Xác định đột biến trên một số exon trọng điểm của gen RB1 ở bệnh nhân ung thư võng mạc

Phát hiện đột biến gen RB1 trên các bệnh nhân ung thư võng mạc là tiền đề quan trọng giúp phát hiện người lành mang bệnh và chẩn đoán trước sinh nhằm giảm tỷ lệ tử vong, tỷ lệ mù lòa ở trẻ. Đột biến trên gen RB1 thường là đột biến điểm và gặp nhiều ở một số exon trọng điểm trong đó có exon 10, 14, 20. Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu: xác định đột biến gen RB1 trên exon 10, 14, 20. 49 bệnh nhân ung thư võng mạc được lựa chọn nghiên cứu.

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN MỘT SỐ EXON TRỌNG ĐIỂM CỦA GEN RB1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÕNG MẠC Vũ Đức Anh1, Trần Huy Thịnh1, Phạm Trọng Văn1,2, Phạm Hồng Vân2, Tạ Thành Văn1, Trần Vân Khánh1 Trường Đại học Y Hà Nội; 2Bệnh viện Mắt Trung ương Ung thư võng mạc khối u ác tính thường gặp ổ mắt trẻ sơ sinh trẻ nhỏ, bệnh gây nên đột biến gen RB1 làm giảm chức protein RB1 Ở nước phát triển Việt Nam, phần lớn trường hợp phát muộn trẻ thường phải khoét bỏ nhãn cầu, chí đe dọa tính mạng trẻ Phát đột biến gen RB1 bệnh nhân ung thư võng mạc tiền đề quan trọng giúp phát người lành mang bệnh chẩn đoán trước sinh nhằm giảm tỷ lệ tử vong, tỷ lệ mù lòa trẻ Đột biến gen RB1 thường đột biến điểm gặp nhiều số exon trọng điểm có exon 10, 14, 20 Nghiên cứu thực với mục tiêu: xác định đột biến gen RB1 exon 10, 14, 20 49 bệnh nhân ung thư võng mạc lựa chọn nghiên cứu Kỹ thuật giải trình tự gen áp dụng để xác định đột biến điểm exon 10, 14 20 5/49 (10,2%) bệnh nhân phát đột biến, bệnh nhân phát đột biến p.Trp680Cys bệnh nhân phát đột biến p.Glu692Val_Leu693Ile exon 20, bệnh nhân phát đột biến p.Tyr452Phe exon 14, bệnh nhân phát đột biến: p.Tyr452Phe p.Val455Glu exon 14 Bệnh nhân lại phát đột biến p.Thr345Arg frameshift X6 exon 10 Tất đột biến đột biến dị hợp đột biến chưa cơng bố Từ khóa: Ung thư võng mạc, gen RB1, đột biến gen I ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư võng mạc bệnh lý ác tính Gần 40% đột biến gen RB1 tái diễn tập thường gặp ổ mắt trẻ sơ sinh trẻ trung 16 điểm bao gồm 12 đột biến vô nhỏ, với tần suất thường gặp từ 1/15.0001/18.000 trẻ sinh ra, bệnh liên quan tới nghĩa (nonsense), 02 đột biến sai nghĩa đột biến gen RB1 [1 - 3] Đột biến gây bệnh gen RB1 làm giảm chí Những đột biến lại nằm rải rác dọc gen chức protein pRB, từ dẫn tới kiểm sốt q trình nhân lên tế bào, dẫn 14, 17, 18, 20 23 [2 - 6] Việc phát tới khả kiểm sốt phân bào hình triển khai kỹ thuật sinh học phân tử thành khối u võng mạc [4] phục vụ cho chẩn đoán trước sinh, đồng thời Các nghiên cứu công bố có 900 đột biến gen RB1 sở liệu quan trọng cho tư vấn di truyền cho biết đặc điểm mối quan hệ kiểu gen kiểu hình bệnh Địa liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội (missense), 03 đột biến vị trí nối (splicing) RB1 tỷ lệ gặp cao exon 9, 10, đột biến gen RB1 sở cho việc phát triển quản lý tốt người mang gen nhằm giảm tỷ lệ biến chứng tỷ lệ tử vong trẻ [7 - 9] Ung thư võng mạc bệnh lý gặp, nhiên số lượng bệnh nhân tới khám điều trị Bệnh viện Mắt Trung ương ngày tăng Năm 2005 có 14 bệnh nhân Email: tranvankhanh@hmu.edu.vn phát chẩn đốn vòng Ngày nhận: 18/9/2018 năm, nhiên tới năm 2013 số Ngày chấp thuận: 11/10/2018 tăng lên 52 