10 giờ 5.04 8.65 6.61 4.03 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
lô chứng lô chứng dương uống furosemid 25mg/kg lô thử 1 uống CT4 680mg/kg lô thử 2 uống CT4 2040mg/kg thể tích n ước tiểu tích lũy sau 24 giờ (ml/100g) ** *
Nước tiểu tích lũy sau 10 giờ của các chuột trong thí nghiệm được đem định lượng xác định nồng độ các chất điện giải Na+, K+, Cl-.Kết quả thu được được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của CT4 lên nồng độ Na+, K+, Cl- trong nước tiểu tích lũy thu
được sau khi uống mẫu thử 10 giờ
Lô chuột Mẫu thử /liều
dùng
Nồng độ các chất điện giải 10 giờ sau cho uống
(µEqmin-1) K+ Na+ Cl- Lô chứng (n=10) - 70,33 ± 6,57 73,03 ± 4,38 107,33 ± 6,67 Lô chứng dương (n=10) uống furosemid liều 25mg/kg 76,63 ± 12,40 253,5 ± 44,20 ** 204,2 ± 29,85 ** Lô thử 1 (n=10) uống CT4 liều 680mg/kg 57,43 ± 10,01 97,03 ± 7,13* 113,28 ± 17,03 Lô thử 2 (n=10) uống CT4 liều 2040mg/kg 58,87 ± 8,29 119,2 ± 5,26* 107,12 ± 4,40
(Số liệu biểu diễn dưới dạng M ± SE *, p< 0,05 và **, p < 0,01 khi so sánh với chứng)
Nhận xét:
Về nồng độ Na+ trong nước tiểu tích lũy thu được sau khi cho uống 10 giờ:
Furosermid với liều 25 mg/kg làm tăng nồng độ Na+ trong nước tiểu tích lũy thu được tại thời điểm 10 giờ sau khi cho uống có ý nghĩa so với lô chứng (p < 0,05), tỉ lệ tăng là 247%.
CT4 với liều 680 mg/kg làm tăng rõ rệt nồng độ Na+ trong nước tiểu tích lũy thu được tại thời điểm 10 giờ sau khi cho uống so với lô chứng (p < 0,05), tỉ lệ tăng là 32,86 %.
CT4 với liều 2040 mg/kg cũng làm tăng nồng độ Na+ trong nước tiểu tích lũy thu được tại thời điểm 10 giờ sau khi cho uống có ý nghĩa so với lô chứng (p < 0,05), tỉ lệ tăng là 63,22%.
Về nồng độ K+ trong nước tiểu tích lũy thu được sau khi cho uống 10 giờ:
Furosermid với liều 25 mg/kg có gây tăng thải K+ so với lô chứng nhưng sự khác biệt này chưa có ý nghĩa thống kê.
CT4 với liều 680 mg/kg và 2040 mg/kg không ảnh hưởng đến nồng độ K+
trong nước tiểu chuột cống (p > 0,05).
Về nồng độ Cl- trong nước tiểu tích lũy thu được sau khi cho uống 10 giờ:
Furosermid với liều 25 mg/kg làm tăng nồng độ Cl- trong nước tiểu tích lũy thu được có ý nghĩa so với lô chứng tại thời điểm 10 giờ sau khi cho uống (p < 0,05), tỉ lệ tăng là 90,6%.
CT4 với liều 680 mg/kg và liều 2040 mg/kgkhông làm tăng nồng độ Cl-
trong nước tiểu tích lũy thu được tại thời điểm 10 giờ sau khi cho uốngcó ý nghĩa so với lô chứng(p >0,05).
3.2. Triển khai mô hình gây tăng huyết áp cho chuột cống bằng cortison acetat, áp dụng để đánh giá tác dụng hạ huyết áp của CT4
3.2.1. Triển khai mô hình gây tăng huyết áp cho chuột cống bằng cortison acetat và kỹ thuật đo huyết áp trực tiếp trên động mạch chuột cống
Mô hình gây tăng huyết áp cho chuột cống bằng cortison acetat được triển khai như sau:
Chuột cống đực trưởng thành được chia ngẫu nhiên làm 2 lô:
Lô chứng (n=9): chuột được uống nước và ăn thức ăn bình thường
Lô gây tăng huyết áp(n=9): chuột được tiêm dưới da cortison acetat hàng ngày với liều 2,5 mg/kg cân nặng, nước uống được bổ sung thêm 1% muối NaCl, chuột được ăn thức ăn bình thường.
