Bài viết xác định đột biến lặp đoạn thông qua các bệnh nhân đã được lọc bằng kỹ thuật Multiplex PCR và trình bày các kết quả đã nghiên cứu được. Để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN LẶP ĐOẠN GEN DYSTROPHIN BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX LIGATION - DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION Phạm Lê Anh Tuấn, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn, Trần Vân Khánh Trư ng h YH N t g t nn nt Pr t n( h n t n n ng n tr h n h Ngh n n t n h nh ụ t h th n nh nh n h n nh th t t PC ( PC ) Ch ng t h th n n n n 51 nh nh n t n nh t n ng n tr h n tr n nh nh n P ) nh nh t n t n n th n t h nh ng ụng n ng h nn r( ng n tr h n ụng th t P n nh nh n n ng nh nh n t n n nh nh n n 14 - th t P th ng ụng h t ) ng t Từ khóa: Đột biến lặp đoạn, gen dystrophin, MLPA I ĐẶT VẤN ĐỀ Kỹ thuật Multiplex Ligation - dependent Probe Amplification (MLPA) hay kỹ thuật khuếch đại đầu dò đa mồi dựa vào phản ứng nối - biến thể phản ứng PCR đa mồi (Multiplex Polymerase Chain Reaction) cho phép khuếch đại nhiều đích với cặp mồi [1, 2] Mỗi đầu dò bao gồm hai oligonucleotide, đoạn chứa trình tự mồi cho phản ứng PCR trình tự bổ sung với trình tự đích (được gọi trình tự lai) Khi đầu dò lai xác vào trình tự đích, chúng nối lại enzym ligase bền nhiệt Phản ứng PCR khuếch đại đầu dò nối lại hồn chỉnh Vì đầu dò đánh dấu huỳnh quang có kích thước riêng biệt, nên thu tín hiệu đầu dò phân tách xác định hệ thống điện di mao quản Kỹ thuật MLPA định lượng số nhiều trình tự gen với suất lên tới 40 trình tự đích phản ứng [3; 4] MLPA kỹ thuật có độ xác cao ứng dụng để phát đột biến xóa đoạn lặp đoạn gen dystrophin cho bệnh nhân DMD/BMD Tuy nhiên, giá thành cao so với số kỹ thuật thông thường khác Nghiên cứu lựa chọn bệnh nhân xác định đột biến xóa đoạn kỹ thuật mPCR xác định đột biến lặp đoạn gen dystrophin kỹ thuật MLPA Gen dystrophin có chiều dài 3000 Kb nằm NST X, mã hóa 14 - kb h n h T Th nh n YH N t th nh n h n Ng nh n 2014 Ng h th n 11 2014 h nH nh trư ng mRNA, bao gồm 79 exon; quy định tổng hợp protein dystrophin, protein nằm màng tế bào cơ, có vai trò quan trọng việc bảo vệ hoạt động Đột biến gen dystrophin nguyên nhân gây bệnh DMD toàn vẹn protein dystrophin dẫn đến tế bào bị tổn thương DMD/BMD bệnh lý di truyền thường gặp có tần suất mắc bệnh vào khoảng 1/3.500 trẻ trai, biểu lâm sàng nặng với triệu chứng yếu mang tính chất tuần tiến, trẻ bị teo cơ, khả lại chết trước tuổi trưởng thành suy tim rối loạn hô hấp Đột biến tạo mã kết thúc sớm gây lệch khung dịch mã gây nên thể nặng DMD đột biến khơng gây lệnh khung dịch mã gây nên thể nhẹ BMD Xác định đột biến gen dystrophin có vai trò quan trọng tư vấn di truyền chẩn đoán trước sinh, đặc biệt giúp cho liệu pháp điều trị gen [5; 6] Có nhiều dạng đột biến gen dystrophin bao gồm đột biến xóa đoạn chiếm 50 - 65%, đột biến điểm 20 - 25% đột biến lặp đoạn chiếm - 10% [6] Nghiên cứu tiến hành với mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật MLPA xác định đột biến lặp đoạn gen dystrophin bệnh nhân loạn dưỡng Duchenne / Becker II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng 30 bệnh nhân chẩn đoán DMD/BMD dựa vào dấu hiệu lâm sàng cận lâm sàng điển hình Bệnh nhân có dấu hiệu yếu cơ, lại hay vấp ngã, phì đại cẳng chân, dấu hiệu Gower dương tính Xét nghiệm enzym Creatine Kinase (CK) tăng cao (bình thường 200 UI/l) Bệnh nhân sàng lọc không mang đột biến xóa đoạn gen dystrophin kỹ 19 TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 thuật mPCR [7] 02 người bình thường lựa chọn làm mẫu đối chứng kèm với mẫu bệnh nhân phản ứng MLPA Phương pháp 2.1 Quy trình lấy mẫu: Bệnh nhân lấy 2ml máu tĩnh mạch chống đơng EDTA Quy trình đảm bảo tuyệt đối vơ trùng 2.2 Quy trình tách chiết DNA tổng số: Quy trình tách chiết DNA tổng số tiến hành theo quy trình phenol/chloroform [7] Nồng độ độ tinh DNA kiểm tra nhờ phương pháp quang phổ (OD 260 / 280) 2.3 Quy trình MLPA xác định đột biến lặp đoạn Nguyên lý: Sử dụng 79 đầu dò (probe) DNA lai đặc hiệu với 79 exon gen dystrophin Mỗi probe gồm hai chuỗi oligonucleotide, chuỗi ngắn chuỗi dài Mỗi chuỗi có trình tự quan trọng: - Vị trí liên kết đặc hiệu liền kề trình tự exon đích tương ứng, tạo điều kiện cho enzym ligase gắn chuỗi lại thành probe hồn chỉnh Nếu có đột biến lặp đoạn mẫu DNA - Vị trí gắn mồi phản ứng PCR khuếch đại probe, có trình tự giống hệt nhau, nên cần cặp mồi để khuếch đại tất probe Quy trình: Sử dụng kit MLPA P034 - A3 P035 - A3 MRC - Holland.Chuẩn bị mẫu DNA, đưa nồng độ 30ng/µl.Biến tính DNA; Cho vào ống 0,2ml; 2µl DNA + µl DW; Biến tính 98°C phút, giữ 25°C Lai đầu dò: Thêm 1,5µl MLPA buffer + 1,5 µl ProbeMix (P034/P035) vào ống mẫu Để 95°C phút, sau giữ 60°C 16 Phản ứng nối: Giữ 54°C Thêm vào: µl Ligase - 65 buffer A + µl Ligase - 65 buffer B + µl Ligase - 65 + 25 µl DW Để 54°C 15 phút, sau 98°C phút giữ 15°C Phản ứng PCR: Thêm vào: 7,5 µl DW + µl Cy5 Primer Mix + 0,5 µl Salsa Polymerase Chạy chu trình nhiệt : 35 x [95°C/30 giây - 60°C/30 giây - 72°C/60 giây] - 72°C/20 phút – Giữ 15°C [4] Chạy máy Beckman Coulter CEQ600, phân tích phần mềm GeneMarker Tính tốn theo cơng thức: RPA(Relative Peak Area) = [As/ ΣAs] / [Ac/ΣAc] X ≥ 1.5: đột biến lặp đoạn Đạo đức nghiên cứu Bệnh nhân người nhà hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu Bệnh nhân hồn tồn có quyền rút lui khỏi nghiên cứu không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu Bệnh nhân người nhà bệnh nhân thông báo kết xét nghiệm gen để giúp cho bác sỹ tư vấn di truyền lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp Các thông tin cá nhân đảm bảo bí mật III KẾT QUẢ Kết xác định đột biến lặp đoạn gen kỹ thuật MLPA 30 bệnh nhân DMD/BMD tiến hành xác định đột biến lặp đoạn gen dystrophin, kết phát 2/30 bệnh nhân có đột biến lặp đoạn gen dystrophin Hình Kết phân tích đột biến lặp đoạn gen dystrophin bệnh nhân MS12 kỹ thuật MLPA (mũi tên exon đột biến) A: Kết đột biến lặp đoạn exon 14 - 17 B: Tỉ lệ RPA exon bệnh nhân MS 