trẻ tới khám điều trị [10] TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Ở Việt Nam, nghiên cứu liên quan đến ung thư võng mạc ít, chủ yếu 72oC/30 giây], 72oC/5 phút Bảo quản mẫu 10oC nghiên cứu lĩnh vực lâm sàng nên Kỹ thuật giải trình tự gen: sản phẩm nghiên cứu gen liên quan tới ung thư võng PCR tiến hành giải trình tự trực tiếp mạc chưa nhiều, thơng tin hạn chế máy ABI 3100 Genetic Analyzer Kết Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tơi tiến hành thu thập xử lý phần mềm ABI nghiên cứu đề tài nhằm mục tiêu xác định đột PRISM biến số exon trọng điểm gen RB1 Sequencing Analysis 5.2 BLAST NCBI bệnh nhân ung thư võng mạc Trình tự so sánh ngân hàng gen: II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP DNA (NG_009009.1) phần mềm CLC TM 3100 – Avant Data Collection, DNA Đạo đức nghiên cứu Đối tượng 49 bệnh nhân chẩn đoán ung thư Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ theo đạo đức nghiên cứu Y học Bệnh nhân võng mạc Bệnh viện Mắt Trung ương dựa gia đình bệnh nhân hồn tồn tự nguyện tham lâm sàng chẩn đốn hình ảnh gia vào nghiên cứu có quyền rút lui khỏi nghiên cứu không đồng ý tiếp tục tham có kết giải phẫu bệnh ung thư võng mạc, bệnh nhân gia đình đồng ý tham gia nghiên cứu gia Bệnh nhân gia đình thơng báo kết xét nghiệm gen để giúp cho bác Phương pháp sỹ tư vấn di truyền lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp Các thông tin cá nhân - Lấy mẫu bệnh phẩm: 2ml máu tĩnh mạch đảm bảo bí mật chống đơng EDTA - Tách chiết DNA từ máu ngoại vi: DNA tổng số tách chiết từ máu toàn phần phenol-chloroform-isopropanol (25:24:1) III KẾT QUẢ Kết xác định khuếch đại exon 10, 14 20 gen RB1 khuếch đại exon 10, 14 20 gen RB1 Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho exon 10, 14 20 gen RB1 để khuếch đại DNA sau với cặp mồi thiết kế tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân Hình - Kỹ thuật PCR: PCR sử dụng để - Thành phần phản ứng PCR (thể tích 20µl) gồm: nước cất PCR 11,9 µl; buffer 10X 2,0 µl; 2,5 mM dNTP, 0,5 µM mồi xuôi ngược, 0,5U Taq polymerase, 3,0µl DNA o Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 94 C/5 phút, 35 chu kỳ [94oC/30 giây, 55oC/30 giây, hình ảnh PCR đại diện khuếch đại exon 10 gen RB1 Sản phẩm PCR thu có băng đặc hiệu, rõ nét, kích thước 291 bp khơng có sản phẩm phụ Sản phẩm khuếch đại PCR đảm bảo cho phản ứng giải trình tự để phát đột biến điểm (hình 1) TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC MK (+) (-) 291 bp Hình Hình ảnh điện di sản phẩm PCR exon 10 gen RB1 (+) mẫu đối chứng dương; (-) mẫu chứng âm; (1-9) mẫu bệnh nhân; (MK) Marker (100bp) Kết xác định đột biến gen RB1 Sản phẩm PCR giải trình tự gen để xác định đột biến Kết cho thấy 5/49 (10,2%) bệnh nhân phát đột biến, bệnh nhân phát đột biến p.Trp680Cys bệnh nhân phát đột biến p.Glu692Val_Leu693Ile exon 20, bệnh nhân phát đột biến p.Tyr452Phe exon 14 bệnh nhân khác phát đột biến p.Tyr452Phe p.Val455Glu exon 14 Bệnh nhân lại phát đột biến p.Thr345Arg frameshift X6 exon 10 Bảng Kết xác định đột biến exon 10, 14, 20 gen RB1 Mã Đột biến Thay đổi protein Thể đột biến Exon Loại đột biến Chú thích RB29 c.2041 G > T p.Trp680Cys Dị hợp 20 Missense New RB53 c.1357 A > T p.Tyr452Phe Dị hợp 14 Missense New RB57 c.1357 A > T c.1366 T > A p.Tyr452Phe p.Val455Glu Dị hợp Dị hợp 14 14 Missense Missense New New RB68 c.2077_2079 AAC > TTA p.Glu692Val_ Leu693Ile Dị hợp 20 Missense New RB79 c.1033delCT p.Thr345Arg frameshift X6 Dị hợp 10 Deletion New bệnh nhân Missense: đột biến sai nghĩa; Deletion: đột biến nucleotid; New: đột biến chưa công bố TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC c.1357A > T p.Tyr452Phe c.1357A Người bình thường Bệnh nhân RB57 c.1366T > A p.Val455Glu c.1366T Người bình thường Bệnh nhân RB57 Hình Hình ảnh giải trình tự đột biến exon 14 bệnh nhân mã số RB57 Kết cho thấy bệnh nhân RB57 phát 02 đột biến dị hợp tử exon 14 Cả 02 đột biến dạng đột biến sai nghĩa Đột biến vị trí c.1357 A > T làm biến đổi acid amin Tyrosin vị trí 452 thành Phenylalanin, đột biến vị trí c.1366 T > A làm thay đổi acid amin Valin vị trí 455 thành Glutamat c.1033 C c.1033del CT p.Thr345ArgframeshiftX6 Người bình thường Bệnh nhân RB79 Hình Hình ảnh giải trình tự đột biến exon 14 bệnh nhân mã số RB79 Giải trình tự phát bệnh nhân RB79 có đột biến đoạn c.1033delCT làm nucleotid C T Đột biến vị trí làm thay đổi acid amin thứ 345 từ Threonin thành Arginin dẫn tới tạo mã kết thúc sớm (stop codon) sau codon IV BÀN LUẬN phát muộn, bệnh lan rộng hay di Ung thư võng mạc bênh lý di truyền căn, phải loại bỏ nhãn cầu, nạo vét hốc mắt, gặp, bệnh thường để lại nhiều biến làm thị lực đe dọa đến tính mạng chứng mắt, phần lớn trường hợp trẻ Đa phần bệnh nhân đến khám TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC muộn với tình trạng biến chứng phải khoét bỏ sai nghĩa (missense), 03 đột biến vị trí nối nhãn cầu tiên lượng tử vong cao gây hậu (splicing) Những đột biến lại nằm rải rác nặng nề cho gia đình xã hội Việc phát dọc gen RB1 tỷ lệ gặp cao exon đột biến gen RB1 sở cho việc 9, 10, 14, 17, 18, 20 23 [2; 3] Vì vậy, phát triển triển khai kỹ thuật sinh học nghiên cứu tiến hành lựa chọn phân tử phục vụ cho chẩn đoán trước sinh, ngẫu nhiên số exon có tỷ lệ gặp đồng thời quản lý tốt người mang gen đột biến cao để xác định đột biến exon 10, bệnh nhằm giảm tỷ lệ mù lòa thương tật 14, 20 trẻ Các nghiên cứu đột biến gene Tỷ lệ phát đột biến nghiên cứu tiến hành, cung cấp exon (exon 10, 14, 20) thông tin liệu cho ngân hàng gene chiếm 10,2% (5/49) tương đồng với nghiên RB1 (http://rb1-lsdb.d-lohmann.de/) công cứu Trung Quốc (8,2%, n = 85), hay nghiên bố có 900 đột biến gen RB1 sở cứu Tây Ban Nha, Colombia, Cuba (10,3%, liệu quan trọng cho tư vấn di truyền cho n =107), nhiên thấp so với nghiên cứu biết đặc điểm mối quan hệ kiểu gen Singapore năm 2017 23,7% (n = 59), có kiểu hình bệnh Gần 40% đột biến gen khác khác biệt địa RB1 tái diễn tập trung 16 điểm bao gồm lý chủng tộc [11 - 13] 12 đột biến vơ nghĩa (nonsense), 02 đột biến Hình Phân bố đột biến phát 49 bệnh nhân toàn 27 exon gen RB1 Nghiên cứu phát đột biến khả gây bệnh, đột biến đoạn c.1033delCT dẫn tới lệch tồn trình c.1033delCT đột biến tiềm gây ung tự khung sau đột biến exon 10 Đột biến thư võng mạc bệnh nhân RB79 vị trí làm thay đổi acid amin thứ 345 từ Các đột biến lại chủ yếu đột biến sai nghĩa (missense) chiếm tỷ lệ 5/6 (83,3%), Threonin thành Arginin dẫn tới tạo mã kết thúc sớm (stop codon) sau codon Đột biến điểm gây tạo mã kết thúc xảy có 03 đột biến dị hợp tử exon 14 Đột biến vị trí c.1357 A > T làm vùng N-terminal, từ khơng thể tiếp tục biến đổi acid amin Tyrosin vị trí 452 thành dịch mã tạo thành vùng có chức Phenylalanin gặp bệnh nhân, acid amin thuộc nhóm acid amin chưa gốc nhân quan trọng protein pRB Tuy chưa tiến hành thử nghiệm RNA hay invivo để xác định mức độ ảnh hưởng đột biến tới TCNCYH 115 (6) - 2018 thơm, ảnh hưởng khơng rõ cần phải kiểm chứng thêm Còn đột biến vị trí TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC c.1366 T > A làm thay đổi acid amin vị trí 455 Leucin thành Isoleucin vị trí 692 693 Valin (khơng phân cực, kỵ nước) thành Glutamat (phân cực, tích điện âm) Sự thay tương ứng đổi ảnh hưởng tới đặc tính chuỗi protein, dẫn đến khả tương tác vùng A domain protein LXCXE, giống số thay đổi tương tự cơng bố trước [11; 12] Tương tự đột biến c.2041 G > T exon 20 bệnh nhân RB29 thay làm thay đổi ba mã hóa cho acid amin Tryptophan (chứa nhân thơm) vị trí 680 trở thành ba Cystein (phân cực, khơng tích Lời cảm ơn Nghiên cứu hỗ trợ với kinh phí đề tài khoa học cấp Bộ Y tế ”Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bệnh ung thư võng mạc xác định yếu tố di truyền kỹ thuật sinh học phân tử” giúp đỡ cán Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại Học Y Hà Nội điện) đột biến exon 20 c.2077 - 2079 AAC > TTA làm thay đổi acid amin liền kề: TÀI LIỆU THAM KHẢO Glutamat (tích điện âm) thành Valin (khơng Bishop JO, Madson EC (1975) Retinoblastoma: Review of the current status Surv phân cực, kỵ nước) Leucin thành Isoleucin (cùng nhóm) vị trí 692 693 tương ứng làm thay đổi tương tác vùng B domain với protein LXCXE Tuy nhiên nghiên cứu bước đầu xác định đột biến ba exon, cần thử nghiệm sâu để xác định xác mức độ gây bệnh đột biến cần thêm nghiên cứu toàn exon lại với cỡ mẫu lớn hơn, từ mở rộng tìm đột biến thành viên gia đình bệnh nhân phát đột biến Đó điều kiện thuận lợi cho tư vấn di truyền sau V KẾT LUẬN Đã phát 5/49 (10,2%) bệnh nhân Ophthalmol, 19, 342 ‑ 66 Mallipatna A, Marino M, Singh AD (2016) Genetics of Retinoblastoma Asia Pac J Ophthalmol (Phila), 5(4), 260 - 264 Jose R.V (2005) RB1 gene mutation up -date, a meta-analysis based on 932 reported mutations available in a searchable database, BMC Genetics, 6, 53 Sugano K, Yoshida T, Izumi H et al (2004) Outpatient clinic for genetic counseling and gene testing of retinoblastoma Int J Clin Oncol 9, 25 - 30 Lohmann D.R, Brandt B, Hopping W et al (1996) The spectrum of RB1 germ-line mutations in hereditary retinoblastoma Am J Hum Genet, 58, 940 - 949 phát có đột biến Tất đột Alonso J, Frayle H, Menéndez I et al biến đột biến dị hợp đột biến chưa (2005) Indentification of 26 new constititional công bố Đặc biệt phát đột RB1 gene mutationsin Spanish, Colombian, biến c.1033delCT (p.Thr345Arg frameshift X6) and Cuban retinoblastoma patients Hum Mu- exon 10 làm thay đổi acid amin thứ 345 tat, 25, 99 từ Threonin thành Arginin dẫn tới tạo mã kết Pradhan MA, Ng Y, Strickland A et al thúc sớm (stop codon) đột biến c.20772079 AAC>TTA exon 20 làm thay đổi (2010) Role of genetic testing in retinoblastoma management at a tertiary referral centre acid amin liền kề Glutamat thành Valin Clin Experiment Ophthalmol, 38, 231 - 236 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Sampieri K, Hadjistilianou T, Mari F et