Áp dụng chế độ ăn uống và tiêm thuốc như trên trong 21 ngày. Vào ngày thứ 22, tại thời điểm 24 giờ sau khi chuột nhận liều cortison acetat cuối cùng, đo huyết
áp trực tiếp bằng cách đặt catheter động mạch đùi chuột, nối catheter với máy Powerlab với bộ cảm biến thích hợp.
Cách tiến hành đặt catheter vào động mạch đùi cụ thể như sau: Cắt lông vùng bên trong đùi của 1 chân sau, dùng Povidon Iod để sát trùng. Rạch 1 đường dọc theo chân sau dài khoảng 2cm ở khu vực cắt lông bên trong đùi (vùng bẹn), từ đó tách các mô và màng mỏng bằng kéo và kẹp, đến khi bộc lộ được động mạch đùi.
Hình 3.4.Bộc lộ động mạch đùi chuột
Dùng hai đoạn chỉ khâu để cố định 2 đầu động mạch, cách nhau khoảng 1cm. Làm cho động mạch phình to để chuẩn bị đặt catheter. Buộc một nút lỏngtrên động mạch phía gần tim để đảm bảo máu không chảy ra khi cắt một lỗ nhỏ ở đoạn phía dưới đồng thời có thể tháo nút buộc dễ dàng. Catheter được cắt dài khoảng 20 – 25cm, cắt vát nhọn ở một đầu (một góc 30o), bơm đầyheparin (100U/mL) vào trong catheter.
Hình 3.5 Đặt catheter vào động mạch đùi chuột cống
Dùng mộtdao mổ nhỏ rạch theo hướng nghiêng 450 vào đoạn phình của động mạch, nhẹ nhàng luồn catheter vào động mạch tại vị trí đã rạch trước, luồn catheter vào động mạch đến khi có máu dâng lên trong catheter nghĩa là đã đưa catheter vào đúng cách. Đưa catheter vào sâu trong lòng mạch khoảng 1,5 cm, buộc cố định catheter vào mạch bằng hai dây chỉ khâu, đảm bảo máu trong catheter được lưu thông ổn định.
Sau khi khảo sát, nhóm nghiên cứu đã chọn được catheter có đường kính phù hợp để đặt vào động mạch đùi chuột là catheter có đường kính ngoài là 0,9 mm, đường kính trong lòng catheter là 0,4 mm.
Đầu còn lại của catheter được nối với máy Powerlab thông qua một ống nối tiếp đã bơm đầy heparin 100U/mL. Tiến hành đo huyết áp trực tiếp trên máy Powerlab với bộ cảm biến thích hợp, ghi lại huyết áp tâm thu và huyết áp tâm trương của chuột.
Hình 3.6. Đo huyết áp trực tiếp của chuột qua catheter nối với máy Powerlab
Hình 3.7. Hình ảnh băng tần huyết áp đo được của chuột lô chứng trắng và
lô gây tăng huyết áp
(1) Hình ảnh huyết áp lô chứng trắng
(2) Hình ảnh huyết áp của lôchuột được gây tăng huyết áp bằng cortison acetat liều 2,5 mg/kg kết hợp uống nước chứa 1% muối NaCl.
(1) (2)
Kết quả huyết áp tối đa, huyết áp tối thiểu của chuột được trình bày theo bảng sau:
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của cortison acetat liều 2,5 mg/kg lên huyết áp tối đa và
huyết áp tối thiểu của chuột
Lô chuột n Huyết áp tối đa
(mmHg)
Huyết áp tối thiểu (mmHg)
Lô chứng trắng 9 85,30 ± 2,95 74,58 ± 2,72 Lô gây tăng huyết áp
tiêm cortison acetat liều 2,5 mg/kgvà uống nước chứa
1% NaCl
9 121,92 ± 6,46 ** 110,90 ± 5,87 **
(Số liệu biểu diễn dưới dạng M ± SE ,**, p < 0,01 khi so sánh với chứng trắng)
Nhận xét:
Sau 21 ngày tiêm dưới da cortison acetat liều 2,5 mg/kg và uống nước chứa 1% NaCl,cả huyết áp tối đa và huyết áp tối thiểu của lô gây tăng huyết ápđều tăng có ý nghĩa thống kê so với lô chứng trắng (p < 0,01). Cortison acetat liều 2,5 mg/kg và nước uống chứa 1% NaCl làm tăng huyết áp tối đa lên 42,93% và tăng huyết áp tối thiểu lên 48,70% so với lô chứng trắng.
