải trình tự mảnh DNA clone bám vi hay vi hạt Vì có đến hàng chục ngàn đến hàng trăm ngàn clone nên có hàng chục ngàn đến hàng trăm ngàn trình tự giải tương ứng với hàng chục ngàn đến hàng trăm ngàn mảnh DNA từ gene giải Các trình tự mảnh DNA giải đượcsẽ phần mềm thiết bị nối lại với cách so chuỗi tìm trình tự trùng lặp hai đầu có kết trình tự nguyên gene Hình 1.8 Các giai đoạn giải trình tự gen hệ 34 35 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu * Mẫu nghiên cứu: Là bệnh nhân chẩn đoán mắc ung thư dày không kèm ung thư khác bệnh viện * Tiêu chuẩn chẩn đoán Bệnh nhân chẩn đoán xác định UTDD dựa triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng chuẩn đoán xác định kết giải phẫu bệnh ung thư biểu mô dày * Tiêu chuẩn loại trừ Ung thư dày có kết hợp với bệnh ung thư khác * Các biến nghiên cứu: Tất đối tượng nội soi, xác định tính chất mơ bệnh học khối u, vấn khai thác thông tin cá nhân 2.1.2 Thiết kế nghiên cứu: Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang 2.1.3 Phương pháp chọn mẫu: chọn mẫu tùy tiện 2.1.4 Cỡ mẫu nghiên cứu: 100 mẫu 2.2 Thời gian nghiên cứu Nghiên cứu thực từ tháng năm 2017 đến tháng năm 2018 36 2.3 Chỉ tiêu nghiên cứu 2.3.1 Thông tin chung đối tượng nghiên cứu : Tuổi, giới, thời gian phát bệnh 2.3.2 Đặc điểm lâm sàng : Đau bụng, nơn, đầy hơi, xuất huyết tiêu hóa, hội chứng cận u… 2.3.3 Xét nghiệm cận lâm sàng - Nội soi - Giải phẫu bệnh 2.3.4 Kết phân tích gen: Kết phân tích gen bệnh nhân UTDD 2.3 Dụng cụ, trang thiết bị, hóa chất nghiên cứu 2.3.1 Dụng cụ: Phải vô trùng tuyệt đối (hấp ướt 120°C 20 phút) - Máy Gene Amp PCR System 9700 (USA) - Tủ lạnh sâu: -30°C; -80°C (SANYO) - Máy điện di: Mupid (Nhật Bản) - Máy soi gel chụp ảnh tự động: Chemidoc EQ-Bio-Rad (USA) - Máy ly tâm lạnh Beckman (USA) ly tâm để bàn Eppendorf (Đức) - Lò vi sóng (Samsung), tủ ấm, pipet, đầu loại - Máy đọc trình tự gen 3100-Avant Genetic Analyzer hãng ABI-PRISM - Máy quang phổ kế Thermo Electron Corporation hãng Biomate 2.3.2 Hóa chất - Hóa chất dùng để tách chiết DNA • • • Buffer DP Buffer FPL Proteinase K (20mg/ml) 37 • • • • • Buffer FPB Ethanol tuyệt đối Buffer BW Buffer TW Buffer AE nước cất khơng DNA - Hóa chất dùng cho PCR (Invitrogen) • 10X buffer, dNTP mix,Taq polymerase (hãng Takara-Nhật Bản) • Các cặp mồi (xi ngược) - Hóa chất để đọc trình tự: BigDye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) gồm BigDye Terminator v3.0 (dATP, dCTP, dGTP dUTP), BigDye buffer, cặp mồi đặc hiệu, dung dịch formamide 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Mơ hình nghiên cứu Bệnh nhân UTDD Lấy mô ung thư dày Tách DNA PCR Giải trình tự Xác định đột biến gen 38 2.4.2 Nội dung nghiên cứu - Lựa chọn bệnh nhân - Lấy mẫu mô ung thư dà bệnh nhân - Tách chiết DNA từ mẫu mô bệnh nhân UTDD tiến hành giải trình tự để phát đột biến - Tính tốn tỷ lệ bệnh nhân đột biến gen 2.4.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu - Địa điểm nghiên cứu + Bệnh viện Hữu Nghị Việt Tiệp + Trung tâm Kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học + Bộ môn Bệnh học phân tử Bộ mơn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội - Thời gian nghiên cứu: Từ tháng năm 2017 đến tháng năm 2018 2.4.4 Quy trình kỹ thuật nghiên cứu 2.4.4.1 Quy trình lấy mẫu Bệnh nhân lấy mẫu mô ung thư dày sau phẫu thuật, đúc parafin 2.4.4.2 Kỹ thuật tách chiết DNA DNA tách chiết từ mẫu mô ung thư dày đúc parafin bệnh nhân, sử dụng GeneAll Kit: Chuẩn bị thí nghiệm: • • • • Chuẩn bị water bath máy ủ : 56oC 90oC Chuẩn bị ethanol tuyệt đối Chuẩn bị ống microcentrifuge 1,5và 2ml Ly tâm xảy nhiệt độ thường 39 • Buffer FPL FPB kết tủa nhiệt độ xung quanh lạnh, cần rã đơng water bath 56oC Tiến hành tách DNA • Cắt 8-10 mảnh mẫu dày từ – 10um từ khối mô FFPE Khối lượng mẫu lúc đầu không nên mảnh dày 10 um Khuyến cáo nên sử dụng từ 1-3 mảnh từ 5-10 um • • • Chuyển mẫu vào ống microcentrifuge 2.0 ml Thêm 1000ul buffer DP vortex, mix Ủ 56oC phút spin down cho khơng có giọt dính nắp ống • Loại bỏ cẩn thận buffer DP tốt pipet, tránh làm mảnh mơ • Thêm 180ul buffer FPL mix hồn tồn vortex mạnh • Thêm 20 ul dung dịch Proteinase K (20mg/ml) mix hoàn toàn vortex pipet Ủ 56oC • Ủ 90oC spin down cho khơng có giọt dính nắp ống • Thêm 200 ul buffer FPB vào tube mix hoàn toàn vortex Spin down cho khơng có giọt dính nắp ống • Thêm 200 ul ethanol tuyệt đối vào mẫu, vortex đập ( pulse – vortex) để mix mẫu hoàn toàn Spin down cho khơng có giọt dính nắp ống • Chuyển tất dung dịch mix vào cột SV cẩn thận, ly tâm phút từ 6000xg (>8000 vòng/phút) thay vào ống • Thêm 600 ul buffer BW, ly tâm phút với tốc độ> 6000 xg (8000 vòng/phút) thay vào ống • Thêm 700 ul buffer TW Ly tâm phút 6000 x g ( > 8000 vòng/phút) Lấy phần qua cột SV cho vào ống collection • Ly tâm tốc độ tối đa (> 13000 x g) phút để loại bỏ buffer thừa Đặt cột SV vào ống microcentrifuge (khơng cung cấp) • Thêm 50 ul buffer AE nước cất khử ion Ủ phút nhiệt độ thường Ly tâm tốc độ tối đa (13000 xg) phút • Ly tâm 13000 rpm 90 giây, thu dịch phía dịch DNA • Phân tử DNA thu kiểm tra độ tinh phương pháp đo 40 mật độ quang bước sóng 260/280 nm 2.4.4.3 Phương pháp đo quang phổ * Nguyên lý đo mật độ quang: - Acid nucleic có phổ hấp thụ cực đại ánh sáng tử ngoại 260 nm có mặt base purin pyrimidin Giá trị mật độ quang bước sóng 260 nm (A 260nm) mẫu cho phép xác định nồng độ acid nucleic mẫu - Protein hấp thụ ánh sáng tử ngoại bước sóng 280 nm hấp thụ acid amin thơm dị vòng: tyrosin, tryptophan, phần nhờ phenylalanine - Dựa vào tỷ lệ A260 nm/A280 nm để kiểm tra độ tinh khiết DNA Nếu A 260 nm /A280 nm = 1,8 – 2,0 DNA coi tinh * Tiến hành đo mật độ quang DNA: máy quang phổ kế Nanodrop - Nhỏ 1µl nước cất lên kính đọc làm trắng, sau nhỏ 1µl dung dịch DNA lên kính đọc, so sánh với trắng Đọc kết nồng độ DNA độ tinh DNA thu 2.4.4.4 Quy trình phản ứng PCR * Thành phần phản ứng: - 10 x buffer: 2μl - dNTP: 2μl - Taq polymerase: 0,2μl - Mồi xuôi: 1μl - Mồi ngược: μl - DNA: ng - Nước cất: 12.8 μl * Tổng thể tích phản ứng: 20μl * Chu trình phản ứng PCR sau: 95°C phút 95°C 30 giây 56°C 30 giây 72°C 30 giây 35 chu kỳ 41 72°C phút Sản phẩm PCR cắt enzym giới hạn điện di sản phẩm cắt gel agarose 3% So sánh kết thành viên bệnh nhân Sản phẩm PCR sau điện di giải trình tự trực tiếp sau tinh từ gel agarose 2.4.4.5 Kỹ thuật điện di gel agarose * Cách làm gel agarose 1,5% (3%) - Cân 1,5g (3g) agarose hòa tan 10ml EDTA Tris-acetate (TAE) (sử dụng lò vi sóng) Sau agarose tan hết, để nguội 55- 60°C, đổ vào khuôn gel, tùy thuộc vào số lượng giếng cần cho điện di mà cài lược làm giếng từ 4- 6- 8- 12 * Cách pha dung dịch TAE 10X (EDTA Tris-acetate): Tris-acetate M, EDTA (pH 8.0) 50mM Pha dung dịch TAE 10X thành dung dịch TAE 1X: 10ml TAE 10X 90 ml nước cất * Tiến hành kỹ thuật điện di Thành phần Ống chuẩn Ống bệnh nhân Dung dịch TLPT chuẩn (Hae III) 10μl Cdna 9μl Loading buffer 10X 1μl Tổng số 10μl 10μl - Đưa gel agarose vào máy điện di, cho TAE đến ngập gel - Dùng pipet đầu côn nhỏ hút dung dịch ống đưa vào giếng (10μl/giếng) - Máy điện di 80- 100v (Mupid- Nhật Bản), điện di khoảng 30 phút - Sau điện di, gel vào soi đèn UV, chụp ảnh 2.4.4.6 Giải trình tự gen * Tinh DNA (sử dụng Kit QIAGEN) - Cho 500 µl dung dịch PB vào ống chứa 100 µl plasmid, lắc đều, để nhiệt độ phòng 30 phút - Hút