Nam Á. Bộ phận dùng là rễ, vỏ thân, cành lá và quả. Thu hái quanh năm.
1.4.3. Thành phần hóa học và các nghiên cứu về tác dụng dược lý của H.perforate H.perforate
Trong lá H.perforate có các limonoid như perforatin, perforatinolon và các chất khác (Đỗ Huy Bích và cộng sự, 2004; Nguyễn Viết Kình, 1996). Quả có chứa các limonoid như 5,6-dehydrodesepoxyharperforin C2, harrpernoid B, v.v…(Xiao-Hui Yana, et al., 2011). Harperfolide được tìm thấy trong quả và rễ có tác dụng chống viêm (Choodej S, et al., 2013).
Rễ và các bộ phận có vị đắng, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt giải độc. Người ta thường dùng vỏ thân, cành lá sắc uống chữa ỉa chảy, kiết lỵ, sốt rét, đau nhức xương, lợi tiểu và làm thuốc điều kinh. Các nước khác dùng quả trị nhọt bàn chân, rễ chế thành siro trị sốt rét, làm thuốc hạ sốt (Đỗ Huy Bích và cộng sự, 2004; Nguyen-Pouplin J, et al., 2007; Chea A, et al., 2007).
Theo dữ liệu dân tộc học, cây Đa đa có tác dụng trị chóng mặt, đau đầu và lợi tiểu nhưng chưa có thử nghiệm chứng minh tại Việt Nam cũng như trên thế giới. Vì vậy, nghiên cứu tác dụng hạ huyết áp và tác dụng lợi tiểu đã được tiến hành trên thực nghiệm.
2.1. Đối tượng
2.1.1. Mẫu nghiên cứu
Lá Đa đa (Harrisonia perforate Merr.) thu hái tại Lâm Đồng trong tháng 4 năm 2012, được giám định bởi Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật. Lá rửa sạch, sấy khô, bảo quản trong điều kiện sạch.
Lá được sấy khô ở5000C (2kg) và nghiền thành bột mịn. Tiến hành chiết nóng lá Đa đa bằng nước cất (quá trình chiết được lặp lại 3 lần). Loại nước dịch chiết dưới áp suất giảm dến khi thu được cao lỏng 1:1, bảo quản cao trong điều kiện thích hợp để thử tác dụng sinh học.
2.1.2. Động vật sử dụng trong nghiên cứu
Nhóm nghiên cứu sử dụng chuột cống trắng chủng Wistar, giống đực, 12 – 13 tuần tuổi, cân nặng từ 180 – 220 g, khỏe mạnh do Học viện Quân y cung cấp. Chuột được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm tại khu nghiên cứu động vật thực nghiệm bộ môn Dược lý trường Đại học Dược Hà Nội 5 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm, được ăn viên thức ăn chuẩn do Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ương cung cấp và uống nước tự do.
2.2. Hóa chất và trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm
2.2.1. Hóa chất
Furosemid, dung dịch tiêm 20 mg/2 mL, Lasix, Aventis.
Thiopental,bột pha tiêm 100mg, Rotex medical, Trittau, Germany.
Xylazin, thuốc tiêm 20mg/1ml, Kepro, Holland.
Heparin, thuốc tiêm 2 mg/mL, Canada.
Cortison acetat (chất chuẩn do Viện kiểm nghiệm Quốc gia cung cấp)
Dung dịch NaCl 0.1% (g/l), Pharmedic.
2.2.2. Trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm
Bộ dụng cụ phẫu thuật chuột cống: bàn mổ, panh, kẹp, bơm tiêm, kéo, kim, chỉ khâu, dụng cụ cho chuột uống thuốc.
Catheter vô trùng đường kính trong 0,4 mm, đường kính ngoài 0,9 mm do hãng AD instrusment, chi nhánh Singapore cung cấp
Ống đong có chia vạch mL.
Chuồng nuôi chuột.
Máy Powerlab với bộ cảm biến thích hợp để đo huyết áp chuột của hãng AD instrusment(hình 2.1)
Hình 2.1.Máy Powerlab với bộ cảm biến
2.3. Nội dung nghiên cứu
Đề tài được thực hiện với 2 nội dung chính:
Đánh giá tác dụng lợi tiểu của CT4 trên chuột cống thực nghiệm.