Như vậy, cortison acetat 2,5 mg/kg có tác dụng gây tăng huyết áp rõ rệt, gây tăng cả huyết áp tối đa và huyết áp tối thiểu của chuột.
Từ giá trị huyết áp tối đa và huyết áp tối thiểu đo được, áp dụng công thức tính huyết áp trung bình đã trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu để tính huyết áp trung bình của chuột. Kết quả huyết áp trung bình được trình bày theo hình 3.9. Trong đó:
Sau 21 ngày tiêm dưới da cortison acetat liều 2,5 mg/kg và uống nước chứa 1% NaCl, huyết áp trung bình của chuột lô gây tăng huyết áp tăng có ý nghĩa thống
kê so với lô chứng trắng (p < 0,01). Cortison acetat 2,5 mg/kg và nước uống chứa 1% NaCl làm tăng huyết áp trung bìnhcủa chuột lên 46,87% so với lô chứng trắng.
Hình 3.8:Ảnh hưởng của tiêm dưới da cortison acetat liều 2,5 mg/kg lên
huyết áp trung bình của chuột
(Số liệu biểu diễn dưới dạng M ± SE ,**, p < 0,01 khi so sánh với chứng trắng)
3.2.2. Đánh giá tác dụng hạ huyết áp của CT4 trên chuột cống thực nghiệm
Kết quả ảnh hưởng của CT4 lên huyết áp tối đa, huyết áp tối thiểu của chuột thực nghiệm được trình bày theo bảng 3.3.
Trong đó:
Hydroclorothiazid 25 mg/kg làm hạ đáng kể huyết áp tối thiểuđồng thời cũng làm hạ đáng kể huyết áp tối đa so với lô chứng bệnh (p < 0,01), với tỉ lệ giảm huyết áp tối thiểu, huyết áp tối đalần lượt là 28,58% và 26,58 % so với lô chứng bệnh.
CT4 liều 680 mg/kg làm giảm rõ rệthuyết áp tối thiểu có ý nghĩa so với lô chứng bệnh (p < 0,01), huyết áp tối thiểu ở lô uống CT4 liều 680 mg/kg giảm 23,10 % so với lô chứng bệnh. CT4 liều 680 mg/kg cũng làm giảm huyết áp tối đa có ý nghĩa so với lô chứng bệnh (p < 0,01), với tỉ lệ giảm là 22.97 %.
78.01 114.57 0 20 40 60 80 100 120 140 lô chứng trắng lô chứng bệnh
tiêm cortison acetat 2,5 mg/kg + uống nước 1% NaCl
huy ết áp trung bình (m mHg ) **
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cao CT4 lên huyết áp tối đa và huyết áp tối thiểu của chuột cống thực nghiệm
Lô chuột n Huyết áp tối đa
(mmHg)
Huyết áp tối thiểu (mmHg)
Lô chứng bệnh 9 121,92 ± 6,46 110,90 ± 5,87 Lô chứng dương
uống hydroclorothiazid25 mg/kg 9 89,50 ± 2,15
## 79,20 ± 2,54 ##
Lô thuốc nghiên cứu
uống CT4 với liều 680 mg/kg 9 93,92 ± 2,55
## 85,28 ± 2,14 ##
(Số liệu biểu diễn dưới dạng M ± SE ##, p < 0,01 khi so sánh với chứng bệnh).
Từ giá trị huyết áp tối đa và huyết áp tối thiểu đo được, áp dụng công thức tính huyết áp trung bình đã trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu để tính huyết áp trung bình của chuột. Kết quả huyết áp trung bình được trình bày theo hình sau:
Hình 3.9. Ảnh hưởng của cao CT4 lên huyết áp trung bình chuột cống
(Số liệu biểu diễn dưới dạng M ± SE ##, p < 0,01 khi so sánh với chứng bệnh).