12 so với mẫu chứng nam 20 TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 Tỉ lệ RPA exon 14 - 17 ≥ 1,5, tỷ lệ RPA exon lại tương ứng với 1, chứng tỏ bệnh nhân có đột biến lặp đoạn exon 14 - 17 gen dystrophin Hình Kết phân tích đột biến lặp đoạn gen dystrophin bệnh nhân MS 21 kỹ thuật MLPA ( t n h n t n) A: Kết đột biến lặp đoạn exon 5-7 B: Tỉ lệ RPA exon bệnh nhân MS 21 so với mẫu chứng nam Tỷ lệ RPA exon - ≥ 1,5, tỷ lệ RPA exon lại tương ứng với 1, chứng tỏ bệnh nhân có đột biến lặp đoạn exon - gen dystrophin Tỷ lệ đột biến lặp đoạn gen dystrophin Bảng Tỷ lệ đột biến lặp đoạn gen dystrophin STT Bệnh nhân Đột biến n Bệnh nhân 12 Lặp đoạn Exon 14-17 Bệnh nhân 21 Lặp đoạn Exon 5-7 Tổng Bệnh nhân có đột biến lặp đoạn 2/30 Bệnh nhân khơng có đột biến lặp đoạn 28/30 30 2/30 bệnh nhân có đột biến lặp đoạn gen dystrophin chiếm tỷ lệ khoảng 6,5% IV BÀN LUẬN Loạn dưỡng Duchenne bệnh lý di truyền phổ biến nhất, đột biến gen dystrophin chứng minh in vitro làm giảm chức protein dystrophin - protein quan trọng trình co cơ, từ gây bệnh loạn dưỡng Duchenne Kỹ thuật MLPA kỹ thuật có độ xác cao ứng dụng để phát đột biến xóa đoạn lặp đoạn gen dystrophin cho bệnh nhân DMD/BMD Tuy nhiên, kỹ thuật giá thành cao so với số kỹ thuật thông thường khác Để giảm giá thành, chúng 21 TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 lựa chọn bệnh nhân xác định đột biến xóa đoạn kỹ thuật mPCR, kỹ thuật rẻ so với kỹ thuật MLPA, bệnh nhân khơng có đột biến xóa đoạn lựa chọn để xác định đột biến lặp đoạn Đột biến lặp đoạn gen dystrophin chiếm tỷ lệ từ - 10% [3; 4; 6] Tuy nhiên, đột biến lặp đoạn không xác định kỹ thuật sinh học phân tử thông thường (PCR, giải trình tự gen…) Nhóm nghiên cứu áp dụng kỹ thuật MLPA để giải khó khăn Kỹ thuật MLPA kỹ thuật sinh học phân tử mới, có độ nhạy độ xác cao, tiết kiệm thời gian, đặc biệt gen dài 79 exon gen dystrophin [1; 2; 3; 4; 5] Kỹ thuật MLPA có độ tin cậy cao nhờ mồi nội chuẩn thiết kế sẵn để kiểm tra chất lượng mẫu, có độ đặc hiệu cao nhờ thiết kế đầu dò hai đầu hai trình tự đặc biệt, khuếch đại dựa vào phản ứng nối Kết nghiên cứu cho thấy ưu điểm phương pháp MLPA phân tích đột biến lặp đoạn nhanh chóng, xác, giúp ứng dụng chẩn đoán trước sinh bệnh DMD bệnh di truyền, làm rút ngắn thời gian công sức [8] Trong nghiên cứu này, 30 bệnh nhân chẩn đoán mắc bệnh DMD/BMD sàng lọc khơng mang đột biến xóa đoạn kỹ thuật mPCR 2/30 bệnh nhân (6,7%) xác định mang đột biến lặp đoạn gen dystrophin kết này, tương đồng với nghiên cứu khác Việt Nam giới [4; 5; 6] Tuy cỡ mẫu chưa lớn, nghiên cứu áp dụng kỹ thuật MLPA vào xác định đột biến lặp đoạn gen dystrophin Việt Nam V KẾT LUẬN Sử dụng kỹ thuật MLPA, nghiên cứu xác định đột biến lặp đoạn gen dystrophin 2/30 bệnh nhân chẩn đoán xác định DMD/BMD Lời cảm ơn Nghiên cứu thực với hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp nhà nước KC.04.08/11-15 “Nghiên cứu xây dựng quy trình điều trị gen cho bệnh loạn dưỡng Duchenne” thực từ năm 2013 - 2015 TÀI