Triển khai mô hình gây tăng huyết áp cho chuột cống bằng cortison acetat. Áp dụng để đánh giá tác dụng hạ huyết áp của CT4 trên chuột cống thực nghiệm.
2.4. Phương pháp nghiên cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.1. Đánh giá tác dụng lợi tiểu của CT4
Nguyên tắc tiến hành:
Đánh giá tác dụng lợi tiểu của cao CT4, so sánh với furosemid và nhóm chứng dựa trên việc theo dõi các chỉ số về thể tích nước tiểu và nồng độ Na+, K+, Cl- trong nước tiểu chuột thu được sau 5 giờ, 10 giờ, 24 giờ sau khi cho chuột uống mẫu thử.
Liều sử dụng:
Furosemid trong CMC – Na 0,5% liều 25mg/kg cân nặng chuột cống.
CT4 trong CMC – Na 0,5% liều 680 mg/kg và 2040 mg/kg cân nặng chuột cống.
Cách tiến hành
Chuột được chia ngẫu nhiên vào 4 lô, mỗi lô 10 con và cho uống mẫu thử như sau:
Lô chứng (n = 10): uống dung môi pha mẫu thử CMC – Na 0,5%.
Lô chứng dương (n = 10): uống furosermid trong CMC-Na 0,5% với liều 25 mg/kg cân nặng.
Lô thử 1 (n = 10): uống CT4 trong CMC – Na 0,5% liều 680 mg/kg cân nặng.
Lô thử 2 (n = 10): uống CT4 trong CMC – Na 0,5% liều 2040 mg/kg cân nặng.
Chuột được cho uống dung môi pha mẫuthử với cùng thể tích là 1 ml/100g chuột.
Sau khi được uống mẫu thử, chuột được nhốt riêng từng con và thu thập nước tiểu tại các thời điểm 5 giờ, 10 giờ và 24 giờ. Chuột được cho ăn tự do và uống nước cưỡng bức trong suốt quá trình thí nghiệm
Tiến hành đo tổng thể tích nước tiểu thu được của chuột sau 5 giờ, 10 giờ và 24 giờ. Nước tiểu của mỗi chuột được đựng trong ống đong riêng và được bảo quản
lạnh. Sau đó nước tiểu tích lũy sau 10 giờ của chuột được mang đi phân tích các chỉ số Na+, K+, Cl- bằng máy phân tích điện giải Roche 9180 tại khoa Sinh Hóa – bệnh viện Bạch Mai.
Nguyên tắc định lượng Na+, K+, Cl- trong nước tiểu:
Máy phân tích điện giải Roche AVL 9180 sử dụng điện cực chọn lọc ion (ion selective electrode – ISE) để định lượng nồng độ các chất điện giải trong dung dịch mẫu thử. Màng chọn lọc ion có tác dụng ngăn cách dung dịch mẫu cần định lượng và dung dịch chất điện ly chuẩn. Màng hoạt động như một hệ trao đổi ion, trên màng xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa các ion có trong dung dịch chuẩn và các ion trong dung dịch mẫu cần định lượng. Trong máy Roche AVL 9180, điện cực Na+ là một điện cực màng thủy tinh gồm một ống thủy tinh chọn lọc ion Na+. Điện cực K+
và Cl- cũng có màng điện cực thủy tinh chọn lọc tương ứng các ion K+ và Cl-. Thế của mỗi điện cực được tính theo thế điện cực chuẩn là Ag/AgCl theo phương trình Nerst, từ đó xác định được nồng độ các ion Na+, K+, Cl- trong mẫu nước tiểu chuột.
Đánh giá dựa trên các chỉ số:
Thể tích nước tiểu thu được sau 5 giờ.
Thể tích nước tiểu thu được sau 10 giờ.
Thể tích nước tiểu thu được sau 24 giờ.
Nồng độ Na+, K+, Cl- trong nước tiểu tích lũy sau 10 giờ.