al (2006) Mutational screening of the RB1 gene in Italian patients with retinoblastoma reveals 11 novel mutations J Hum Genet, 51, 209 - 216 Chinese patients with retinoblastoma and preliminary exploration of genotype– phenotype correlations Molecular Vision 20, 545 - 552 12 Alonso J, Frayle H, Menéndez I et al Rushlow D, Piovesan B, Zhang K et al (2009) Detection of mosaic RB1 mutations in (2005) Identification of 26 New Constitutional families with retinoblastoma Hum Mutat 30, 842 - 851 and Cuban Retinoblastoma Patients Hum 10 Nguyễn Ngân Hà, Phạm Trọng Văn, Phạm Thị Minh Châu cộng (2016) Dịch tễ học lâm sàng u nguyên bào võng mạc miền bắc Việt Nam (2004 - 2013) Tạp chí Nghiên cứu y học, 102(4), 129 - 136 11 Ming-yan He, Yu An, Yi-jin Gao et al (2013) Screening of RB1 gene mutations in RB1 Gene Mutations in Spanish, Colombian, Mutat, 25(1), 99 13 Swati T, Raman S, Gangadhara S et al (2017) Mutation spectrum of RB1 mutations in retinoblastoma cases from Singapore with implications for genetic management and counselling PLoS ONE 12(6), e0178776 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0178776 Summary MUTATION ANALYSIS IN KEY REGION OF RB1 GENE IN PATIENTS WITH RETINOBLASTOMA Retinoblastomas are one of the most common intraocular malignant tumors in infants and young children They are caused by a mutation in the RB1 gene that results in the loss or deactivation of the RB1 protein In developing countries like Vietnam, most cases are diagnosed in later stages that are life-threatening, requiring enucleation Detection of RB1 mutations in patients with retinoblastoma is an important for identifying healthy carriers and conducting prenatal diagnosis to reduce mortality and blindness in children Mutations in the RB1 are often point mutations and are common in some key exons including 10, 14, 20 The study was conducted with the purpose of identifying RB1 mutations on exon 10, 14, 20 This study is composed of 49 patients with retinoblastomas Mutations in exon 10, 14 and 20 of the RB1 gene were identified by direct sequencing Different mutations were found in 5/49 (10.2%) patients One patient was detected with mutation p.Trp680Cys and a second patient with p.Glu692Val_Leu693Ile mutation on exon 20 A third patient was detected with p.Tyr452Phe mutation on exon 14 and a fourth patient was detected with mutations: p.Tyr452Phe and p.Val455Glu on exon 14 The fifth patient was detected with mutant p.Thr345Arg frameshift X6 on exon 10 All mutations were mutant heterologous These findings are novel and have not been reported in prior publications Keywords: Retinoblastoma, RB1 gene, mutation TCNCYH 115 (6) - 2018 ... (10,2%) bệnh nhân phát đột biến, bệnh nhân phát đột biến p.Trp680Cys bệnh nhân phát đột biến p.Glu692Val_Leu693Ile exon 20, bệnh nhân phát đột biến p.Tyr452Phe exon 14 bệnh nhân khác phát đột biến. .. 27 exon gen RB1 Nghiên cứu phát đột biến khả gây bệnh, đột biến đoạn c.1033delCT dẫn tới lệch tồn trình c.1033delCT đột biến tiềm gây ung tự khung sau đột biến exon 10 Đột biến thư võng mạc bệnh. .. p.Val455Glu exon 14 Bệnh nhân lại phát đột biến p.Thr345Arg frameshift X6 exon 10 Bảng Kết xác định đột biến exon 10, 14, 20 gen RB1 Mã Đột biến Thay đổi protein Thể đột biến Exon Loại đột biến Chú