114.57 82.63 88.19 0 20 40 60 80 100 120 140
lô chứng bệnh Lô chứng dương uống hydroclorothiazid
với liều 25 mg/kg
Lô thuốc nghiên cứu uống CT4 với liều 680
mg/kg huy ết áp trung bình (m mHg) ## ##
Nhận xét:
Hydroclorothiazid 25 mg/kg làm hạ đáng kể huyết áp trung bình so với lô chứng bệnh (p < 0,01), với tỉ lệ giảm là 27,87%.
CT4 liều 680 mg/kg làm giảm huyết áp trung bình rõ rệt so với lô chứng bệnh (p < 0,01) trênlô chuột gây tăng huyết áp bằng cortison acetat và NaCl 1%. Huyết áp trung bình ở lô uống CT4 liều 680 mg/kg giảm thấp hơn 23,02% so với lô chứng bệnh.Tác dụng hạ huyết áp của CT4 liều 680 mg/kg khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với tác dụng của hydroclorothiazid liều 25 mg/kg (p > 0,05)
3.4. Bàn luận
3.4.1. Về tác dụng lợi tiểu của CT4 trên động vật thí nghiệm
Hoạt động lợi tiểu xảy ra theo hai cơ chế bao gồm tăng ròng về khối lượng nước tiểu và tăng bài tiết các chất điện giải trong nước tiểu. Đó là kết quả của sự ức chế tái hấp thu nước và điện giải từ hầu hết các vị trí của ống thận vào máu. Các thuốc lợi tiểu làm tăng khối lượng nước tiểu, chủ yếu bằng cách tăng thải trừ Na+ và nước ở dịch ngoại bào gây lợi tiểu. Trong đó, các thuốc lợi tiểu thiazid gây ức chế hệ đồng vận chuyển Na+/Cl- ở đoạn pha loãng của ống lượn xa, làm tăng thải trừ K+
và H+. Các thuốc lợi tiểu quai như furosemid lại phong tỏa cơ chế đồng vận chuyển ở nhánh lên quai Henle, làm tăng thải trừ Na+, K+, Cl- kéo theo nước nên có tác dụng lợi tiểu.
Dược liệu được lựa chọn để đánh giá tác dụng lợi tiểu và hạ huyết áp trong đề tài này làcây Đa đa, hay còn gọi là cây Xân – Harrisonia perforate Merr. (họ Thanh thất – Simaroubaceae). H.perforate là một dược liệu đã được dùng phổ biến ở Ấn Độ với nhiều công dụng nổi tiếng đã được khoa học chứng minh như chống ung thư, lợi tiểu, bảo vệ tế bào gan và bảo vệ thận… Dược liệu này cũng đã được tìm thấy ở Việt Nam nhưng tác dụng dược lý của nó chưa được nghiên cứu nhiều. Việc sử dụng dịch chiết CT4 với tác dụng lợi tiểu,hạ huyết áp chủ yếu dựa trên kinh nghiệm dân gian của Ấn Độ. Nhóm nghiên cứu tiến hành đánh giá tác dụng lợi tiểu của CT4 trên chuột cống thực nghiệm ở hai mức liều 680 mg/kg và 2040 mg/kg, so
sánh với lô chứng trong đó furosemid được dùng làm chất đối chiếu. Kết quả thể tích nước tiểu tích lũy thu được cho thấy ở mức liều 25mg/kg furosemid gây tác dụng lợi tiểu rất nhanh và mạnh, tỉ lệ tăng thể tích nước tiểu thu được tại cả 3 thời điểm 5 giờ, 10 giờ, 24 giờ so với lô chứng lần lượt là 500%; 97,6 % và 71, 62 %. Dịch chiết CT4 với liều 680 mg/kg cũng gây tăng thể tích nước tiểu tương tự furosemid với liều 25 mg/kg ở thời điểm 10 giờ và 24 giờ nhưng mức độ tăng chậm hơn. Việc sử dụng liều cao CT4 2040 mg/kg không làm tăng thể tích nước tiểu ở bất kì thời điểm nào so với lô chứng. Xét về sự bài tiết các chất điện giải sau 10 giờ cho uống mẫu thử cho thấy CT4 ở cả hai mức liều 680 mg/kg và 2040 mg/kg đều làm tăng nồng độ Na+ trong nước tiểu tích lũy thu được tại thời điểm 10 giờ sau khi cho uống mẫu thử (p<0,05), nhưng không ảnh hưởng đến nồng độ K+và Cl-trong nước tiểu.