2.4.2 Triển khai mô hình gây tăng huyết áp cho chuột cống bằng cortison acetat, áp dụng để đánh giá tác dụng hạ huyết áp của CT4 áp dụng để đánh giá tác dụng hạ huyết áp của CT4
2.4.2.1. Triển khai mô hình gây tăng huyết áp cho chuột cống bằng cortison acetat và kỹ thuật đo huyết áp trực tiếp trên động mạch chuột cống
Nguyên tắc tiến hành: Cortison acetat là một glucocorticoid quan trọng
trong các hoạt động của cơ thể. Cortison acetat ảnh hưởng lên cân bằng điện giải hoặc qua tác động lên thụ thể mineralcorticoid (có tác dụng giữ Na+ và nước, tăng bài xuất K+), hoặc qua tác động lên thụ thể glucocorticoid (gây tăng sức lọc cầu
thận, tăng cung lượng tim). Do đó, nếu dùng cortison acetat kéo dài có thể dẫn đến tăng huyết áp mức độ vừa phải.
Chuột cống trắng giống đực được gây tăng huyết áp bằng cách tiêm dưới da cortison acetat và cho uống nước chứa 1% NaCl liên tục trong 21 ngày.Áp dụng kĩ thuật đặt catheter động mạch đùi chuột cống để đo trực tiếp huyết áp tối đa, huyết áp tối thiểu của chuột bằng máy Powerlab có gắn bộ cảm biến thích hợp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cách tiến hành: Thí nghiệm sử dụng chuột cống đực trưởng thành, chia
chuột ngẫu nhiên làm 2 lô:
Lô chứng (n=9): chuột được uống nước và ăn thức ăn bình thường
Lô gây tăng huyết áp(n=9): chuột được tiêm dưới da cortison acetat hàng ngày với liều 2,5 mg/kg cân nặng, nước uống được bổ sung thêm 1% muối NaCl, được ăn thức ăn bình thường trong 21 ngày.
Vào ngày thứ 22, tại thời điểm 24 giờ sau khi chuột nhận liều cortison acetat cuối cùng, đo huyết áp tối đa, huyết áp tối thiểu trên động mạch đùi chuột bằng máy Powerlab thông qua một catheter đặt vào động mạch đùi chuột.
Quá trình gây tăng huyết áp và đo huyết áp được tiến hành tại bộ môn Dược lý – Đại học Y Hà Nội.
Đánh giá tác dụng gây tăng huyết áp của cortison acetat dựa trên các chỉ số:
Huyết áp tối đa của chuột.
Huyết áp tối thiểu của chuột.
Huyết áp trung bình của chuột.
2.4.2.2. Đánh giá tác dụng hạ huyết áp của dịch chiết rễ CT4
Mục đích: Dựa trên mô hình gây tăng huyết áp chuột cống bằng cortison
acetat đã xây dựng, tiến hành đánh giá tác dụng hạ huyết áp của dịch chiết rễ CT4, so sánh với nhóm chứng bệnh và với tác dụng hạ huyết áp chuột của hydroclorothiazid liều 25 mg/kg cân nặng chuột. Đánh giá qua các chỉ số huyết áp tối đa, huyết áp tối thiểu và huyết áp trung bình của chuột.
Cách tiến hành: Chuột cống đực trưởng thành sau khi nuôi ổn định trong
điều kiện phòng thí nghiệm 5 ngày được chia thành 3 lô như sau:
Lô chứng bệnh(n=9): uống nước muối NaCl 1%, tiêm dưới da cortison acetat 2.5 mg/kg uống dung môi dùng để pha mẫu thử (CMC-Na 0,5 %).
Lô chứng dương(n=9): uống nước muối NaCl 1%, tiêm dưới da cortison acetat 2,5 mg/kg và uống hydroclorothiazid pha trong CMC – Na 0,5 % với liều 25 mg/kg.
Lô thuốc nghiên cứu(n=9): uống nước muối NaCl 1%, tiêm dưới da cortison acetat 2,5 mg/kg và uống CT4 pha trong CMC – Na 0,5 % với liều 680 mg/kg.