hết dịch cho qua cột tinh (do hãng Qiagen cung cấp) - Quay ly tâm 10000 v/p 30 giây, đổ bỏ dịch đáy ống - Cho tiếp 750 µl PE vào cột 42 - Ly tâm 10000 v/p 30 giây, đổ bỏ dịch phía đáy ống - Ly tâm tiếp thêm 60 giây để loại bỏ hết dịch cột - Lấy cột ra, cho vào ống eppendorf 1,5 ml - Cho 50 µl dung dịch EB (gồm 10 mM Tris-Cl, pH 8,5) - Để nhiệt độ phòng phút Ly tâm 10000 v/p 60 giây - Dịch thu đáy ống dịch chứa DNA tinh *Giải trình tự gen: theo qui trình sử dụng phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA) Quy trình thực hiện: Tinh sản phẩm PCR Phân tích 0,1 thể tích DNA gel agarose Pha trộn hỗn hợp ống Eppendof gồm: hỗn hợp mastemix, Terminator ready Reaction Mix, primer sản phẩm PCR Mỗi phản ứng PCR sequencing sử dụng mồi Chạy mẫu với chu trình nhiệt tối ưu Tinh chế sản phẩm ABI phenol/ chloroform Thu tủa DNA ly tâm Loại bỏ Ethanol Để khơ qua đêm Phương pháp phân tích kết quả: - Các nucleotid gen biểu đỉnh (peak) với mầu tương đương với loại nucleotid A,T,G,C So sánh trình tự gen bệnh nhân với trình tự gen chuẩn Gen Bank (National center for biotechnology information, NCBI) phân tích theo phương pháp ABI Prism 310 genetic analyzer (Applied Biosystems) 2.5 Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ đạo đức nghiên cứu Y học Đối tượng nghiên cứu đối tượng hồn tồn có khả đưa thoả thuận tham gia nghiên cứu Bệnh nhân đủ tiêu chuẩn nghiên cứu, đồng ý tham gia nghiên cứu lấy máu tĩnh mạch (2ml máu) để tiến hành phân tích gen (đảm bảo quy trình, hạn chế tối đa rủi trình lấy) Bệnh viện Mọi chi phí 43 xét nghiệm, rủi ro q trình nghiên cứu nhóm nghiên cứu chi trả, chịu trách nhiệm Các thông tin đối tượng nghiên cứu đảm bảo bí mật Mẫu máu xét nghiệm phiếu điều tra thu thập thông tin, số liệu, kết xét nghiệm đối tượng nghiên cứu mã hóa Đối tượng biết tất kết xét nghiệm kết phân tích gen mình, kết thơng báo cho riêng bệnh nhân Chỉ có nhà nghiên cứu biết mã số cá nhân đối tượng nghiên cứu có quyền xem xét công bố kết nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu hồn tồn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu, khơng có ép buộc nào, tự nguyện tham gia ngiên cứu đưa vào nhóm nghiên cứu Đồng thời đối tượng nghiên cứu hồn tồn có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khơng muốn tiếp tục tham gia vào nghiên cứu thời điểm nào, lý mà khơng phải chịu chi phí hay bồi thường cho nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu làm xét nghiệm chẩn đoán xét nghiệm phân tích gen hồn tồn miễn phí Những xét nghiệm không gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu thơng báo kết phân tích gen Nghiên cứu chấp thuận sở nghiên cứu Bệnh viện Hữu Nghị Việt Tiệp 44 CHƯƠNG DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm chung đối tượng 3.1.1 Đặc điểm tuổi 3.1.2 Đặc điểm giới 3.2 Tỉ lệ dạng dột biến gen 45 CHƯƠNG DỰ KIẾN BÀN LUẬN Dựa vào mục tiêu kết nghiên cứu 46 DỰ KIẾN KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO ... hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu đột biến gen PIK3CA liên quan đến nguy ung thư dày người Việt Nam với mục tiêu sau: Đánh giá đột biến PIK3CA bệnh nhân ung thư dày bệnh viện Hữu Nghị Việt. .. tế bào 1.2.2 Gen PIK3CA ung thư dày Các đột biến gen PIK3CA tìm thấy nhiều loại ung thư, bao gồm ung thư buồng trứng, vú, phổi, não dày Các đột biến gen PIK3CA liên quan đến ung thư somatic,... DƯƠNG THỊ MINH THOA NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN PIK3CA LIÊN QUAN ĐẾN NGUY CƠ UNG THƯ DẠ DÀY TRÊN NGƯỜI VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số: 60720106 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Người hướng dẫn