Một số dược liệu được đánh giá có tác dụng lợi tiểu như dịch chiết
Hemidesmus indicus trong dung môi dầu (EtE) và dung môi nước (AqE) với liều 200 mg/kg và 400 mg/kg. Chuột được nhốt riêng từng con và thu thập nước tiểu tại các thời điểm 5 giờ và 24 giờ. Kết quả cho thấy pH và nồng độ bilirubin, urobilinogen, ceton, protein, nitrit, glucose và số lượng bạch cầu trong nước tiểu không có sự khác nhau giữa nhóm chuột dùng H. indicus và nhóm chứng. Tại thời điểm 5 giờ và 24 giờ cho uống mẫu thử, chuột trong các lô uống dịch chiết AqE liều 200 mg/kgvà 400 mg/kg, lô uống dịch chiết EtE liều 400 mg/kg đều có thể tích nước tiểu tăng rõ rệt so với lô chứng(p < 0,05). Dịch chiết EtE liều 200 mg/kg không làm tăng bài tiết nước tiểu có ý nghĩa so với lô chứng (p >0,05). Chuột uống dịch chiết AqE (liều 400 mg/kg) làm tăng bài tiết K+ (p < 0.05), tăng bài tiết Na+ (p < 0,01) và tăng bài tiết Cl- (p < 0,01) so với lô chứng, trong khi các dịch chiết AqE (200mg/kg) và EtE ở cả 2 mức liều 200 mg/kg và 400 mg/kgchỉ làm tăng bài tiết Na+và Cl- mà không ảnh hưởng đến bài tiết K+. Nghiên cứu cũng cho thấy dịch chiết rễ H.indicus không gây độc tính trên thận ở chuột.
Như vậy dựa trên các kết quả thu thập được về thể tích nước tiểu tích lũy sau 5 giờ, 10 giờ, 24 giờ và nồng độ các chất điện giải trong nước tiểu sau 10 giờ, có thể
sơ bộ nhận xét dịch chiết CT4 liều 680 mg/kg có tác dụng lợi tiểu. Ở liều cao 2040 mg/kg CT4 không thể hiện được tác dụng lợi tiểu này. Do đó mức liều CT4 680 mg/kg được lựa chọn để đánh giá tác dụng lợi tiểu áp dụng cho các nghiên cứu tiếp theo trên chuột cống thực nghiệm.
3.4.2. Triển khai mô hình gây tăng huyết áp cho chuột cống bằng cortison acetat
Tăng huyết áp là một bệnh lý mạn tính với tỷ lệ mắc bệnh cao và có nhiều bệnh lý đi kèm khác, đòi hỏi quá trình điều trị kéo dài. Có hai mục tiêu điều trị tăng huyết áp chính là đạt huyết áp mục tiêu và làm giảm tối đa các nguy cơ tim mạch. Hiện nay, cùng với sự phát triển của các tiến bộ khoa học kỹ thuật trong nghiên cứu đã làm sáng tỏ nhiều cơ chế liên quan đến sinh bệnh lý tăng huyết áp. Nhiều phác đồ thuốc đã được đề xuất để điều trị tăng huyết áp khởi phát do các nguyên nhân khác nhau. Nhiều mô hình gây tăng huyết áp và các kỹ thuật đo huyết áp trên động vật thực nghiệm đã được nghiên cứu và công bố. Các mô hình này được phát triển dựa trên các yếu tố bệnh sinh của người như: tăng huyết áp do chế độ ăn nhiều muối, do các bệnh lý động mạch thận, do nội tiết, tâm lý hay do di truyền…như vậy các mô hình tăng huyết áp nghiên cứu trên động vật đã có những đặc điểm tương tự