Chuột trong các lô thử nghiệm đều được ăn thức ăn bình thường, được uống nước muối NaCl 1% trong suốt quá trình thí nghiệm và tiêm dưới da cortison acetat trong 21 ngày liên tục.
Sau khi tiêm cortison acetat 17 ngày, bắt đầu cho uống mẫu thử hoặc dung môi dùng pha mẫu thử (đối với lô chứng bệnh) liên tục trong 5 ngày. 24 giờ sau khi chuột nhận liều cortison acetat và liều mẫu thử cuối cùng, tiến hành đo huyết áp trực tiếp trên động mạch chuột cống bằng cách đặt catheter vào động mạch đùi chuột. Đo huyết áp trên máy Powerlab có gắn bộ cảm biến thích hợp tại bộ môn Dược lý – Đại học Y Hà Nội.
Đánh giá tác dụng hạ huyết áp của CT4 dựa trên các chỉ số:
Huyết áp tối đa của chuột.
Huyết áp tối thiểu của chuột.
Huyết áp trung bình của chuột.
Huyết áp trung bình của động vật thí nghiệm được tính theo công thức: HATB = 2 x HATT + HATĐ
3 Trong đó:
HATB: huyết áp trung bình HATT: huyết áp tối thiểu HATĐ: huyết áp tối đa
2.5. Xử lý số liệu
Dữ liệu được lưu trữ, phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS 16.0.
Kết quả nghiên cứu được biểu diễn dưới dạng M ± SE (M: giá trị trung bình từng lô, SE: sai số chuẩn). So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng one-way ANOVA, dùng LSD test, DunnettT3 test để so sánh giá trị trung bình giữa các lô. Sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa thống kê khi p< 0,05. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Tác dụng lợi tiểu của CT4 trên thực nghiệm
3.1.1. Ảnh hưởng của CT4 trên thể tích nước tiểu
Nhóm nghiên cứu tiến hành cho chuột trong các lô uống mẫu thử hoặc dung môi pha mẫu thử, sau đó chuột được nhốt riêng trong các lồng và thu nước tiểu tại các thời điểm 5 giờ, 10 giờ và 24 giờ. Kết quả thể tích nước tiểu tích lũy thu được của chuột cống trắng ở lô chứng, chứng dương (uống furosermid), lô thử(uống CT4 với các liều khác nhau) được trình bày trong các hình 3.1, 3.2, 3.3.
Hình 3.1.Ảnh hưởng của CT4 lên thể tích nước tiểu chuột sau khi uống mẫu thử 5h
(Số liệu biểu diễn dưới dạng M ± SE,**, p < 0,01 khi so sánh với chứng)
Nhận xét:
Tại thời điểm 5 giờ sau khi uống mẫu thử hoặc dung môi pha mẫu thử, thể tích nước tiểu tích lũy thu được ở lô chứng dương (uống furosermid 25 mg/kg) tăng có ý nghĩa so với lô chứng (p < 0,01). Thể tích nước tiểu tăng 500% so với lô chứng. 1.02 6.13 0.59 0.47 0 1 2 3 4 5 6 7
lô chứng lô chứng dương uống furosemid 25mg/kg lô thử 1 uống CT4 680mg/kg lô thử 2 uống CT4 2040mg/kg thể tích n ướ c tiểu t ích lũy sau 5 giờ (ml/10 0g) **
CT4 với hai mức liều 680 mg/kg và 2040 mg/kg không làm tăng thể tích nước tiểu tích lũy có ý nghĩa so với lô chứng sau khi cho chuột uống 5 giờ (p > 0,05).
Hình 3.2.Ảnh hưởng của CT4 lên thể tích nước tiểu chuột sau uống mẫu thử 10h
(Số liệu biểu diễn dưới dạng M ± SE *, p < 0,05 và **, p < 0,01 khi so sánh với chứng)
Nhận xét:
Tại thời điểm 10 giờ sau khicho chuột uống mẫu thử hoặc dung môi pha mẫu thử, thể tích nước tiểu tích lũy thu được ở lô chứng dương (uống furosermid 25 mg/kg) tăng có ý nghĩa so với lô chứng (p < 0,01), với tỷ lệ tăng là 97,6 %.