LIỆU THAM KHẢO Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R et al (2002) Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification N 30 (12) Murugan S, Chandramohan A, Lakshmi BR (2010) Use of multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) for Duchenne muscular dystrophy (DMD) gene mutation analysis n n 132, 303 - 311 Kent K.S Lai, Ivan F.M Lo et al, (2006).Detecting exon deletions and duplications of the DMD gene using Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) C n h tr 39, 367 – 72 Marzese D.M., Mampel A., Gomez L.C., (2008) Detection of deletions and duplications in the Duchenne muscular dystrophy gene by the molecular method MLPA in the first Argentine affected families n t n r r h 7, 223 - 233 Mendell R.J., Griggs C.R (1991) Muscular dystrophin H rr n r n nt rn n 12th edition, 2112 - 2118 Takeshima Y, Yagi M, Okizuka Y et al (2010) Mutation spectrum of the dystrophin gene in 442 Duchenne/ Becker muscular dystrophy cases from one Japanese referral center H n t 55(6), 379 - 388 Van Khanh Tran, Van Thanh Ta, Dung Chi Vu, et al (2013) Exon Deletion Patterns of the Dystrophin Gene in 82 Vietnamese Duchenne/Becker Muscular Dystrophy Patients N r g n t 27(4), 170 - 175 Minh-Hieu Ta, Thinh Huy Tran, Ngoc-Hai Do, et al (2013) Rapid method for targeted prenatal diagnosis of Duchenne muscular dystrophy in Vietnam.T n rn t tr n g 52, 534 - 539 Summary MULTIPLEX LIGATION - DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION FOR DETECTION OF DUPLICATION IN DYSTROPHIN GENE The multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) assay is the most powerful tool in screening for deletions and duplications in the dystrophin gene in patients with Duchenne and Becker muscular dystrophy (DMD/ BMD) The purpose of this study is to detect duplication in dystrophin gene using MLPA technique 30 unrelated male patients with DMD/BMD were selected for this study These patients had already been screened by multiplex PCR 22 TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 (mPCR) We detected two duplications that had been missed by mPCR, in one DMD patient showing a duplication from exon 5-7 and other one showing a duplication from exon 14-17 The results of our study confirmed MLPA to be the method of choice for detecting DMD duplication in DMD/BMD patients Keywords: Duplication, dystrophin gene, MLPA 23 ... (5) - 2014 lựa chọn bệnh nhân xác định đột biến xóa đoạn kỹ thuật mPCR, kỹ thuật rẻ so với kỹ thuật MLPA, bệnh nhân khơng có đột biến xóa đoạn lựa chọn để xác định đột biến lặp đoạn Đột biến lặp. .. tiến hành xác định đột biến lặp đoạn gen dystrophin, kết phát 2/30 bệnh nhân có đột biến lặp đoạn gen dystrophin Hình Kết phân tích đột biến lặp đoạn gen dystrophin bệnh nhân MS12 kỹ thuật MLPA... dụng kỹ thuật MLPA vào xác định đột biến lặp đoạn gen dystrophin Việt Nam V KẾT LUẬN Sử dụng kỹ thuật MLPA, nghiên cứu xác định đột biến lặp đoạn gen dystrophin 2/30 bệnh nhân chẩn đoán xác định