Thể tích nước tiểu tích lũy thu được ở lô thử 1 (uống CT4 liều 680 mg/kg) tăng có ý nghĩa so với lô chứng (p < 0,05), với tỷ lệ tăng so với lô chứng là 20,4 %.
Mẫu thử CT4 liều 2040 mg/kg không làm tăng thể tích nước tiểu tích lũy có ý nghĩa so với lô chứng tại thời điểm 10 giờ (p > 0,05).
3.77 7.45 4.54 2.69 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
lô chứng lô chứng dương uống furosemid 25mg/kg lô thử 1 uống CT4 680mg/kg lô thử 2 uống CT4 2040mg/kg thể tích nư ớc tiểu tích lũy sau 10 giờ (ml /100g) ** *
Hình 3.3.Ảnh hưởng của CT4 lên thể tích nước tiểu chuột sau khi cho uống 24 giờ
(Số liệu biểu diễn dưới dạng M ± SE *, p<0,05 và **, p< 0,01 khi so sánh với chứng)
Nhận xét:
Tại thời điểm 24 giờ sau khi cho chuột uống mẫu thử hoặc dung môi pha mẫu thử, furosemid với liều 25mg/kg làm tăng đáng kể thể tích nước tiểu tích lũy thu được trên chuột cống trắng (p<0,01). Tỉ lệ tăng tại thời điểm 24 giờ sau khi cho uống là 71,62%.
Mẫu thử CT4 với liều 2040 mg/kg không làm tăng thể tích nước tiểu tích lũy so với lô chứng tại thời điểm 24 giờ(p > 0,05).
Trong khi đó ở mức liều 680 mg/kg CT4 làm tăng thể tích nước tiểu tích lũy có ý nghĩa so với lô chứng tại thời điểm 24 giờ sau khi dùng mẫu thử (p<0,05)với tỉ lệ tăng là 31,1%.
3.1.2. Ảnh hưởng của CT4 lên nồng độ Na+, K+, Cl- trong nước tiểu thu được sau
10 giờ 5.04 8.65 6.61 4.03 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
lô chứng lô chứng dương uống furosemid 25mg/kg lô thử 1 uống CT4 680mg/kg lô thử 2 uống CT4 2040mg/kg thể tích n ước tiểu tích lũy sau 24 giờ (ml/100g) ** *
Nước tiểu tích lũy sau 10 giờ của các chuột trong thí nghiệm được đem định lượng xác định nồng độ các chất điện giải Na+, K+, Cl-.Kết quả thu được được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của CT4 lên nồng độ Na+, K+, Cl- trong nước tiểu tích lũy thu
được sau khi uống mẫu thử 10 giờ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lô chuột Mẫu thử /liều
dùng
Nồng độ các chất điện giải 10 giờ sau cho uống
(µEqmin-1) K+ Na+ Cl- Lô chứng (n=10) - 70,33 ± 6,57 73,03 ± 4,38 107,33 ± 6,67 Lô chứng dương (n=10) uống furosemid liều 25mg/kg 76,63 ± 12,40 253,5 ± 44,20 ** 204,2 ± 29,85 ** Lô thử 1 (n=10) uống CT4 liều 680mg/kg 57,43 ± 10,01 97,03 ± 7,13* 113,28 ± 17,03 Lô thử 2 (n=10) uống CT4 liều 2040mg/kg 58,87 ± 8,29 119,2 ± 5,26* 107,12 ± 4,40
(Số liệu biểu diễn dưới dạng M ± SE *, p< 0,05 và **, p < 0,01 khi so sánh với chứng)
Nhận xét:
Về nồng độ Na+ trong nước tiểu tích lũy thu được sau khi cho uống 10 giờ:
Furosermid với liều 25 mg/kg làm tăng nồng độ Na+ trong nước tiểu tích lũy thu được tại thời điểm 10 giờ sau khi cho uống có ý nghĩa so với lô chứng (p < 0,05), tỉ lệ tăng là 247%.
CT4 với liều 680 mg/kg làm tăng rõ rệt nồng độ Na+ trong nước tiểu tích lũy